CN104107458A - 一种促消化道粘膜修复材料及其制备方法和用途 - Google Patents
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Landscapes
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Abstract
本发明公开了一种促消化道粘膜修复的材料，它是由京尼平交联小肠黏膜下层制备而成，小肠黏膜下层经过京尼平交联后的交联指数为30%～100%。本发明还公开前述促消化道粘膜修复材料的制备方法及其用途。本发明促消化道粘膜修复的材料具有良好的抗酸、抗胃蛋白酶降解性能，溶血性低，无细胞毒性，力学性能优良。
Description
技术领域
本发明涉及一种修复材料，特别是消化道粘膜修复材料。
背景技术
消化道溃疡，主要指发生在胃和十二指肠的慢性溃疡，亦可发生于食管下段、胃空肠吻合口周围及含有异位胃粘膜的美克尔（MECKEL）憩室，这些溃疡的形成与胃酸和胃蛋白酶的消化作用有关，故称消化性溃疡。消化道溃疡是临床上消化系统常见病症之一，近年来随着生活节奏的加快，饮食结构的改变以及进食时间的不规律，发病率逐渐上升。消化道溃疡的发生与很多因素有关，临床上常见的病因有胃酸分泌过多、胆汁反流、HP(幽门螺旋杆菌)感染、胃黏膜防御能力下降等。该病病程漫长，若不能给予有效治疗，长期发展可导致胃癌，严重影响患者生命安全。
临床上治疗消化道溃疡的方式主要有保守治疗方式和手术治疗方式。保守治疗方式的药效温和，痛苦小，但见效较慢，治疗常常不彻底，而且复发率较高，每一次复发，病情一般比上一次更为严重，因此患者不得不加大用药剂量，或换用其他药物治疗，长此以往，机体耐药性增加，临床效果却并不一定有显著改善。手术治疗方式见效快，治疗较为彻底，但创伤较大，并发症较为明显。近年来随着材料学以及内镜技术的不断发展，国内外研究者已将重点转移到利用内镜技术将生物材料送至消化道溃疡处，来达到修复损伤黏膜的目的，这将有望既彻底地治愈消化道溃疡，又减少手术巨大创伤带来的痛苦，同时达到诊断治疗一体化。
小肠黏膜下层（small intestinal submucosa，SIS）是一种天然的细胞外基质类生物材料，通常由猪小肠制备。SIS主要含有胶原、氨基多糖、糖蛋白等成分，适宜上皮细胞的黏附和生长，其所包含的血管内皮生长因子（vascularendothelial growth factor，VEGF）、成纤维细胞生长因子（fibroblast growthfactors，FGF）等还能促进修复组织的血管化，诱导宿主细胞和组织的迁移。SIS是当前广泛用于组织工程研究的天然细胞外基质类生物材料，具有良好的细胞相容性、含有多种生长因子、无免疫原性、具有抗微生物活性、各向异性、组织特异性诱导再生等特点，是较为理想的黏膜修复材料。然而，将SIS用于消化道黏膜的修复材料仍存在一些明显的缺陷，如遇水易变形，容易被强酸和胃蛋白酶降解，摩擦系数低等，导致SIS难以用内镜输送，到达病灶处容易过早降解而失去功能。
发明内容
为了克服上述缺陷，本发明提供了一种新的促消化道粘膜修复材料及其制备方法。
本发明促消化道粘膜修复材料，它是含有京尼平的小肠黏膜下层，具体是由京尼平交联小肠黏膜下层制备而成，小肠黏膜下层经过京尼平交联后的交联指数为30%～100%。
交联指数，表征高分子链的交联程度。
优选地，所述交联指数为30.63%～86.52%。进一步优选地，所述交联指数为67.28%～86.52%。再进一步优选地，所述交联指数为67.28%～85.22%。最优选地，所述交联指数为83.74～85.22%或者67.28～69.92%。
