KR20200034663A - 세포 배양을 위한 하이드로겔 및 생체의학 적용 - Google Patents
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Abstract
2D 코팅 배양, 3D 세포 배양 및 주입을 포함한, 세포 배양 및 생체의학 적용을 위한 젤란 검 하이드로겔의 제조 및 적용이 본원에 기재된다. 이러한 적용을 위한 젤란 검 물질은 수용성 저 아실 젤란 검, 고 아실 젤란 검, 변형된 젤란 검 및 젤란 검 혼합물과 다른 화학적/생물학적 분자의 혼합물을 포함한다.
Description
우선권 주장
본 출원은 2017년 4월 10일자 미국 출원 제62/483,831호를 우선권 주장하며, 그의 내용은 전문이 참조로 본원에 완전히 포함된다.
실시양태의 분야
본 발명의 실시양태의 분야는 세포 배양을 위한 하이드로겔의 용도 및 다양한 다른 생체의학 적용에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명의 실시양태는 세포 배양을 위한 젤란 검 하이드로겔의 제조 및 적용, 및 2D 코팅 배양, 3D 세포 배양 및 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는 생체의학 적용에 관한 것이다.
많은 상이한 상호작용 세포 유형의 생물학적 시스템의 복합 거동을 예측하고 유익하거나 유용한 연구를 위한 조직의 해부학 또는 생리학을 재현하는 2D 세포 배양의 능력 부족에 대한 사람들의 인식이 점점 증가하고 있다. 3D 세포 배양 모델은 살아있는 유기체에서 세포에 의해 경험한 자연 환경을 보다 정확하게 제시하며, 이는 보다 현실적인 생화학적 및 생리학적 반응과의 세포간 상호작용을 허용한다. 3D 세포 배양에서, 세포는 온도, pH, 영양소 흡수, 운반, 및 분화의 변화와 같은 내부 및 외부 자극에 대해 생체내에서처럼 행동하고 반응한다. 따라서, 과학자들은 약물 스크리닝, 조직 공학, 전임상 연구, 세포 요법, 및 기본 세포 생물학 연구 분야에서 2D에서 3D 세포 배양으로 초점을 이동하고 있다.
생체내 세포 성장 조건을 모방하기 위해, 3D 스캐폴드의 망상 구조를 시리즈화해야 하고, 높은 물 함량을 가져야 하며, 정확한 3D 공간 지지, 적합한 기계적 강도, 및 산소, 영양소, 폐기물, 및 용해성 인자의 용이한 운반과 같은 다수의 다른 바람직한 특징을 가져야 한다. 세포가 세포 캡슐화 및 단리 동안 편안하게 생존하는 것을 보장하기 위해 졸-겔 형질변환을 위한 온화하고 세포호환성인 조건이 바람직하다. 더욱이, 3D 세포 배양에 사용된 생체물질의 주입가능한 특성은 암 요법(신약 개발을 위한 제로그래피 연구), 조직 재생, 및 3D 바이오프린팅과 같은 하류 적용에 중요하다.
현재 시판되고 있는 3D 세포 배양을 위한 물질은 하이드로겔, 중합체 매트릭스, 현적 플레이트, 저점착 플레이트, 미세패턴 표면, 및 자기 부상으로 분류될 수 있다. 하이드로겔 스캐폴드는 현재까지 3D 세포 배양을 용이하게 하는 가장 유망한 접근법으로 입증되었다. 그러나, 3D 세포 배양을 위한 대부분의 기존 생체물질(하이드로겔 스캐폴드 포함)은 생리학적 조건(예를 들어 불량한 스캐폴드 구조, 원치않은 성장 인자, 예비-겔 용액의 바람직하지 않은 pH 또는 온도), 세포 캡슐화에 대한 복잡한 작동 단계, 배양 스캐폴드로부터 세포 단리에 대한 어려움, 및 생성물 재현가능성으로 제한된다. 또한, 현재 시판중인 하이드로겔 물질에서 전단 박하 및 물리적 강도의 신속한 회복과 같은 주입가능한 특성은 매우 드물다. 이러한 결점은 이들 3D 세포 배양 기술로부터 생성된 데이터에 영향을 미칠 뿐만 아니라 하류 분석 및 임상 적용을 위한 이러한 기술의 적용도 제한한다. 관련 분야의 예는 하기에 기재되어 있다:
미국 특허 출원 제2008/0220526호는 세포 배양 표면용 코팅에 관한 것이다. 보다 특히, 이 발명은 자연 발생 검, 식물 검, 갈락토만난 검 또는 그의 유도체를 포함한 검으로부터 유래되거나 또는 이를 함유하는 세포 배양 표면용 코팅에 관한 것이다. 이 발명은 또한 이러한 코팅을 갖는 제조품(예를 들어, 세포 배양 용기 및 실험용품), 세포 배양 표면에 이들 코팅을 적용하는 방법, 및 코팅된 세포 배양 용기를 사용하는 방법에 관한 것이다.
미국 특허 제9,579,417호는 부착 세포를 포획/캡슐화할 수 있는 세포-접착성 젤란 검 스펀지-유사 하이드로겔에 관한 것이며, 이는 물질 내에서 확산되어 그의 표현형을 유지하고 생존가능하고 증식가능하게 남아있다. 이들 물질을 수득하는데 사용된 방법론은 하이드로겔 제조, 동결, 동결-건조 및 세포가 있고 생체활성 분자가 있거나 없는 식염수로의 재수화를 수반한다. 다른 하이드로겔에 사용되는 세포 접착성 특성을 갖는 스펀지-유사 하이드로겔의 사전 및/또는 사후 기능화는 사용되지 않았다. 하이드로겔에서 관찰되지 않은 이들 물질의 세포 접착성 특징은 스펀지와 하이드로겔 사이에서 전구체 하이드로겔과는 다른 물리적 특성에 의해 부분적으로 설명된다. 주로 상이한 물리적 특성은 형태, 미세구조, 물 함량 및 기계적 성능이다. 젤란 검 스펀지-유사 하이드로겔 물리적 특성 및 생물학적 성능은 스펀지-유사 하이드로겔 형성에 수반된 파라미터를 조작함으로써 조정될 수 있다. 생체활성 분자는 또한 세포가 있거나 없이 포획되어 스펀지-유사 하이드로겔의 생물학적 성능을 변형시킬 수 있다. 이들 물질은 생명공학, 조직 공학, 재생 의학 및 생체의학 적용의 맥락에서 적용될 수 있다.
