CN112190760B - 一种适用于细胞三维培养的水凝胶制备方法 - Google Patents

一种适用于细胞三维培养的水凝胶制备方法 Download PDF

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Abstract

一种适用于细胞三维培养的水凝胶制备方法，通过3D打印出构建水凝胶成型的模具，消毒后备用；按照一定的比例混合胶原‑NaOH溶液、钙离子交联溶液、海藻酸钠溶液、改良伊格尔培养基(DMEM培养基，Dulbecco’s Modified Eagle Medium)及细胞悬液，在快速的震荡混匀后，得到清澈透亮的胶体溶液，并转移至模具中，37℃恒温培养箱培养1h后成型；本发明具有良好的生物相容性、安全性和可降解性，操作步骤简单，成胶效果稳定的优点。

Description

一种适用于细胞三维培养的水凝胶制备方法
技术领域
本发明属于生物材料技术领域，具体涉及一种适用于细胞三维培养的水凝胶制备方法。
背景技术
水凝胶是一种水溶胀的聚合材料，可保持独特的三维结构，在组织工程学中已经得到了广泛的应用。传统合成方法已研发出具有优异性能的水凝胶，譬如隐形眼镜以及一些生物植入材料等，但是在合成反应过程中难以实现精确的控制，成型后的水凝胶机械性能较差是传统水凝胶的一大限制因素；除此之外，材料的选择对于水凝胶中细胞的生活状态与生物学功能也有着至关重要的影响，需要进行多方面的考量，譬如材料的可塑性、生物相容性、安全性以及渗透性等，而目前这方面的研究还有诸多不足。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种适用于细胞三维培养的水凝胶制备方法，本发明建立在胶原水凝胶的基础上，引入海藻酸盐，并进行Ga2+交联，按照一定的比例，程序化地混合胶原溶液、海藻酸盐溶液、Ga2+交联液及细胞悬液，并借助特定的模具，对成胶过程进行精准地把控，规避了可能出现的问题，得到性质稳定的三维培养水凝胶载体；具有良好的生物相容性、安全性和可降解性，操作步骤简单，成胶效果稳定，为体外实现细胞三维培养提供了材料选择和技术支撑。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案。
一种适用于细胞三维培养的水凝胶，其原料包括胶原、海藻酸盐、钙离子交联液(CaCO3-GDL)、CaSO4、NaOH和DEME细胞培养基；以1ml水凝胶体系为例，各组份含量如下：
胶原：配制浓度为10-12mg/ml，体积为0.46-0.56ml；
海藻酸盐：配制浓度5-10mg/ml，体积为0.2ml；
钙离子交联液(CaCO3-GDL)：配制浓度为0.5-0.8mmol/L，体积为0.05ml；
CaSO4：配制浓度为1-1.5mmol/L，体积为0.025ml；
NaOH：配制浓度为2.2-2.8mmol/L，体积为0.0107-0.0128ml；
DEME细胞培养基：体积为0.152ml-0.254ml。
所述的海藻酸盐包括但不限于海藻酸钠、海藻酸钾。
所述的胶原为从新鲜鼠尾、牛跟腱或猪皮中提取。
基于上述的一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法，具体包括以下步骤：
步骤一：借助3D打印，构建水凝胶成型模具，消毒后备用；
步骤二：分别配制水凝胶所需溶液，以制备1ml水凝胶为例：
1)配制NaOH溶液：取NaOH粉末0.88-1.12g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为2.2-2.8mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22μm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
2)配制钙离子交联液(CaCO3-GDL)：取CaCO3-GDL粉末0.87-1.39g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为0.5-0.8mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22μm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
3)配制CaSO4溶液：取CaSO4粉末1.72-2.58g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为1-1.5mmol/L的溶液，封口，4℃保存备用；
4)配制海藻酸盐溶液：取海藻酸盐粉末0.05-0.1g，放入干净的广口瓶，加入10ml无血清DMEM培养基，终浓度为5-10mg/ml；在4℃条件下搅拌过夜，充分搅拌溶解后，于超净台内，用0.45μm的滤器过滤除菌；封口，4℃保存备用；
5)配制Ⅳ型胶原酶：称重80-100mgⅣ型胶原酶粉，使用100ml无血清高糖DMEM溶解，用0.22μm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为0.8-1mg/ml；4℃保存备用；
6)配制海藻酸盐裂解酶：称重25-30mg海藻酸盐裂解酶粉，使用100ml无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22μm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为250-300μg/ml；4℃保存备用；
7)配制胶原溶液，配制浓度为10-12mg/ml，体积为0.46-0.56ml；
步骤三：成胶及细胞包埋
1)取消毒完成后的完全溶解的胶原溶液0.46-0.56ml转移至1.5mlEP管中，加入DEME细胞培养基0.1-0.15ml混合，记为溶液1；
2)取4℃冷藏的海藻酸盐溶液0.2ml与DEME细胞培养基0.05-0.07ml相混合，记为溶液2；
3)将0.05ml的钙离子交联液(CaCO3-GDL)、0.025ml的DEME细胞培养基与0.025ml的CaSO4溶液相混合，记为溶液3；
4)将溶液1、溶液2混匀；
5)将使用胰酶消化并收集的细胞计数至1-10×105个/ml得细胞悬液，将所得细胞悬液加入步骤三第4)步所得到溶液1、溶液2的混合液中混匀；