所述修复材料由如下方法制备而成：
（1）取京尼平溶于缓冲液，制成浓度不低于0.01%（w/v）的京尼平溶液；
（2）将小肠黏膜下层浸泡于步骤（1）制得的京尼平溶液中，浸泡时间不低于3h；
（3）取出小肠黏膜下层，清洗，冷冻干燥，即得。
步骤（1）中，所述缓冲液的pH为4～11。优选地，所述缓冲液的pH为7.2。
步骤（1）中，所述缓冲液为PBS溶液。
骤（1）中，京尼平溶液的浓度为0.01～0.6%（w/v）。优选地，所述京尼平溶液的浓度为0.05～0.6%（w/v）。进一步优选地，所述京尼平溶液的浓度为0.05～0.3%（w/v）。再进一步优选地，所述京尼平溶液的浓度为0.3%（w/v）。
步骤（2）中，小肠黏膜下层表面积与京尼平溶液体积的比值为（200～3）:1。
步骤（2）中，浸泡时间为3～24h。
步骤（2）中，浸泡的温度为4℃～65℃。优选地，所述浸泡的温度为37℃。
本发明促消化道粘膜修复材料的方法，包括如下步骤：
（1）取京尼平溶于缓冲液，制成浓度不低于0.01%（w/v）的京尼平溶液；
（2）将小肠黏膜下层浸泡于步骤（1）制得的京尼平溶液中，浸泡时间不低于3h；
（3）取出小肠黏膜下层，清洗，冷冻干燥，即得。
步骤（1）中，所述缓冲液的pH为4～11。优选地，所述缓冲液的pH为7.2。
步骤（1）中，所述缓冲液为PBS溶液。
骤（1）中，京尼平溶液的浓度为0.01～0.6%（w/v）。优选地，所述京尼平溶液的浓度为0.05～0.6%（w/v）。进一步优选地，所述京尼平溶液的浓度为0.05～0.3%（w/v）。再进一步优选地，所述京尼平溶液的浓度为0.3%（w/v）或者0.05%（w/v）。
步骤（2）中，小肠黏膜下层表面积与京尼平溶液体积的比值为（200～3）:1。
步骤（2）中，浸泡时间为3～24h。
步骤（2）中，浸泡的温度为4℃～65℃。优选地，所述浸泡的温度为37℃。
本发明还提供了前述修复材料在制备修复消化道损伤的材料中的用途。
本发明促消化道修复材料，具有抗胃液中强酸和胃蛋白酶分解的特性，力学性能优良，无细胞毒性，溶血率低，组织相容性性好，孔径大小合适，适于细胞生长，同时含有大量生长因子，体内修复无明显钙化现象，使用安全，为消化道粘膜修复提供了一种新的选择，制备方法简单，具有广阔的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1SIS膜。其中，A：新鲜制备的SIS膜呈半透明状；B：冻干后SIS膜呈白色纸状；
图2京尼平交联SIS后交联指数。（*P＜0.05表示各组与SIS相比较有统计学差异；#P＜0.05，表示各交联组与0.01%交联组相比较有统计学差
异）。
图3京尼平交联后SIS在人工胃液中不同时间段降解情况。1：SIS+人工胃液；2：SIS+PBS；3：0.01%GP交联SIS+人工胃液；4：0.05%GP交联SIS+人工胃液；5：0.1%GP交联SIS+人工胃液；6：0.3%GP交联SIS+人工胃液；7：0.5%GP交联SIS+人工胃液；8：0.6%GP交联SIS+人工胃液
图4京尼平交联后SIS在人工胃液中2周，4周，8周降解的宏观观察。
图5SIS交联指数与京尼平交联时间的关系。（*P<0.05表示在京尼平溶液中交联24h组与京尼平溶液中交联12h组的交联指数有统计学差异）
图6SIS交联指数与交联温度的关系。（*P<0.05表示37℃京尼平溶液交联组与25℃京尼平交联组的交联指数有统计学差异）