중국 특허 출원 제106474560호는 생물학적 물질의 기술 분야에 관한 것이며, 하이드로겔 물질의 3D 생물학적 프린팅 및 그의 제조 방법 및 적용을 개시하고 있다. 이 발명의 하이드로겔 물질은 하기 질량 백분율 성분 및/또는 그의 유도체를 포함하여 0.5 - 10%를 형성한다: PEG 및 그의 유도체 0.1 - 20%, 가교 개시제 0 - 1%, 생물학적 활성 성분 0 - 15%, 나머지 용매. 이 발명은 하이드로겔 물질 및 PEG 이중-네트워크 하이드로겔, 상호침투 이중-네트워크 구조를 형성하는 생리학적 환경 형태에 기초하고, 보다 우수한 구조 및 크기 안정성을 가지며, 생리학적 조건 하에 우수한 생체적합성, 작은 면역거부반응, 높은 세포 캡슐화율, 제어가능한 기계적 강도, 생분해성 등을 갖는 세포를 빠르게 겔로 만든다. 또한 생물학적 프린팅에서 3D에 적용되면, 느린 경화 속도를 극복하고, 경화 조건이 가혹하고, 기계직 특성이 제한되고, 세포 호환성이 불량하며, 명백한 장점 및 우수한 산업화 전망이 있다.
PCT 특허 출원 제WO2014025312호는 하이드로겔 미세입자 위에 부착되고/되거나 그 안에 캡술화된 1종 이상의 살아있는 세포를 제공하는 것을 포함하는, 하이드로겔 미세입자를 제조하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 하이드로겔-형성제를 수성 매질에 용해시켜 용액을 형성하는 단계; 1종 이상의 살아있는 세포를 용액에 현탁시켜 세포 현탁액을 형성하는 단계; 세포 현탁액을 유기 오일 내로 분산시켜 마이크로에멀젼을 형성하는 단계; 및 상기 마이크로에멀젼을 하이드로겔-형성제를 허용하는 조건에 적용시켜 1종 이상의 살아있는 세포가 위에 부착되고/되거나 안에 캡슐화된 것을 포함하는 하이드로겔 미세입자를 형성하는 단계를 포함한다. 분해성 하이드로겔 및 1종 이상의 살아있는 세포를 갖는 하나 이상의 하이드로겔 미세입자의 혼합물을 포함하는 조성물, 및 조직 공학용 스캐폴드를 제조하는 방법이 또한 제공된다.
PCT 특허 출원 제2014017513호는 세포 및/또는 조직을 배양하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 세포 및/또는 조직을 부유 상태로 배양 배지 조성물을 사용하여 배양하는 것을 특징으로 하며, 여기서 비정질 구조는 액체 배양 배지에서 형성되고, 용액에 균일하게 분산되고, 용액의 점도를 실질적으로 증가시키지 않으면서 세포 및/또는 조직을 실질적으로 유지하여, 배양 배지 조성물이 구조 및 다른 것의 침강을 방지하는 효과를 갖도록 한다. 상기 기재된 어떠한 관련기술도 본 발명의 실시양태에 의해 다뤄진 모든 문제를 다루지 않는다. 2D 코팅 배양, 3D 세포 배양 및 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 세포 배양 및 다양한 생체의학 적용에 적합한 젤란 검 하이드로겔 시스템을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 발견하기 위한 미충족된 요구가 분명히 존재한다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 하나 이상의 수용성 고 아실 젤란 검 중합체; 하나 이상의 수용성 저 아실 젤란 검 중합체; 및 하나 이상의 수용성 화학적으로 변형된 젤란 검 중합체를 갖는 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 있다.
하나 이상의 실시양태에서, 나트륨 시트레이트는 젤란 검 중합체 용액에 첨가되고, 젤란 검 중합체 용액의 pH는 중성 pH (대략 6-8의 pH)로 조정된다.
하나 이상의 실시양태에서, 젤란 검의 건조 분말은 1) 2-프로판올의 첨가 및 밤새 건조; 또는 2) 동결-건조에 의해 제조된다.
하나 이상의 실시양태에서, 젤란 검은 실온에서 물 또는 수용액에 용해된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 형성된 폴리사카라이드 하이드로겔은 주입용으로 적합한 연질 겔이고, 이에 생체활성 분자가 추가로 첨가되고, 하이드로겔 내에서 캡술화되고 상이한 사용 위치에 전달될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 연질 겔은 폴리사카라이드 하이드로겔이 전단력에 의해 액체 상태로 전환되거나, 또는 전단력이 중단되면 그의 하이드로겔 상태를 회복하는 것을 허용함으로써 전단 박하 및 자기-회복 유동학 특성을 나타내고, 또한 겔-졸 상태는 다수회 변형될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 전단력은 피펫팅, 주사기 주입 또는 펌프 관류에 의해 가해진다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 형성된 폴리사카라이드 하이드로겔은 경질 겔이고, 이에 생체활성 분자가 추가로 첨가되고 하이드로겔 내에서 캡슐화될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 경질 겔은 유동학 특성을 갖는 3-D 겔 구조를 나타내어 경질 겔이 피펫팅 또는 주입(전단)에 의해 파괴될 때, 작은 겔 입자로 부서지고 생체활성 분자에 대한 친화성을 갖고 그에 의해 변형될 수 있도록 한다.