6)在步骤三第5)步得到的混合液中加入溶液3进行钙离子的交联，观察到液体浑浊并有白色絮状沉淀产生；
7)在步骤三第6)步得到的混合液中加入NaOH溶液0.0107-0.0128ml，调节pH至中性，液体恢复均一清澈，无明显沉淀；
8)将成型模具放入中皿中，加入在步骤三第7)步得到的混合液后移入培养箱中，36-38℃条件下混合液固化成型，得到固化的水凝胶；
9)40min-1h后将固化的水凝胶移出，移除模具。
所述步骤二第7)步配制胶原溶液的具体方法为：
a)取﹣80℃保存下的2月龄SD大鼠的新鲜鼠尾，4℃解冻0.5-1h，埋于冰盒中，转移至生物安全柜中操作；
b)所有器械置于冰盒预冷4℃，0.5-1h，手术刀片切开鼠尾表皮并剥去鼠皮，使用血管钳，每间隔1.5-2.0cm折断鼠尾筋骨；
c)固定鼠尾根部，用刀片将鼠尾尖端约0.5-1.0cm长度切下，使用血管钳抽出鼠尾肌腱并转移至4-8℃冷水中；
d)对得到的鼠尾肌腱进行清理，去除其中含有的杂质，使用滤纸吸去多余的水分，至胶原成团无液体流出且其表面维持湿润的状态后，使用分析天平称重，以预冷的4℃的1:1000冰醋酸溶液按1-1.2g：100ml的比例溶解鼠尾肌腱，置于磁力搅拌器上，4℃条件下缓慢溶解4-5天直至完全溶解；
e)将上一步得到的完全溶解鼠尾肌腱的1:1000冰醋酸溶液使用低温高速离心机，10000-12000r/s离心1.5-2h后取上清液，倒入100-150mm培养皿中，封口膜封闭，-80℃冷冻过夜，得冷冻的胶原溶液；
f)将完全冷冻的胶原溶液放入真空冷冻干燥机中，3-5天后收集白色絮状的胶原，﹣80℃保存；
g)取上一步得到的胶原，称重后于4℃溶解于1:1000冰醋酸溶液中，溶解浓度为10-12mg/ml；
h)按胶原溶液与氯仿体积比1:10加入氯仿消毒，8-12h后吸出胶原溶液，并避光敞口2-4h以挥发胶原中多余三氯甲烷，4℃保存待用。
本发明具有以下有益效果：
本发明在胶原水凝胶的基础上引入海藻酸盐后，进行钙离子交联，使用DEME细胞培养基作为溶剂，维持了良好的生物相容性、安全性，细胞在水凝胶中生长良好，状态稳定，增殖状态佳，与此同时还提升了水凝胶的机械强度，解决了胶原水凝胶质地软，易收缩的问题；借助3D打印技术构建模具及规范化的操作程序，简化了水凝胶的制备流程，提高了水凝胶制备的稳定性；具有良好的生物相容性、安全性和可降解性，操作步骤简单，成胶效果稳定的优点，是体外细胞三维培养的良好选择。
附图说明
图1为本发明水凝胶制备及成型方法的示意图。
图2为本发明模具的实物图及成型中的水凝胶。
图3为本发明成型后的水凝胶。
图4为本发明以人牙周膜细胞为例的水凝胶中培养1h后的细胞生长及铺展情况，其中：图4(a)为普通显微镜拍摄图，图4(b)为荧光显微镜拍摄图。
图5为本发明以人牙周膜细胞为例的水凝胶中培养24h后的细胞生长及铺展情况，其中：图5(a)为普通显微镜拍摄图，图5(b)为荧光显微镜拍摄图。
图6为本发明以人牙周膜细胞为例的水凝胶中培养48h后的细胞生长及铺展情况，其中：图6(a)为普通显微镜拍摄图，图6(b)为荧光显微镜拍摄图。
图7为本发明细胞在水凝胶中的增殖曲线。
图8为本发明水凝胶的主要成分浓度及体积比例。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1
参见图1至图3，一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法，具体步骤为：
步骤一：借助3D打印，构建水凝胶成型模具，消毒后备用；
步骤二：分别配制水凝胶所需溶液，以制备1ml水凝胶为例：
1)配制NaOH溶液：取NaOH粉末0.96g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为2.4mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22μm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
2)配制钙离子交联液(CaCO3-GDL)：取CaCO3-GDL粉末0.87g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为0.5mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22μm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
3)配制CaSO4溶液：取CaSO4粉末1.72g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为1mmol/L的溶液，封口，4℃保存备用；
4)配制海藻酸钠溶液：取海藻酸钠粉末0.05g，放入干净的广口瓶，加入10ml无血清DMEM培养基，终浓度为5mg/ml；在4℃条件下搅拌过夜，充分搅拌溶解后，于超净台内，用0.45μm的滤器过滤除菌，封口，4℃保存备用；
5)配制Ⅳ型胶原酶：称重约80mgⅣ型胶原酶粉，使用100ml无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22μm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为0.8mg/ml；4℃保存备用；
6)配制海藻酸盐裂解酶：称重约25mg海藻酸盐裂解酶粉，使用100ml无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22μm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为250μg/ml，4℃保存备用；
7)配制胶原溶液：
a)取﹣80℃保存下的2月龄SD大鼠的新鲜鼠尾，4℃解冻0.5h，埋于冰盒中，转移至生物安全柜中操作；
b)所有器械置于冰盒预冷4℃，0.5h，手术刀片切开鼠尾表皮并剥去鼠皮，使用血管钳，每间隔1.5cm折断鼠尾筋骨；
c)固定鼠尾根部，用刀片将鼠尾尖端约0.5cm长度切下，使用血管钳抽出鼠尾肌腱并转移至4℃冷水中；
d)对得到的鼠尾肌腱进行仔细的清理，去除其中含有的杂质，使用滤纸吸去多余的水分，至胶原成团无液体流出且其表面维持湿润的状态后，使用分析天平称重，以预冷的4℃的1:1000冰醋酸溶液按1g：100ml的比例溶解鼠尾肌腱，置于磁力搅拌器上，4℃条件下缓慢溶解4天直至完全溶解；