상기 실시양태의 또 다른 측면에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 하이드로겔은 약 10 Pa 초과의 저장 모듈러스 값을 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 경질 하이드로겔은 그의 겔 형성을 약 80℃ 이하의 온도에서 온전하게 유지할 수 있지만, 외력으로 흐트러뜨릴 때 작은 겔 입자로 부서질 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 화학 분자는 a) 천연 또는 합성 기원의 중합체, 화학적으로 변형된 또는 공중합체, 폴리펩티드, 히알루로네이트, 키토산, 콜라겐, 폴리에틸렌글리콜 항응고제, 조영제, 화학치료제, 및 신호전달 경로 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 분자; 및 b) 생체활성 유리, 하이드록시아파타이트, 칼슘 포스페이트 및 철로 이루어진 군으로부터 선택된 무기 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 젤란 검 용액 내에 첨가될 수 있는 하나 이상의 생체활성 분자는 세포, 펩티드, 단백질, 지질, 폴리사카라이드, 성장 인자, 성장 호르몬, 항체, 효소, 세포 수용체, 세포 리간드, 항생제, 항균제, 항진균제, 항곰팡이제, RGD, IKVAV, REDV, YIGSRY, 폴리 리신을 포함하는 NH2, COOH 및 CONH2 기를 갖는 기능성 펩티드 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 펩티드를 젤란 검 용액 내에 혼합물로서 첨가하고 이어서 약 100℃ 이상의 온도 및 약 1 내지 약 40 psi, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 30 psi의 압력으로, 약 3 내지 약 30분, 보다 바람직하게는 약 5 내지 약 20분의 기간 동안 가열함으로써 생체활성-분자-변형된(예컨대 펩티드-변형된) 젤란 검 용액을 제조하는 방법이 제공된다. 이러한 생체활성-분자-변형된 젤란 검 용액은 세포 배양 배지와 혼합됨으로써 폴리사카라이드 하이드로겔을 형성하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 연질 겔은 여분의 포스페이트 완충액, 세포 배양 배지 또는 이온성 용액의 수용액, 또는 그의 조합에 침지되거나 또는 그와 함께 첨가됨으로써 경질 겔로 전환된다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 생체활성 분자는 그의 생체활성을 유지하면서 폴리사카라이드 하이드로겔 시스템과 접촉하거나, 그에 부착되거나, 현탁되거나, 매립되거나 또는 포획된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 생체활성 분자는 그의 생체활성을 유지하면서 폴리사카라이드 하이드로겔에 현탁되거나 또는 포획된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 경질 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 생체활성 분자는 그의 생체활성을 유지하면서 폴리사카라이드 하이드로겔 시스템과 접촉하거나, 그에 부착되거나, 현탁되거나, 매립되거나 또는 포획된다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 경질 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 생체활성 분자는 그의 생체활성을 유지하면서 폴리사카라이드 하이드로겔에 현탁되거나 또는 포획된다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 하나 이상의 저 아실 젤란 검 중합체는 반복 당 약 1 내지 4개의 글리세레이트 및 2회 반복마다 1 내지 4개의 아세테이트로부터 아실화 정도를 갖는다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 약 0.001% 내지 약 20%의 하나 이상의 고 아실 젤란 검 중합체, 약 0.001% 내지 약 20%의 하나 이상의 저 아실 젤란 검 중합체, 약 0.001% 내지 약 20%의 하나 이상의 변형된 젤란 검 중합체를 포함하고, 약 0.00001% 내지 약 30%의 하나 이상의 생체활성 분자를 추가로 포함한다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제공하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 약 10 Pa 초과의 저장 모듈러스 값을 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 경질 하이드로겔 시스템은 그의 겔 형성을 약 100℃ 이하의 온도에서 유지할 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 약 0.01% 내지 약 5%의 하나 이상의 고 아실 젤란 검 중합체, 약 0.01% 내지 약 5%의 하나 이상의 저 아실 젤란 검 중합체, 약 0.01% 내지 약 5%의 하나 이상의 변형된 젤란 검 중합체를 포함하고, 약 0.001% 내지 약 10%의 하나 이상의 생체활성 분자를 추가로 포함한다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 조성물은 10 내지 20000 Pa의 저장 모듈러스 값을 갖는다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 경질 하이드로겔 시스템은 그의 하이드로겔 형성을 약 80℃ 이하의 온도에서 유지할 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 하기 단계를 포함하는 폴리사카라이드 하이드로겔을 형성하는 방법이 제공된다: 수용성 젤란 검 중합체를 약 4℃ 내지 약 80℃의 온도에서 0.001 % w/v 초과의 고체 함량을 갖는 수계 용매에 용해시키는 단계; 상기 용액을 약 100℃ 이상의 온도 및 약 1-10 psi 이상의 압력에서 3분 이상 동안 가열하는 단계; 포스페이트 완충 용액(PBS), 세포 배양 배지 또는 이온성 용*을 직접 혼합하여 하이드로겔 시스템으로 변형되도록 촉발시킴으로써 약 4℃ 내지 약 50℃의 온도에서 망상화하며, 여기서 시스템의 저장 모듈러스(G')는 혼합 시 증가하고 30분 이내에 10 Pa를 초과하여, 상기 시스템이 3D 성장을 위해 그의 하이드로겔 매트릭스 내에서 현탁된 생체활성 분자를 유지할 수 있도록 하는, 단계; 및 화학물질 또는 생체활성 분자를 첨가하여 이들이 형성된 폴리사카라이드 하이드로겔과 접촉하거나, 그에 부착되거나, 현탁되거나, 매립되거나 또는 포획될 수 있도록 하는 단계.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 형성하는 방법이 제공되며, 여기서 수계 용매는 물, 포스페이트 완충 용액(PBS), 식염수, 세포 배양 배지, 이온성 용액, 알부민, 혈청 및 크실로글루칸을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 폴리사카라이드 하이드로겔을 형성하는 방법이 제공되며, 여기서 고체 함량은 약 0.001%(w/v) 내지 50%(w/v)의 양으로 사용된다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 연질 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 형성된 연질 겔 시스템은 10 mg/L 이상의 이온 농도의 추가 촉발 용액을 연질 하이드로겔 시스템에 첨가함으로써 경질 겔 시스팀으로 전환된다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 연질 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 형성된 연질 겔은 세포 배양 배지 또는 이온성 용액의 수용액에 침지됨으로써 경질 겔 시스템으로 전환된다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기 언급된 전환 방법을 사용함으로써 경질 하이드로겔로 전환된, 연질 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물이 제공되며, 여기서 생체활성 분자는 젤란 검 용액 또는 촉발 용액과 혼합됨으로써, 하이드로겔 형성 전 또는 후, 또는 하이드로겔과 주위 매질의 교환 전 또는 후 하이드로겔 시스템 내로 첨가될 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 세포 생존력 검정, 라이브/데드 검정, 고처리량 스크리닝, 형광 염색 및 영상화, 조직학적 분석, 및 3D 바이오프린팅을 포함한, 신약 개발 및 생체의학 적용을 위한 다목적 플랫폼으로서 상기 언급된 조성물로부터 유래된 폴리사카라이드 하이드로겔의 용도가 제공된다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기 언급된 조성물로부터 유래된 폴리사카라이드 하이드로겔의 용도가 제공되며, 여기서 살아있는 세포는 하이드로겔 위에서 성장되거나, 그에 매립되거나 캡슐화되고, 하이드로겔을 파괴하고 하이드로겔을 탈이온수 또는 저 이온 농도 용액으로 용해시킴으로써 하이드로겔 시스템으로부터 수확된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 상기 언급된 조성물로부터 유래된 폴리사카라이드 하이드로겔의 용도가 제공되며, 여기서 하기를 포함하는, 하이드로겔에서 시험관내 3D 세포 배양을 위한 편리한 2-단계 절차가 제공된다: 1) 살아있는 세포는 하이드로겔 형성 전에 폴리사카라이드 용액 또는 세포 배양 배지와 같은 촉발 용액과 혼합될 수 있다. 세포는 연질 하이드로겔에 균일하게 현탁되고 피펫팅 또는 주입에 의해 개별 세포 배양 플레이트 또는 상이한 용기로 옮길 준비가 되고; 2) 연질 겔(세포 함유)이 최종 용기에 배치되면, 여분의 촉발 용액은 연질 겔 위 또는 주위에 첨가되어 경질 하이드로겔로 전환될 수 있으며; 여기서 3D 매트릭스 구조는 추가로 안정화되고, 영양소 및 다른 생체분자는 하이드로겔 시스템 내로 첨가되어 하이드로겔과 주위 매질 사이에서 교환될 수 있다.