e)将上一步得到的完全溶解鼠尾肌腱的1:1000冰醋酸溶液使用低温高速离心机，11000r/s离心1.5h后取上清液，倒入培养皿中，封口膜封闭，-80℃冷冻过夜，得冷冻的胶原溶液；
f)将完全冷冻的胶原溶液放入真空冷冻干燥机中，3天后收集白色絮状的胶原，﹣80℃保存；
g)取上一步得到的胶原，称重后于4℃溶解于1:1000冰醋酸溶液中，溶解浓度为10mg/ml；
h)按胶原溶液与氯仿体积比1:10加入氯仿消毒，10h后吸出胶原溶液，并避光敞口2h以挥发胶原中多余三氯甲烷；4℃保存待用；
步骤三：成胶及细胞包埋：
1)取消毒完成后的完全溶解的胶原溶液0.56ml转移至1.5mlEP管中，加入DEME细胞培养基0.1ml混合，记为溶液1；
2)取4℃冷藏的0.2ml海藻酸钠溶液与0.027ml的DEME细胞培养基相混合，记为溶液2；
3)将0.05ml的钙离子交联液(CaCO3-GDL)、0.025ml的DEME细胞培养基及0.025ml的CaSO4溶液相混合，记为溶液3；
4)将溶液1、溶液2混匀；
5)将使用胰酶消化并收集的细胞计数至5×105个/ml得细胞悬液，将所得细胞悬液加入步骤三第4)步所得到的溶液1、溶液2的混合液中混匀；
6)在步骤三第5)步得到的混合液中加入溶液3进行钙离子的交联，观察到液体浑浊并有白色絮状沉淀产生；
7)在步骤三第6步得到的混合液中加入NaOH溶液0.0128ml，调节pH至中性，液体恢复均一清澈，无明显沉淀；
8)将成胶模具放入中皿中，加入步骤三第7)步得到的混合液后移入培养箱中，36.5℃条件下混合液固化成型，得到固化的水凝胶；
9)40min后将固化的水凝胶移出，移除模具。
实施例2
一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法，具体步骤为：
步骤一：借助3D打印，构建水凝胶成型的模具，消毒后备用；
步骤二：分别配制水凝胶所需溶液，以制备1ml水凝胶为例：
1)配制NaOH溶液：取NaOH粉末1.04g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为2.6mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22μm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
2)配制钙离子交联液(CaCO3-GDL)：取CaCO3-GDL粉末1.22g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为0.7mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22μm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
3)配制CaSO4溶液：取CaSO4粉末2.06g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为1.2mmol/L的溶液；封口，4℃保存；
4)配制海藻酸钠溶液：取海藻酸钠粉末0.08g，放入干净的广口瓶，加入10ml无血清DMEM培养基，终浓度为8mg/ml；在4℃条件下搅拌过夜，充分搅拌溶解后，于超净台内，用0.45μm的滤器过滤除菌，封口，4℃保存备用；
5)配制Ⅳ型胶原酶：称重90mgⅣ型胶原酶粉，使用100ml无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22μm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为0.9mg/ml，4℃保存备用；
6)配制海藻酸盐裂解酶：称重28mg海藻酸盐裂解酶粉，使用100ml无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22μm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为280μg/ml，4℃保存备用；
7)配制胶原溶液：
a)取﹣80℃保存下的2月龄SD大鼠的新鲜鼠尾，4℃解冻0.75h，埋于冰盒中，转移至生物安全柜中操作；
b)所有器械置于冰盒预冷4℃，0.75h，手术刀片切开鼠尾表皮并剥去鼠皮，使用血管钳，每间隔1.8cm折断鼠尾筋骨；
c)固定鼠尾根部，用刀片将鼠尾尖端约0.7cm长度切下，使用血管钳抽出鼠尾肌腱并转移至6℃冷水中；
d)对得到的鼠尾肌腱进行仔细的清理，去除其中含有的杂质，使用滤纸吸去多余的水分，至胶原成团无液体流出且其表面维持湿润的状态后，使用分析天平称重，以预冷的4℃的1:1000冰醋酸溶液以1.2g：100ml的比例溶解鼠尾肌腱，置于磁力搅拌器上，4℃条件下缓慢溶解4天直至完全溶解；
e)将上一步得到的完全溶解鼠尾肌腱的1:1000冰醋酸溶液使用低温高速离心机，12000r/s离心1h后取上清液，倒入150mm培养皿中，封口膜封闭，-80℃冷冻过夜，得冷冻的胶原溶液；
f)将完全冷冻的胶原溶液放入真空冷冻干燥机中，4天后收集白色絮状的胶原，﹣80℃保存；
g)取上一步得到的胶原，称重后于4℃溶解于1:1000冰醋酸溶液中，溶解浓度为11mg/ml；
h)按胶原溶液与氯仿体积比1:10加入氯仿消毒，10h后吸出胶原溶液，并避光敞口3h以挥发胶原中多余三氯甲烷，4℃保存待用；
步骤三：成胶及细胞包埋：
1)取消毒完成后的完全溶解的胶原溶液0.509ml转移至1.5mlEP管中，加入0.1ml的DEME细胞培养基混合，记为溶液1；
2)取4℃冷藏的0.2ml的海藻酸钠溶液与0.079ml的DEME细胞培养基相混合，记为溶液2；
3)将0.05ml的钙离子交联液(CaCO3-GDL)、0.025ml的DEME细胞培养基及0.025ml的CaSO4溶液相混合，记为溶液3；
4)将溶液1、2混匀；
5)将使用胰酶消化并收集的细胞计数至6×105个/ml后得细胞悬液，将所得细胞悬液加入步骤三第4)步所得到的溶液1、2的混合液中混匀；
6)在步骤三第5)步得到的混合液中加入溶液3进行钙离子的交联，观察到液体浑浊并有白色絮状沉淀产生；