본 발명의 또 다른 추가 실시양태에서, 2D 하이드로겔 코팅 세포 배양을 위한 상기 언급된 조성물로부터 유래된 폴리사카라이드 하이드로겔의 용도가 제공되며, 여기서 연질 하이드로겔은 배양 플레이트의 표면에 직접 첨가되어 세포 배양 플레이트를 코팅하고, 이어서 살아있는 세포는 하이드로겔 위에 첨가하여 2D에서 성장할 수 있고, 일부 세포는 위에서 하이드로겔 내로 침투하여 3D 구조로 성장할 수 있다.
본 발명의 목적은 2D 코팅 배양, 3D 세포 배양 및 주입을 포함하나 이에 제한되지는 않는, 세포 배양 및 다양한 생체의학 적용에 적합한 젤란 검 하이드로겔 시스템을 제조하기 위한 조성물 및 방법을 제공하는 것이다. 이러한 적용을 위한 젤란 검 물질은 수용성 저 아실 젤란 검, 고 아실 젤란 검, 변형된 젤란 검 및 젤란 검 혼합물과 다른 화학적/생물학적 분자의 혼합물을 포함한다. 생체분자는 하이드로겔 형성 및 하이드로겔과 주위 매질의 교환 전 또는 후 하이드로겔 시스템 내로 첨가될 수 있다. 세포는 젤란 검 용액 또는 촉발 용액을 혼합함으로써 하이드로겔 형성 전 또는 동안 하이드로겔 시스템 내로 첨가될 수 있다. 세포는 하이드로겔 위에서 성장하거나 또는 세포 콜로니와 같은 3D 구조로 성장하도록 캡슐화될 수 있다. 세포는 하이드로겔을 파괴하고 하이드로겔을 탈이온수 또는 저 이온 농도 용액으로 용해시킴으로써 하이드로겔로부터 수확될 수 있다. 이러한 하이드로겔 시스템은 신약 개발, 3D 바이오프린팅, 고처리량 스크린 및 의료 기기를 위한 다목적 플랫폼을 제공한다.
도 1은 본 발명의 실시양태의 연질 및 경질 하이드로겔의 특성을 상세하게 나타내는 도면이다.
도 2는 본 발명의 실시양태의 연질 및 경질 하이드로겔의 형성을 상세하게 나타내는 도면이다.
도 3은 하이드로겔 형성의 유동학 데이터를 상이한 혼합비로 예시하는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시양태의 하이드로겔에서 베타TC3 세포 및 Ins-1 세포의 3D 세포 배양의 영상을 예시한다.
도 5는 본 발명의 실시양태의 하이드로겔에서 BL5 세포의 2D 세포 배양의 영상을 예시한다.
도 2는 본 발명의 실시양태의 연질 및 경질 하이드로겔의 형성을 상세하게 나타내는 도면이다.
도 3은 하이드로겔 형성의 유동학 데이터를 상이한 혼합비로 예시하는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시양태의 하이드로겔에서 베타TC3 세포 및 Ins-1 세포의 3D 세포 배양의 영상을 예시한다.
도 5는 본 발명의 실시양태의 하이드로겔에서 BL5 세포의 2D 세포 배양의 영상을 예시한다.
젤란 검은 박테리아 스핑고모나스 엘로데아(Sphingomonas elodea)(이전에 슈도모나스 엘로데아(Pseudomonas elodea))에 의해 생성된 수용성 음이온성 캡슐형 폴리사카라이드이다. 젤란-생성 박테리아는 1978년에 미국 펜실베니아주에 있는 자연 연못에서 백합 식물 조직으로부터 Merck & Company, Inc.의 예전 켈코 사업부에서 발견하고 단리하였다. 초기에는 다양한 미생물의 성장을 위한 고체 배양 배지에서 한천을 대체하기 위해 상당히 낮은 사용 수준에서 대체 겔화제로 확인되었다. (Kang K.S., et al., Agar-like polysaccharide produced by a Pseudomonas species: Production and basic properties. Applied & Environmental Microbiology, 1982 43: 1086-1091). "GELRITE"라는 상표명의 초기 젤란 검 상업용 제품은 이후 다양한 임상 세균학적 배지에서 겔화제로서 적합한 한천 대체물로 확인되었다. (Shungu D, et al., GELRITE as an Agar Substitute in Bacteriological Media, Appl. Environ Microbiol. 1983 46(4): 840-5). 식품 첨가제로서 젤란 검은 일본에서 식품용으로 처음 승인되었다(1988). 이후 젤란 검은 미국, 캐나다, 중국, 한국, 유럽 연합 등과 같은 많은 다른 국가에서 식품용, 비식품용, 화장품용 및 제약용으로 승인되었다. 이는 증점제, 유화제, 및 안정화제로 널리 사용된다.
젤란 검은 스핑고모나스의 적절한 균주를 용이하게 이용가능한 탄수화물 공급원으로 발효시킴으로써 제조된다. 젤란 검의 구성 당은 2:1:1 몰비의 글루코스, 글루쿠론산 및 람노세이다. 이들은 함께 결합하여 선형 테트라사카라이드 반복 단위를 포함하는 1차 구조를 제공한다(O'Neill M. A. et al., Carbohydrate Research, Vol. 124, p. 123, 1983; Jansson,P. E. et al., Carbohydrate Research, Vol. 124, p. 135, 1983). 젤란 검의 천연 또는 고 아실 형태에서, 2개의 아실 치환기, 아세테이트 및 글리세레이트가 존재한다. 2개의 치환기는 동일한 글루코스 잔기에 위치하며, 평균적으로 반복 단위 당 1개의 글리세레이트 및 2개의 반복 단위마다 1개의 아세테이트가 있다. 젤란 검의 저 아실 형태에서, 아실 기는 실질적으로 이러한 기가 없는 선형 반복 단위를 생성하기 위해 제거되었다. 검의 탈아실화는 일반적으로 발효 브로쓰를 알칼리로 처리함으로써 수행된다.
상이한 수준의 아실(A-고 아실 젤란 검), 무/저 아실 젤란 검(B) 또는 메타크릴화 젤란 검과 같은 화학적 변형된 젤란 검(C)을 갖는 (5 x 104 Da 내지 2 x 106 Da의 분자량의) 젤란 검이 하기 표 1에 제시된다.
젤란 검의 고 아실 형태는 검 농도가 임계 농도보다 더 높으면 겔 형성을 위한 임의의 물질의 첨가를 필요로 하지 않는다. 고 아실 젤란 검은 그의 용액이 설정 온도 미만으로 냉각될 때 부드럽고 탄력적이고 취성이 없는 겔을 생성한다. 고 아실 젤란 검은 열로 연화되고 설정 온도와 근접한 온도에서 용융될 것이다. 저 아실 젤란 검 중합체는 전형적으로 반복 당 약 1 내지 2개의 글리세레이트 및 2회 반복마다 1 내지 2개의 아세테이트로부터 아실화 정도를 갖는다. 젤란 검의 저 아실 형태는 일반적으로 겔 형성을 위해 염 또는 산과 같은 겔화제를 필요로 한다. 예를 들어, 저 아실 젤란 검은 겔-촉진 양이온, 바람직하게는 칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온의 존재 하에 냉각될 때 단단하고 탄성이 없고 취성인 겔을 형성한다.
일반적으로, 상기 기재된 바와 같은 젤란 검은 0.001% 내지 10% w/v의 농도에서 0℃ 초과의 온도에서 물에 용해될 수 있는 반면, 모든 유형의 젤란 검은 80℃ 초과 온도에서 물에 완전히 용해될 수 있다. 이와 같이 형성된 젤란 검 수용액은 0℃ 초과의 온도 및 약 4-10의 pH에서 용해 또는 가열-냉각 주기 후 액체 형태로 유지될 수 있다.
상기 기재된 바와 같은 젤란 검은 카르복실 모이어티(즉, 하기 도면에서 적색 동그라미친 COO- 기)의 위치에서 공유 결합을 통해 기능성 펩티드 또는 분자로 변형될 수 있다. 이러한 변형은 젤란 검 및 펩티드 / 분자 혼합 용액을 121℃ 이상의 온도에서 고압(예컨대 15 psi)에서 3분 이상 동안 가열함으로써 수행될 수 있다. 또한, 상기 언급된 젤란 검 용액은 또한 공유 결합 없이 기능성 펩티드 또는 분자와 혼합될 수 있다.
본 발명은 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 젤란 검을 변형시키는 하나 이상의 화학 분자는 a) 천연 또는 합성 기원의 중합체, 화학적으로 변형된 또는 공중합체, 폴리펩티드, 히알루로네이트, 키토산, 콜라겐, 폴리에틸렌글리콜 항응고제, 조영제, 화학치료제, 및 신호전달 경로 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 분자; 및 b) 생체활성 유리, 하이드록시아파타이트, 칼슘 포스페이트 및 철로 이루어진 군으로부터 선택된 무기 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 하나의 실시양태에 따르면, 상기 기재된 바와 같이, 수용성 저 아실 젤란 검, 고 아실 젤란 검, 변형된 젤란 검 및 젤란 검 혼합물과 다른 화학적/생물학적 분자와의 혼합물은 세포 배양 및 다른 생체의학 적용을 위한 젤란 검의 이러한 적용에 적합하다. 젤란 검의 선택된 군은 물에 용해되거나 또는 실온에서 용해된 액체 형태를 유지하고, 중성 pH(pH 4-10)를 수행하고 주위 온도가 냉장고 온도 이상일 때 액체 또는 반-겔 상태를 유지할 수 있다. 젤란 검 용액은 고 농도를 달성하기 위해 0.001-10%의 고체 함량의 다양한 농도 또는 화학적 변형(예를 들어 메타크릴레이트)을 가질 수 있다.
젤란 검 용액에 대한 제조 방법은 젤란 검을 약 0.001 % w/v 내지 10%(w/v)의 고체 함량을 갖는 수계 용액에 용해시키는 단계, 상기 용액을 약 100℃ 내지 약 150℃, 바람직하게는 약 100℃ 내지 약 121℃의 온도 및 약 1 psi 내지 약 40 psi의 압력, 바람직하게는 약 1 psi 내지 약 30 psi의 압력 하에 약 3 내지 약 30분, 바람직하게는 약 5 내지 20분의 기간 동안 가열하는 단계를 포함한다. 이러한 제조 방법은 또한 생물학적 분자 변형된 젤란 검 용액을 제조하기 위해 적용된다. 이러한 생물학적 분자는 세포, 펩티드, 단백질, 지질, 폴리사카라이드, 성장 인자, 성장 호르몬, 항체, 효소, 세포 수용체, 세포 리간드, 항생제, 항균제, 항진균제, 항곰팡이제, 알부민, 혈청, RGD, IKVAV, REDV, YIGSRY, 폴리 리신을 포함하는 NH2, COOH 및 CONH2 기를 갖는 기능성 펩티드 분자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이러한 제조 방법에 사용된 수계 용매는 물, 포스페이트 완충 용액(PBS), 식염수, 세포 배양 배지, 이온성 용액, 알부민, 혈청 및 크실로글루칸을 포함한다.
본 발명은 폴리사카라이드 하이드로겔을 제조하기 위한 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 약 0.001% 내지 약 20%의 하나 이상의 고 아실 젤란 검 중합체, 약 0.001% 내지 약 20%의 하나 이상의 저 아실 젤란 검 중합체, 약 0.001% 내지 약 20%의 하나 이상의 변형된 젤란 검 중합체를 포함하고, 약 0.00001% 내지 약 30%의 하나 이상의 생체활성 분자를 추가로 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 조성물은 약 0.01% 내지 약 5%의 하나 이상의 고 아실 젤란 검 중합체, 약 0.01% 내지 약 5%의 하나 이상의 저 아실 젤란 검 중합체, 약 0.01% 내지 약 5%의 하나 이상의 변형된 젤란 검 중합체를 포함하고, 약 0.001% 내지 약 10%의 하나 이상의 생체활성 분자를 추가로 포함한다.
젤란 검 용액은 약 4℃ 내지 약 60℃의 온도에서 포스페이트 완충액(PBS), 세포 배양 배지 또는 이온성 용액을 포함하나 이에 제한되지는 않는 수계 용매와 직접 혼합함으로써 하이드로겔 내로 촉발될 수 있다. 시스템의 저장 모듈러스(G')는 혼합 시 증가하고 30분 이내에 약 10 Pa를 초과하고, 바람직한 실시양태에서, 시스템의 저장 모듈러스(G')는 약 10 내지 20000 Pa를 초과하며, 이는 시스템이 3D 성장을 위해 그의 하이드로겔 매트릭스 내에서 세포를 현탁하기에 충분히 강하다는 것을 나타낸다. 이 하이드로겔 형성을 위해 사용하는 촉발 용액은 혈청, 완충액, 순수 또는 1가 2가 또는 다가 양이온의 혼합물을 갖는 이온성 용액, 또는 상기 용액의 혼합물이 있거나 없는 임의의 유형의 세포 배양 배지일 수 있다.