7)在步骤三第6步得到的混合液中加入0.0117ml的NaOH溶液，调节pH至中性，液体恢复均一清澈，无明显沉淀；
8)将成胶模具放入中皿中，加入在步骤三第7)步得到的混合液后移入培养箱中，37℃条件下混合液固化成型，得到固化的水凝胶；
9)50min后将固化的水凝胶移出，移除模具。
实施例3
一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法，具体步骤为：
步骤一：借助3D打印，构建水凝胶成型模具，消毒后备用；
步骤二：分别配制水凝胶所需溶液，以制备1ml水凝胶为例：
1)配制NaOH溶液：取NaOH粉末1.12g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为2.8mmol/L；于超净台内，用0.22μm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
2)配制钙离子交联液(CaCO3-GDL)：取CaCO3-GDL粉末1.39g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为0.8mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22μm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
3)配制CaSO4溶液：取CaSO4粉末2.58g，放入干净的离心管内，加入10ml双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为1.5mmol/L的溶液，封口，4℃保存备用；
4)配制海藻酸钾溶液：取海藻酸钾粉末0.1g，放入干净的广口瓶，加入10ml无血清DMEM培养基，终浓度为10mg/ml，在4℃条件下搅拌过夜，充分搅拌溶解后，于超净台内，用0.45μm的滤器过滤除菌；封口，4℃保存备用；
5)配制Ⅳ型胶原酶：称重100mgⅣ型胶原酶粉，使用100ml无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22μm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为1mg/ml，4℃保存备用；
6)配制海藻酸盐裂解酶：称重30mg海藻酸盐裂解酶粉，使用100ml无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22μm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为300μg/ml，4℃保存备用；
7)配制胶原溶液：
a)取﹣80℃保存下的2月龄SD大鼠的新鲜鼠尾，4℃解冻1h，埋于冰盒中，转移至生物安全柜中操作；
b)所有器械置于冰盒预冷4℃，1h，手术刀片切开鼠尾表皮并剥去鼠皮；使用血管钳，每间隔2cm折断鼠尾筋骨；
c)固定鼠尾根部，用刀片将鼠尾尖端约1.0cm长度切下，使用血管钳抽出鼠尾肌腱并转移至8℃冷水中；
d)对得到的鼠尾肌腱进行清理，去除其中含有的杂质，使用滤纸吸去多余的水分，至胶原成团无液体流出且其表面维持湿润的状态后，使用分析天平称重，以预冷的4℃的1:1000冰醋酸溶液按以1.1g：100ml的比例溶解鼠尾肌腱，置于磁力搅拌器上，4℃条件下缓慢溶解5天直至完全溶解；
e)将上一步得到的完全溶解鼠尾肌腱的1:1000冰醋酸溶液使用低温高速离心机，10000r/s离心2h后取上清，倒入150mm培养皿中，封口膜封闭，-80℃冷冻过夜，得冷冻的胶原溶液；
f)将完全冷冻的胶原溶液放入真空冷冻干燥机中，5天后收集白色絮状的胶原，﹣80℃保存；
g)取上一步得到的胶原，称重后于4℃溶解于1:1000冰醋酸溶液中，溶解浓度为12mg/ml；
h)按胶原溶液与氯仿体积比1:10加入氯仿消毒，10h后吸出胶原溶液，并避光敞口4h以挥发胶原中多余三氯甲烷，4℃保存待用；
步骤三：成胶及细胞包埋：
1)取消毒完成后的完全溶解的胶原溶液0.467ml转移至1.5mlEP管中，加入0.1ml的DEME细胞培养基混合，记为溶液1；
2)取4℃冷藏的0.2ml海藻酸钾溶液与0.129ml的DEME细胞培养基相混合，记为溶液2；
3)将0.05ml的钙离子交联液(CaCO3-GDL)、0.025ml的DEME细胞培养基及0.025ml的CaSO4溶液相混合，记为溶液3；
4)将溶液1、2混匀；
5)将使用胰酶消化并收集的细胞计数至6×105个/ml得细胞悬液，将所得细胞悬液加入步骤三第4)步所得到的溶液1、2的混合液中混匀；
6)在步骤三第5)步得到的混合液中加入溶液3进行钙离子的交联，观察到液体浑浊并有白色絮状沉淀产生；
7)在步骤三第6步得到的混合液中加入0.0107mlNaOH溶液，调节pH至中性，液体恢复均一清澈，无明显沉淀；
8)将成胶模具放入中皿中，加入步骤三第7)步得到的混合液后移入培养箱中，37.5℃条件下混合液固化成型，得到固化的水凝胶；
9)1h后将固化的水凝胶移出，移除模具。
根据上述步骤制得的水凝胶，可通过胶体溶解，获得经过三维培养的细胞样本用于后期实验，且证实了本发明制得的水凝胶具有良好的可降解性，具体操作如下：
1)使用无菌PBS清洗上一步制备得到的水凝胶三次，将水凝胶放入装有3-5mlⅣ型胶原酶、藻酸盐裂解酶按1:1体积比混合的混合溶液的15ml离心管中；
2)在36-38℃下，50-80r低速摇晃1-1.5h，即可完全溶解。
参见图4至图8，本发明在胶原水凝胶的基础上引入海藻酸盐后，进行钙离子交联，使用DEME细胞培养基作为溶剂，维持了良好的生物相容性、安全性，细胞在水凝胶中生长良好，状态稳定，增殖状态佳。

Claims (7)

1.一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法，其特征在于：制备一种适用于细胞三维培养的水凝胶的原料包括：胶原、海藻酸盐、钙离子交联液CaCO3-GDL、CaSO4、NaOH和DEME细胞培养基； 1mL水凝胶体系，各组份含量如下：
胶原：配制浓度为10-12mg/mL，体积为0.46-0.56mL；
海藻酸盐：配制浓度5-10mg/mL，体积为0.2mL；
钙离子交联液CaCO3-GDL：配制浓度为0.5-0.8mmol/L，体积为0.05mL；
CaSO4：配制浓度为1-1.5mmol/L，体积为0.025mL；
NaOH：配制浓度为2.2-2.8mmol/L，体积为0.0107-0.0128mL；
DEME细胞培养基：体积为0.152mL-0.254 mL；
一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法包括：
步骤一：借助3D打印，构建水凝胶成型模具，消毒后备用；
步骤二：分别配制水凝胶所需溶液，制备1mL水凝胶：
1）配制NaOH溶液：取NaOH粉末0.88-1.12g，放入干净的离心管内，加入10mL双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为2.2-2.8 mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22µm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
2）配制钙离子交联液CaCO3-GDL：取CaCO3-GDL粉末0.87-1.39g，放入干净的离心管内，加入10mL双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为0.5-0.8 mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22µm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
3）配制CaSO4溶液：取CaSO4粉末1.72-2.58g，放入干净的离心管内，加入10mL双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为1-1.5 mmol/L的溶液，封口，4℃保存备用；
4）配制海藻酸盐溶液：取海藻酸盐粉末0.05-0.1g，放入干净的广口瓶，加入10mL无血清DMEM培养基，终浓度为5-10mg/mL；在4℃条件下搅拌过夜，充分搅拌溶解后，于超净台内，用0.45µm的滤器过滤除菌；封口，4℃保存备用；
5）配制Ⅳ型胶原酶：称重80-100mgⅣ型胶原酶粉，使用100mL无血清高糖DMEM溶解，用0.22µm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为0.8-1 mg/mL；4℃保存备用；
6）配制海藻酸盐裂解酶：称重25-30mg海藻酸盐裂解酶粉，使用100mL无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22µm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为250-300μg/mL；4℃保存备用；
7）配制胶原溶液，配制浓度为10-12mg/mL，体积为0.46-0.56mL；
步骤三：成胶及细胞包埋
1）取消毒完成后的完全溶解的胶原溶液0.46-0.56mL转移至1.5mLEP管中，加入DEME细胞培养基0.1-0.15mL混合，记为溶液1；
2）取4℃冷藏的海藻酸盐溶液0.2mL与DEME细胞培养基0.05-0.07mL相混合，记为溶液2；
3）将0.05mL的钙离子交联液CaCO3-GDL、0.025mL 的DEME细胞培养基与0.025mL 的CaSO4溶液相混合，记为溶液3；
4）将溶液1、溶液2混匀；
5）将使用胰酶消化并收集的细胞计数至1-10×105个/mL得细胞悬液，将所得细胞悬液加入步骤三第4）步所得到溶液1、溶液2的混合液中混匀；
6）在步骤三第5）步得到的混合液中加入溶液3进行钙离子的交联，观察到液体浑浊并有白色絮状沉淀产生；
7）在步骤三第6）步得到的混合液中加入NaOH溶液0.0107-0.0128mL，调节pH至中性，液体恢复均一清澈，无明显沉淀；
8）将成型模具放入中皿中，加入在步骤三第7）步得到的混合液后移入培养箱中，36-38℃条件下混合液固化成型，得到固化的水凝胶；
9）40min-1h后将固化的水凝胶移出，移除模具。
2.根据权利要求1所述的一种适用于细胞三维培养的水凝胶，其特征在于：所述的海藻酸盐包括但不限于海藻酸钠、海藻酸钾。
3.根据权利要求1所述的一种适用于细胞三维培养的水凝胶，其特征在于：所述的胶原为从新鲜鼠尾、牛跟腱或猪皮中提取。
4.根据权利要求1所述的一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法，其特征在于：所述步骤二第7）步配制胶原溶液的具体方法为：
a）取﹣80℃保存下的2月龄SD大鼠的新鲜鼠尾，4℃解冻0.5-1h，埋于冰盒中，转移至生物安全柜中操作；
b）所有器械置于冰盒预冷4℃，0.5-1h，手术刀片切开鼠尾表皮并剥去鼠皮，使用血管钳，每间隔1.5-2.0cm折断鼠尾筋骨；
c）固定鼠尾根部，用刀片将鼠尾尖端0.5-1.0cm长度切下，使用血管钳抽出鼠尾肌腱并转移至4-8℃冷水中；
d）对得到的鼠尾肌腱进行清理，去除其中含有的杂质，使用滤纸吸去多余的水分，至胶原成团无液体流出且其表面维持湿润的状态后，使用分析天平称重，预冷的4℃的1:1000冰醋酸溶液按1-1.2g：100mL的比例溶解鼠尾肌腱，置于磁力搅拌器上，4℃条件下缓慢溶解4-5天直至完全溶解；
e）将上一步得到的完全溶解鼠尾肌腱的1:1000冰醋酸溶液使用低温高速离心机，10000-12000r/s离心1.5-2h后取上清液，倒入100-150mm培养皿中，封口膜封闭，-80℃冷冻过夜，得冷冻的胶原溶液；
f）将完全冷冻的胶原溶液放入真空冷冻干燥机中，3-5天后收集白色絮状的胶原，﹣80℃保存；
g）取上一步得到的胶原，称重后于4℃溶解于1:1000冰醋酸溶液中，溶解浓度为10-12mg/mL；
h）按胶原溶液与氯仿体积比1:10加入氯仿消毒，8-12h后吸出胶原溶液，并避光敞口2-4h以挥发胶原中多余三氯甲烷，4℃保存待用。
5.根据权利要求1或4所述的一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
步骤一：借助3D打印，构建水凝胶成型模具，消毒后备用；
步骤二：分别配制水凝胶所需溶液，制备1mL水凝胶：