이제 도 1 및 2를 참조하면, 하이드로겔을 형성하는 용액의 혼합 비 및 이온 농도에 따라 상이한 유동학 특성을 갖는 2개 유형의 하이드로겔이 형성될 수 있다. 섬유 구조를 포함하는 연질 하이드로겔은 젤란 검 용액 및 촉발 용액이 100:1 내지 1:1 비로 혼합될 때 형성될 수 있다. 바람직하게는, 혼합비는 4:1 내지 1:1이다. 연질 하이드로겔은 전단 박하 및 자기-회복 유동학 특성을 보유하며, 이는 하이드로겔이 전단력(예컨대 피펫팅, 주사기 주입 또는 펌프 관류)에 의해 액체 상태로 전환되지만 외력이 중단되면 그의 하이드로겔 상태로 빠르게 회복하는 것을 허용한다. 겔-졸 상태는 다수회 변형될 수 있다. 세포 및 생체 분자는 하이드로겔 내에서 매립되어 주입에 의해 상이한 위치에 전달될 수 있다. 혼합은 전형적으로 약 4 내지 약 60℃, 바람직하게는 실온 내지 약 37℃의 온도에서 수행된다. 이온 촉발 용액은 Na+, K+, Ca++, Mg++ 등과 같은 하나 이상의 양이온 분자를 함유한다. 이온 농도는 0.01% 초과이다.
젤란 검 용액 및 촉발 용액이 1:1 내지 1:100 비로 혼합되거나 또는 촉발 용액이 고 이온 농도를 함유할 때 응집 구조를 포함하는 경질 하이드로겔이 형성될 수 있다. 바람직하게는, 도 3에 제시된 바와 같이, 혼합 비는 1:1 내지 1:4이고, 촉발 용액은 0.02% w/v 초과의 이온(예를 들어, Ca2+) 농도를 갖는다. 바람직한 실시양태에서, 하이드로겔 형성을 위한 혼합 범위는 4:1 v/v(4부의 젤란 검 용액을 1부의 세포 배양 배지와 혼합함) 내지 1:4(1부의 젤란 검 용액을 4부의 세포 배양 배지와 혼합함)이다. 경질 하이드로겔은 딱딱하고 취성이며 전단 박하 및 자기-회복 유동학 특성을 보유하지 않는다. 외력으로 흐트러뜨릴 때, 경질 하이드로겔은 작은 겔 입자로 부서질 수 있다. 경질 하이드로겔은 그의 하이드로겔 형성을 80℃ 수조에 배치될 때 유지할 수 있다. 상기 언급된 바람직한 실시양태에서, 형성된 경질 하이드로겔은 80℃만큼 높은 온도에서 그의 하이드로겔 형성을 유지할 수 있다.
추가로, 연질 겔은 추가 이온성 용액이 하이드로겔 시스템 내에 첨가될 때, 예컨대 여분의 포스페이트 완충액, 세포 배양 배지 또는 이온성 용액으로 덮거나 이에 침지시킴으로써 경질 겔로 전환될 수 있다. 예로써: 800 μL 1% 젤란 검 용액을 200 μL DMEM 배지와 혼합하면 연질 겔이 형성될 것이다. 연질 겔이 형성된 후, 연질 겔 위에 1 mL DMEM 배지를 첨가하면 연질 하이드로겔은 12시간 이내에 경질 하이드로겔로 전환될 것이다.
이러한 변환은 이 하이드로겔 시스템에서 시험관내 3D 세포 배양을 위한 편리한 2-단계 절차를 제공한다. 생체활성 분자는 이후 하이드로겔에 첨가된 젤란 검 용액과의 혼합 전에 세포 배양 배지와 직접 혼합될 수 있다. 이러한 생물학적 분자는 예컨대 세포, 펩티드, 단백질, 지질, 폴리사카라이드, 성장 인자, 성장 호르몬, 항체, 효소, 세포 수용체, 혈청, 세포 리간드, 항생제, 항균제, 항진균제, 항곰팡이제일 수 있다.
살아있는 세포는 하이드로겔 형성 전에 젤란 검 용액 또는 세포 배양 배지와 같은 촉발 용액과 혼합될 수 있다. 세포는 연질 하이드로겔에 균일하게 현탁되고 피펫팅 또는 주입에 의해 개별 양호한 플레이트 또는 상이한 용기로 옮길 준비가 되었다. 연질 겔(세포 함유)이 최종 용기에 배치되면, 여분의 촉발 용액은 연질 겔 위 또는 주위에 첨가되어 경질 하이드로겔로 전환될 수 있다. 이 절차는 3D 매트릭스 구조를 추가로 안정화시킬 뿐만 아니라 영양소 또는 생체분자가 하이드로겔 시스템 내로 첨가되어 하이드로겔과 주위 매질 사이에서 교환하는 것을 허용한다. 매립된 세포는 3D 콜로니로서 성장하고 신약 개발, 고처리량 스크린 또는 기본 생물학적 연구를 위해 사용될 수 있다. 유사한 절차를 사용하여 세포 배양 플레이트 또는 기기를 코팅할 수 있으며, 연질 겔은 배양 플레이트의 표면에 직접 첨가되고 이어서 살아있는 세포는 하이드로겔 위에 첨가하여 2D에서 성장할 수 있다. 이 유형의 적용은 세포 이동 및 침습 연구를 위해 사용될 수 있으며, 일부 세포는 위에서 하이드로겔 내로 침투하여 3D 구조로 성장할 수 있다. 세포는 하이드로겔을 파괴하고 하이드로겔을 탈이온수 또는 저 이온 농도 용액으로 용해시킴으로써 하이드로겔로부터 수확될 수 있다.
기능성 펩티드, 단백질, 성장 인자, 약물 화합물과 같은 생체분자는 하이드로겔 형성 및 하이드로겔과 주위 매질의 교환 전 또는 후 하이드로겔 시스템 내로 첨가될 수 있다. 이 특성은 이러한 3D 세포 배양 하이드로겔 시스템을 세포 생존력 검정, 라이브/데드 검정, 형광 염색, 및 영상화 및 조직학적 분석에 적합하게 만든다. 또한, 생체활성 화합물은 또한 화학적 변형을 통해 젤란 검 분자에 공유 결합하고 하이드로겔 매트릭스와 세포 사이에서 상호작용을 증가시킬 수 있다.
전반적으로, 하이드로겔은 3D 세포 배양, 2D 코팅, 느린 방출을 위한 상이한 생체활성 분자용 담체, 주입, 바이오프린팅 등에 사용될 수 있다
실시예
실시예 1(도 4에 제시된 바와 같음): DMEM 배지에서 5x105개 세포/mL로 베타TC3 세포 현탁액을 제조한다.
젤란 검 용액을 1% w/v로 제조한다. 젤란 검 용액을 세포 현탁액과 4:1 비(v/v)로 혼합한다. 겔화는 혼합 직후 시작되어 증가하는 G'을 나타낼 것이다. 연질 하이드로겔은 G' > 50 pa를 나타냄으로써 15분 내에 형성될 수 있다. 베타TC3 세포를 하이드로겔 내에서 현탁하였다. 그 후, 더 많은 DMEM 배지를 연질 겔 위에 첨가하면, 하이드로겔은 증가하는 G'을 나타냄으로써 추가로 안정화될 것이다. 경질 겔은 2시간 후(또는 밤새) 형성되어 500 Pa 초과의 G'을 나타낼 것이다. 베타TC3 세포는 하이드로겔에서 성장하고 3일 후 3D 콜로니를 형성할 수 있다.
실시예 2(도 4에 제시된 바와 같음): RPMI 배지에서 5x105개 세포/mL로 Ins-1 세포 현탁액을 제조한다.
젤란 검 용액을 1% w/v로 제조한다. 젤란 검 용액을 세포 현탁액과 1:1 비(v/v)로 혼합한다. 겔화는 혼합 직후 시작되어 증가하는 G'을 나타낼 것이다. 연질 하이드로겔은 G' > 50 pa를 나타냄으로써 15분 내에 형성될 수 있다. Ins-1 세포를 하이드로겔 내에서 현탁하였다. 그 후, 더 많은 RPMI 배지를 연질 겔 위에 첨가하면, 하이드로겔은 증가하는 G'을 나타냄으로써 추가로 안정화될 것이다. 경질 젤은 2시간 후(또는 밤새) 형성되어 300 Pa 초과의 G'을 나타낼 것이다. Ins-1 세포는 하이드로겔에서 성장하고 3일 후 3D 콜로니를 형성할 수 있다.
본 발명의 많은 요소는 해당 분야에서 독특하다. 신규성은 신체 크기 및 체력 수준 면에서 다양한 사용자에 의해 적절한 운동 형대로 사용되도록 본 발명의 거의 모든 측면에 대한 다양한 옵션에 의해 예시된다. 추가로, 본 발명의 임의의 사용자가 이용할 수 있는 광범위한 운동이 있으며, 사용자는 상지 및 하지 근육군을 동시에 사용하는 운동을 수행할 수 있다.
본 발명이 특정한 특이성 정도로 기재되었을지라도, 본 개시내용은 단지 예시의 방식으로 이루어졌으며 구성부와 배열부의 세부사항의 많은 변경이 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고 이루어질 수 있음이 이해되어야 한다.
Claims (40)
- 폴리사카라이드 하이드로겔을 위한 조성물로서,
하나 이상의 수용성 고 아실 젤란 검 중합체;
하나 이상의 수용성 저 아실 젤란 검 중합체; 및
하나 이상의 수용성 화학적으로 변형된 젤란 검 중합체 또는 하나 이상의 펩티드 변형된 젤란 검 중합체
를 포함하는, 조성물. - 제1항에 있어서, 형성된 상기 폴리사카라이드 하이드로겔이 주입 용도에 적합한 연질 겔인, 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 폴리사카라이드 하이드로겔이 전단력에 의해 액체 상태로 전환되거나, 또는 전단력이 중단되면 그의 하이드로겔 상태로 회복하는 것을 허용함으로써, 상기 연질 겔이 전단 박하 및 자기 치유 유동학 특성을 나타내는, 조성물.
- 제3항에 있어서, 상기 전단력이 피펫팅, 주사기 주입, 또는 펌프 관류 또는 그의 조합에 의해 가해지는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 형성된 상기 폴리사카라이드 하이드로겔이 경질 겔인, 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 경질 겔이 유동학 특성학 갖는 3-D 겔 구조를 나타내어 상기 경질 겔이 피펫팅 또는 전단에 의해 파괴될 때, 상기 경질 겔이 더 작은 겔 입자로 부서지고, 하나 이상의 생체활성 분자에 대한 친화성을 갖도록 하는, 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 경질 겔이 약 10 Pa 초과의 저장 모듈러스 값을 갖는, 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 경질 겔이 그의 겔 형성을 약 80℃ 이하의 온도에서 유지하지만, 외력으로 흐트러뜨렸을 때 더 작은 겔 입자로 부서질 수 있는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 화학적으로 변형된 젤란 검 중합체가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물:
a) 천연 또는 합성 기원의 중합체, 화학적으로 변형된 또는 공중합체, 히알루로네이트, 키토산, 콜라겐, 폴리에틸렌글리콜 항응고제, 조영제, 화학치료제, 및 신호전달 경로 분자로 이루어진 군으로부터 선택된 유기 분자; 및
b) 생체활성 유리, 하이드록시아파타이트, 칼슘 포스페이트 및 철로 이루어진 군으로부터 선택된 무기 분자. - 제6항에 있어서, 가열 전에 상기 젤란 검 용액 내에 첨가된 상기 하나 이상의 생체활성 분자가 세포, 펩티드, 단백질, 지질, 폴리사카라이드, 성장 인자, 성장 호르몬, 항체, 효소, 세포 수용체, 세포 리간드, 항생제, 항균제, 항진균제, 항곰팡이제, RGD, IKVAV, REDV, YIGSRY, 폴리 리신을 포함하는 NH2, COOH 및 CONH2 기를 갖는 기능성 펩티드 분자로 이루어진 군으로부터 선택되는, 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 연질 겔을 여분의 포스페이트 완충액, 세포 배양 배지, 또는 이온성 용액의 수용액, 또는 그의 조합에 침지함으로써 상기 연질 겔이 경질 겔로 전환되는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 하나 이상의 생체활성 분자가 그의 생체활성을 유지하면서 폴리사카라이드 하이드로겔 시스템과 접촉하거나, 그에 부착되거나, 현탁되거나, 매립되거나 또는 포획되는, 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 하나 이상의 생체활성 분자가 그의 생체활성을 유지하면서 상기 폴리사카라이드 하이드로겔에 현탁되거나 또는 포획되는, 조성물.
- 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 생체활성 분자가 하나 이상의 생체활성 분자의 생체활성을 유지하면서 상기 폴리사카라이드 하이드로겔과 접촉하거나 그에 부착되거나, 현탁되거나, 매립되거나 또는 포획되는, 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 하나 이상의 생체활성 분자가 하나 이상의 생체활성 분자의 생체활성을 유지하면서 폴리사카라이드 하이드로겔에 현탁되거나 또는 포획되는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 펩티드에 의해 변형된 젤란 검의 용액이 펩티드를 상기 젤란 검 용액 내에 혼합물로서 첨가하고 이어서 약 100℃ 이상의 온도 및 약 1 내지 약 40 psi의 압력에서 약 3 내지 약 30분의 기간 동안 가열함으로써 형성되는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 약 0.001% 내지 약 20%의 상기 하나 이상의 고 아실 젤란 검 중합체, 약 0.001% 내지 약 20%의 상기 하나 이상의 저 아실 젤란 검 중합체, 약 0.001% 내지 약 20%의 상기 하나 이상의 변형된 젤란 검 중합체를 포함하고, 약 0.00001% 내지 약 30%의 상기 하나 이상의 생체활성 분자를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제17항에 있어서, 약 10 Pa의 저장 모듈러스 값을 갖는, 조성물.