1）配制NaOH溶液：取NaOH粉末0.96g，放入干净的离心管内，加入10mL双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为2.4 mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22µm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
2）配制钙离子交联液CaCO3-GDL：取CaCO3-GDL粉末0.87g，放入干净的离心管内，加入10mL双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为0.5 mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22µm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
3）配制CaSO4溶液：取CaSO4粉末1.72g，放入干净的离心管内，加入10mL双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为1mmol/L的溶液，封口，4℃保存备用；
4）配制海藻酸钠溶液：取海藻酸钠粉末0.05g，放入干净的广口瓶，加入10mL无血清DMEM培养基，终浓度为5mg/mL；在4℃条件下搅拌过夜，充分搅拌溶解后，于超净台内，用0.45µm的滤器过滤除菌，封口，4℃保存备用；
5）配制Ⅳ型胶原酶：称重80mgⅣ型胶原酶粉，使用100mL无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22µm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为0.8mg/mL；4℃保存备用；
6）配制海藻酸盐裂解酶：称重25mg海藻酸盐裂解酶粉，使用100mL无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22µm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为250μg/mL，4℃保存备用；
7）配制胶原溶液：
a) 取﹣80℃保存下的2月龄SD大鼠的新鲜鼠尾，4℃解冻0.5h，埋于冰盒中，转移至生物安全柜中操作；
b) 所有器械置于冰盒预冷4℃，0.5h，手术刀片切开鼠尾表皮并剥去鼠皮，使用血管钳，每间隔1.5cm折断鼠尾筋骨；
c) 固定鼠尾根部，用刀片将鼠尾尖端0.5cm长度切下，使用血管钳抽出鼠尾肌腱并转移至4℃冷水中；
d) 对得到的鼠尾肌腱进行仔细的清理，去除其中含有的杂质，使用滤纸吸去多余的水分，至胶原成团无液体流出且其表面维持湿润的状态后，使用分析天平称重，预冷的4℃的1:1000冰醋酸溶液按1g：100mL的比例溶解鼠尾肌腱，置于磁力搅拌器上，4℃条件下缓慢溶解4天直至完全溶解；
e) 将上一步得到的完全溶解鼠尾肌腱的1:1000冰醋酸溶液使用低温高速离心机，11000r/s离心1.5h后取上清液，倒入培养皿中，封口膜封闭，-80℃冷冻过夜，得冷冻的胶原溶液；
f) 将完全冷冻的胶原溶液放入真空冷冻干燥机中，3天后收集白色絮状的胶原，﹣80℃保存；
g) 取上一步得到的胶原，称重后于4℃溶解于1:1000冰醋酸溶液中，溶解浓度为10mg/mL；
h) 按胶原溶液与氯仿体积比1:10加入氯仿消毒，10h后吸出胶原溶液，并避光敞口2h以挥发胶原中多余三氯甲烷；4℃保存待用；
步骤三：成胶及细胞包埋：
1）取消毒完成后的完全溶解的胶原溶液0.56mL转移至1.5mLEP管中，加入DEME细胞培养基0.1mL混合，记为溶液1；
2）取4℃冷藏的0.2mL海藻酸钠溶液与0.027mL的DEME细胞培养基相混合，记为溶液2；
3）将0.05mL的钙离子交联液CaCO3-GDL、0.025mL 的DEME细胞培养基及0.025mL 的CaSO4溶液相混合，记为溶液3；
4）将溶液1、溶液2混匀；
5）将使用胰酶消化并收集的细胞计数至5×105个/mL得细胞悬液，将所得细胞悬液加入步骤三第4）步所得到的溶液1、溶液2的混合液中混匀；
6）在步骤三第5）步得到的混合液中加入溶液3进行钙离子的交联，观察到液体浑浊并有白色絮状沉淀产生；
7）在步骤三第6）步得到的混合液中加入NaOH溶液0.0128mL，调节pH至中性，液体恢复均一清澈，无明显沉淀；
8）将成胶模具放入中皿中，加入步骤三第7）步得到的混合液后移入培养箱中，36.5℃条件下混合液固化成型，得到固化的水凝胶；
9）40min后将固化的水凝胶移出，移除模具。
6.根据权利要求1或4所述的一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
步骤一：借助3D打印，构建水凝胶成型的模具，消毒后备用；
步骤二：分别配制水凝胶所需溶液，制备1mL水凝胶：
1）配制NaOH溶液：取NaOH粉末1.04g，放入干净的离心管内，加入10mL双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为2.6 mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22µm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
2）配制钙离子交联液CaCO3-GDL：取CaCO3-GDL粉末1.22g，放入干净的离心管内，加入10mL双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为0.7 mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22µm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
3）配制CaSO4溶液：取CaSO4粉末2.06g，放入干净的离心管内，加入10mL双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为1.2 mmol/L的溶液；封口，4℃保存；
4）配制海藻酸钠溶液：取海藻酸钠粉末0.08g，放入干净的广口瓶，加入10mL无血清DMEM培养基，终浓度为8mg/mL；在4℃条件下搅拌过夜，充分搅拌溶解后，于超净台内，用0.45µm的滤器过滤除菌，封口，4℃保存备用；
5）配制Ⅳ型胶原酶：称重90mgⅣ型胶原酶粉，使用100mL无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22µm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为0.9mg/mL，4℃保存备用；
6）配制海藻酸盐裂解酶：称重28mg海藻酸盐裂解酶粉，使用100mL无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22µm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为280μg/mL，4℃保存备用；
7）配制胶原溶液：
a) 取﹣80℃保存下的2月龄SD大鼠的新鲜鼠尾，4℃解冻0.75h，埋于冰盒中，转移至生物安全柜中操作；
b) 所有器械置于冰盒预冷4℃，0.75h，手术刀片切开鼠尾表皮并剥去鼠皮，使用血管钳，每间隔1.8cm折断鼠尾筋骨；
c) 固定鼠尾根部，用刀片将鼠尾尖端0.7cm长度切下，使用血管钳抽出鼠尾肌腱并转移至6℃冷水中；
d) 对得到的鼠尾肌腱进行仔细的清理，去除其中含有的杂质，使用滤纸吸去多余的水分，至胶原成团无液体流出且其表面维持湿润的状态后，使用分析天平称重，预冷的4℃的1:1000冰醋酸溶液以1.2g：100mL的比例溶解鼠尾肌腱，置于磁力搅拌器上，4℃条件下缓慢溶解4天直至完全溶解；
e) 将上一步得到的完全溶解鼠尾肌腱的1:1000冰醋酸溶液使用低温高速离心机，12000r/s离心1.h后取上清液，倒入150mm培养皿中，封口膜封闭，-80℃冷冻过夜，得冷冻的胶原溶液；
f) 将完全冷冻的胶原溶液放入真空冷冻干燥机中，4天后收集白色絮状的胶原，﹣80℃保存；
g) 取上一步得到的胶原，称重后于4℃溶解于1:1000冰醋酸溶液中，溶解浓度为11mg/mL；
h) 按胶原溶液与氯仿体积比1:10加入氯仿消毒，10h后吸出胶原溶液，并避光敞口3h以挥发胶原中多余三氯甲烷，4℃保存待用；
步骤三：成胶及细胞包埋：
1）取消毒完成后的完全溶解的胶原溶液0.509mL转移至1.5mLEP管中，加入0.1mL的DEME细胞培养基混合，记为溶液1；
2）取4℃冷藏的0.2mL的海藻酸钠溶液与0.079mL的DEME细胞培养基相混合，记为溶液2；
3）将钙离子交联液CaCO3-GDL0.05mL、DEME细胞培养基0.025mL及CaSO4悬浊液0.025mL相混合，记为溶液3；
4）将溶液1、2混匀；
5）将使用胰酶消化并收集的细胞计数至6×105个/mL后得细胞悬液，将所得细胞悬液加入步骤三第4）步所得到的溶液1、2的混合液中混匀；
6）在步骤三第5）步得到的混合液中加入溶液3进行钙离子的交联，观察到液体浑浊并有白色絮状沉淀产生；
7）在步骤三第6）步得到的混合液中加入0.0117mL的NaOH溶液，调节pH至中性，液体恢复均一清澈，无明显沉淀；
8）将成胶模具放入中皿中，加入在步骤三第7）步得到的混合液后移入培养箱中，37℃条件下混合液固化成型，得到固化的水凝胶；
9）50min后将固化的水凝胶移出，移除模具。
7.根据权利要求1或4所述的一种适用于细胞三维培养的水凝胶的制备方法，其特征在于：具体步骤为：
步骤一：借助3D打印，构建水凝胶成型模具，消毒后备用；
步骤二：分别配制水凝胶所需溶液，制备1mL水凝胶：
1）配制NaOH溶液：取NaOH粉末1.12g，放入干净的离心管内，加入10mL双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为2.8mmol/L；于超净台内，用0.22µm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
2）配制钙离子交联液CaCO3-GDL：取CaCO3-GDL粉末1.39g，放入干净的离心管内，加入10mL双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为0.8mmol/L的溶液；于超净台内，用0.22µm的滤器过滤除菌；将无菌溶液装至干净的离心管内，封口，4℃保存备用；
3）配制CaSO4溶液：取CaSO4粉末2.58g，放入干净的离心管内，加入10mL双蒸水，充分溶解混匀，配成浓度为1.5mmol/L的溶液，封口，4℃保存备用；
4）配制海藻酸钾溶液：取海藻酸钾粉末0.1g，放入干净的广口瓶，加入10mL无血清DMEM培养基，终浓度为10mg/mL，在4℃条件下搅拌过夜，充分搅拌溶解后，于超净台内，用0.45µm的滤器过滤除菌；封口，4℃保存备用；
5）配制Ⅳ型胶原酶：称重100mgⅣ型胶原酶粉，使用100mL无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22µm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为1mg/mL，4℃保存备用；
6）配制海藻酸盐裂解酶：称重30mg海藻酸盐裂解酶粉，使用100mL无血清高糖DMEM培养基溶解，用0.22µm的滤器过滤除菌后备用，使其终浓度为300μg/mL，4℃保存备用；
7）配制胶原溶液：
a) 取﹣80℃保存下的2月龄SD大鼠的新鲜鼠尾，4℃解冻1h，埋于冰盒中，转移至生物安全柜中操作；
b) 所有器械置于冰盒预冷4℃，1h，手术刀片切开鼠尾表皮并剥去鼠皮；使用血管钳，每间隔2cm折断鼠尾筋骨；
c) 固定鼠尾根部，用刀片将鼠尾尖端1.0cm长度切下，使用血管钳抽出鼠尾肌腱并转移至8℃冷水中；
d) 对得到的鼠尾肌腱进行清理，去除其中含有的杂质，使用滤纸吸去多余的水分，至胶原成团无液体流出且其表面维持湿润的状态后，使用分析天平称重，以预冷的4℃的1:1000冰醋酸溶液，按1.1g：100mL的比例溶解鼠尾肌腱，置于磁力搅拌器上，4℃条件下缓慢溶解5天直至完全溶解；
e) 将上一步得到的完全溶解鼠尾肌腱的1:1000冰醋酸溶液使用低温高速离心机，10000r/s离心2h后取上清，倒入150mm培养皿中，封口膜封闭，-80℃冷冻过夜，得冷冻的胶原溶液；
f) 将完全冷冻的胶原溶液放入真空冷冻干燥机中，5天后收集白色絮状的胶原，﹣80℃保存；
g) 取上一步得到的胶原，称重后于4℃溶解于1:1000冰醋酸溶液中，溶解浓度为12mg/mL；