- 제1항에 있어서, 약 0.01% 내지 약 10%의 상기 하나 이상의 고 아실 젤란 검 중합체, 약 0.01% 내지 약 10%의 상기 하나 이상의 저 아실 젤란 검 중합체, 약 0.01% 내지 약 10%의 상기 하나 이상의 변형된 젤란 검 중합체를 포함하고, 약 0.001% 내지 약 20%의 상기 하나 이상의 생체활성 분자를 추가로 포함하는, 조성물.
- 제20항에 있어서, 약 10 내지 약 20000 Pa의 저장 모듈러스 값을 갖는, 조성물.
- 제1항에 따른 폴리사카라이드 하이드로겔을 형성하는 방법으로, 하기 단계를 포함하는, 방법:
수용성 젤란 검 중합체를 약 4℃ 내지 약 99℃의 온도에서 0.001 % w/v 초과의 고체 함량을 갖는 수계 용매에 용해시키는 단계;
상기 용액을 약 100℃ 이상의 온도 및 약 1 psi 초과의 압력에서 3분 이상 동안 가열하는 단계; 및
포스페이트 완충 용액(PBS), 세포 배양 배지 또는 이온성 용액을 직접 혼합하여 폴리사카라이드 하이드로겔 형성을 촉발시킴으로써 약 4℃ 내지 약 60℃ 범위의 온도에서 망상화하며, 여기서 폴리사카라이드 하이드로겔의 저장 모듈러스(G')는 혼합 시 증가하고 30분 이내에 약 10 Pa를 초과하여 상기 시스템이 3D 성장을 위해 그의 하이드로겔 매트릭스 내에서 현탁된 생체활성 분자를 유지할 수 있도록 하는 단계; 및
화학물질 또는 생체활성 분자를 첨가하여 화학물질 또는 생체활성 분자가 형성된 폴리사카라이드 하이드로겔과 접촉하거나, 그에 부착되거나, 현탁되거나, 매립되거나 또는 포획되도록 하는 단계. - 제21항에 있어서, 상기 수계 용매가 물, 포스페이트 완충 용액(PBS), 식염수, 및 세포 배양 배지를 포함하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 고체 함량이 약 0.001%(w/v) 내지 10%(w/v)의 양으로 사용되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 용액 및 약 0.01%(w/v) 초과의 이온 농도의 촉발 용액을 약 100:1 내지 약 1:1의 비로 혼합할 때 연질 하이드로겔이 형성되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 용액 및 약 0.01%(w/v)의 고 이온 농도의 촉발 용액을 약 1:1 내지 약 1:100의 비로 혼합할 때 경질 하이드로겔이 형성되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 용액 및 약 0.01 %(w/v)의 정상 이온 농도의 촉발 용액을 약 1:1 내지 약 1:20의 비로 혼합할 때 경질 하이드로겔이 형성되는, 방법.
- 제21항에 있어서, 용액을 망상화 전에 약 100℃ 내지 약 132℃, 바람직하게는 약 100℃ 내지 약 121℃의 온도로 가열하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 용액을 망상화 전에 약 1 psi 내지 약 25 psi의 압력 하에 가열하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 용액을 망상화 전에 약 1 psi 내지 약 15 psi의 압력 하에 가열하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 용액을 망상화 전에 약 1분 내지 약 30분 동안 가열하는, 방법.
- 제21항에 있어서, 용액을 망상화 전에 약 5분 내지 약 20분 동안 가열하는, 방법.
- 제11항에 있어서, 형성된 상기 연질 겔이 세포 배양 배지 또는 이온성 용액의 수용액에 침지됨으로써 경질 겔 시스템으로 전환되는, 조성물.
- 제11항에 따른 방법에 의해 형성되고 상호전환된 하이드로겔 시스템으로서, 상기 생체활성 분자가 상기 젤란 검 용액 또는 촉발 용액과 혼합됨으로써, 하이드로겔 형성 전 또는 후, 하이드로겔과 주위 매질의 교환 전 또는 후 상기 하이드로겔 시스템 내로 첨가될 수 있는, 하이드로겔 시스템.
- 세포 생존력 검정, 라이브/데드 검정, 고처리량 스크리닝, 형광 염색 및 영상화, 조직학적 분석, 및 3D 바이오프린팅을 포함한, 신약 개발 및 생체의학 적용을 위한 다목적 플랫폼으로서, 제1항에 따른 조성물로부터 유래된 폴리사카라이드 하이드로겔의 용도.
- 제34항에 있어서, 살아있는 세포가 상기 하이드로겔 위에서 성장되거나, 그에 매립되거나 캡슐화되고, 상기 하이드로겔을 파괴하고 상기 하이드로겔을 탈이온수 또는 저 이온 농도 용액으로 용해시킴으로써 하이드로겔 시스템으로부터 수확되는, 용도.
- 제34항에 있어서, 하기를 포함하는, 하이드로겔에서 시험관내 3D 세포 배양을 위해 2-단계 절차가 제공되는 용도:
1) 살아있는 세포는 하이드로겔 형성 전에 젤란 검 용액 또는 세포 배양 배지와 같은 촉발 용액과 혼합되며, 여기서 세포는 연질 하이드로겔에 균일하게 현탁되고 피펫팅 또는 주입에 의해 개별 세포 배양 플레이트 또는 상이한 용기로 옮길 준비가 되는 것; 및
2) 연질 겔이 최종 용기에 배치되면, 여분의 촉발 용액이 연질 겔 위 또는 주위에 첨가되어 경질 하이드로겔로 전환되며, 여기서 3D 매트릭스 구조는 추가로 안정화되고, 영양소 또는 다른 생체분자는 하이드로겔 내로 첨가되어 하이드로겔과 주위 매질 사이에서 교환되는 것. - 제34항에 있어서, 상기 연질 하이드로겔을 배양 플레이트의 표면에 직접 첨가하여 세포 배양 플레이트를 코팅하고, 이어서 살아있는 세포를 하이드로겔 위에 첨가하여 2D에서 성장할 수 있고, 일부 세포는 위에서 하이드로겔 내로 침투하여 3D 구조로 성장할 수 있는, 2D 하이드로겔 코팅 세포 배양 연구를 위한 용도.
- 제21항에 있어서, 하기 단계를 추가로 포함하는, 방법:
나트륨 시트레이트를 젤란 검 중합체 용액을 형성하는 상기 수용성 젤란 검 중합체에 첨가하는 단계; 및
상기 젤란 검 중합체 용액의 pH를 중성 pH로 조정하는 단계. - 제24항에 있어서, 상기 연질 하이드로겔이 주입에 적합한 섬유 구조를 포함하는, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 경질 하이드로겔이 응집 구조를 포함하는, 방법.
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