h) 按胶原溶液与氯仿体积比1:10加入氯仿消毒，10h后吸出胶原溶液，并避光敞口4h以挥发胶原中多余三氯甲烷，4℃保存待用；
步骤三：成胶及细胞包埋：
1）取消毒完成后的完全溶解的胶原溶液0.467mL转移至1.5mLEP管中，加入0.1mL的DEME细胞培养基混合，记为溶液1；
2）取4℃冷藏的0.2mL海藻酸钾溶液与0.129mL的DEME细胞培养基相混合，记为溶液2；
3）将0.05mL的钙离子交联液CaCO3-GDL、0.025mL的 DEME细胞培养基及0.025mL 的CaSO4悬浊液相混合，记为溶液3；
4）将溶液1、2混匀；
5）将使用胰酶消化并收集的细胞计数至6×105个/mL得细胞悬液，将所得细胞悬液加入步骤三第4）步所得到的溶液1、2的混合液中混匀；
6）在步骤三第5）步得到的混合液中加入溶液3进行钙离子的交联，观察到液体浑浊并有白色絮状沉淀产生；
7）在步骤三第6）步得到的混合液中加入0.0107mLNaOH溶液，调节pH至中性，液体恢复均一清澈，无明显沉淀；
8）将成胶模具放入中皿中，加入步骤三第7）步得到的混合液后移入培养箱中，37.5℃条件下混合液固化成型，得到固化的水凝胶；
9）1h后将固化的水凝胶移出，移除模具。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113402734B (zh) * 2021-06-17 2023-04-18 东北农业大学 一种可用于冷却肉新鲜度指示的水凝胶制备方法及应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012080706A3 (en) * 2010-12-16 2012-09-27 Imperial Innovations Limited Layered fibrous construct
CN104271168A (zh) * 2012-03-06 2015-01-07 Uab研究基金会 三维的预血管化的工程化的组织建造物、制造以及使用组织建造物的方法
CN109999226A (zh) * 2018-11-27 2019-07-12 王翀 一种打印材料、负载干细胞的骨组织工程支架及制备方法
CN110478527A (zh) * 2018-05-14 2019-11-22 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种负载软骨细胞抗炎半月板支架的生物三维打印制备方法
CN111315811A (zh) * 2017-04-10 2020-06-19 时威尔生物科学 用于细胞培养和生物医学应用的水凝胶

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6497902B1 (en) * 1999-12-01 2002-12-24 The Regents Of The University Of Michigan Ionically crosslinked hydrogels with adjustable gelation time
EP3103485A1 (en) * 2015-06-11 2016-12-14 Commissariat A L'energie Atomique Et Aux Energies Alternatives Material comprising a polymer capable of forming a hydrogel and nanoparticles
CN106693031B (zh) * 2015-11-16 2020-05-29 天津工业大学 一种可以控制伤口pH值的智能敷料及其制备方法
CN105926084B (zh) * 2016-04-28 2018-04-17 东华大学 一种负载稀土离子的海藻酸钠纤维催化材料及其制备方法
CN106117570B (zh) * 2016-06-24 2018-11-23 武汉理工大学 一种负载聚酰胺-胺树状分子的海藻酸钠抗菌水凝胶及其制备方法和应用
GB201620204D0 (en) * 2016-11-29 2017-01-11 Fujifilm Mfg Europe Bv Hydrogels
CN106492260B (zh) * 2016-12-22 2020-08-07 青岛琛蓝海洋生物工程有限公司 一种海藻酸盐基水凝胶敷料及其制备方法
CN109550072A (zh) * 2018-10-18 2019-04-02 青岛即发集团股份有限公司 吸液溶胀的海藻酸盐壳聚糖复合纤维及其制备方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012080706A3 (en) * 2010-12-16 2012-09-27 Imperial Innovations Limited Layered fibrous construct
CN104271168A (zh) * 2012-03-06 2015-01-07 Uab研究基金会 三维的预血管化的工程化的组织建造物、制造以及使用组织建造物的方法
CN111315811A (zh) * 2017-04-10 2020-06-19 时威尔生物科学 用于细胞培养和生物医学应用的水凝胶
CN110478527A (zh) * 2018-05-14 2019-11-22 上海交通大学医学院附属第九人民医院 一种负载软骨细胞抗炎半月板支架的生物三维打印制备方法
CN109999226A (zh) * 2018-11-27 2019-07-12 王翀 一种打印材料、负载干细胞的骨组织工程支架及制备方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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Hybrid collagen alginate hydrogel as a platform for 3D tumor spheroid invasion;Chun Liu et al;《Acta Biomaterialia》;20180605;第213–225页 *

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