图7SIS及不同浓度京尼平交联SIS的溶胀率。（*P<0.05表示与未交联SIS组相比有统计学差异；#P<0.05表示与0.05%组相比存在统计学差异）
图8SIS及不同浓度京尼平交联SIS的红外扫描图谱。
图9京尼平交联后SIS极限抗张强度测试。（*P＜0.05表示各组与SIS相比较有统计学差异，#P＜0.05，表示各交联组与0.5%交联组相比较有统计学差异）。
图10SIS及不同浓度京尼平交联SIS在人工胃液中浸泡0周，2周，4周和8周后极限抗张强度测试。（*P＜0.05表示各组与SIS相比较有统计学差异，#P<0.05表示与对应0周组有统计学差异）。
图11SIS及不同浓度京尼平交联SIS在人工胃液中浸泡0周，2周，4周和8周后刚度测试。
图12ELISA法检测SIS及浓度为0.3%京尼平交联组SIS中VEGF和TGF-β1在14天内释放情况。
图13京尼平交联后SIS扫描电镜图。A：未交联SIS；B：0.05%GP交联材料；C：0.1%GP交联材料；D：0.3%GP交联材料；E：0.5%GP交联的材料。
图14人胃粘膜上皮细胞GES-1接种到SIS及不同浓度京尼平交联的SIS上3天后活细胞染色。a-e为40倍下观察到的细胞。a:未交联SIS;b:0.05%GP交联材料；c：0.1%GP交联材料；d：0.3%GP交联材料；e：0.5%GP交联的材料。f-j为100倍下观察到的细胞。f:未交联SIS；g:0.05%GP交联材料；h：0.1%GP交联材料；i：0.3%GP交联材料；j：0.5%GP交联的材料。
图15促消化道粘膜修复材料浸提液溶血情况。1：阴性对照；2：阳性对照；3：未交联SIS浸提液；4：0.05%GP交联材料浸提液；5：0.1%GP交联材料浸提液；6：0.3%GP交联材料浸提液；7：0.5%GP交联材料浸提液。
图16SD大鼠背部皮下植入SIS及不同浓度京尼平交联SIS材料组织学观察。图(a)-(e)材料第2周时炎性细胞情况。(a):未交联SIS;(b):0.05%GP交联材料；(c)：0.1%GP交联材料；(d)：0.3%GP交联材料；(e)：0.5%GP交联的材料。图(f)-(j)材料第2周时炎性细胞情况。(f):未交联SIS;(g):0.05%GP交联材料；(h)：0.1%GP交联材料；(i)：0.3%GP交联材料；(j)：0.5%GP交联的材料。*表示SIS所在位置，#表示京尼平交联SIS所在位置。
图17SD大鼠背部皮下植入复合材料，应用Image–Proplus6.0软件炎性细胞计数。（*：同一时间点内与SIS组比较，P＜0.05有统计学差异；#：同一时间点内与SIS组比较，P＜0.05有统计学差异；☆：同一时间点内与SIS组比较，P＜0.05有统计学差异）。
具体实施方式
缩略语：
SIS：小肠黏膜下层；GP：京尼平；DMEM：Dulbecco改良的Eagle培养基；FBS:胎牛血清；MTT：3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐
实施例1本发明促消化道粘膜修复材料的制备
一、本发明促消化道粘膜修复材料的制备
1、SIS的制备
本发明SIS可以购买市售品，也可以按照如下方法制备。
（1）清洗整理：取屠宰后半个小时的新鲜猪小肠，用水冲去小肠内容物，翻转小肠，加入盐揉搓后用水反复冲洗3次，用手术刀剖开小肠，然后剪成15厘米长的肠段。
（2）分离出SIS：用压舌板刮除肌层，浆膜层，置于生理盐水中4℃保存过夜。
（3）脱脂：用去离子水漂洗干净后用纱布滤干水。浸入三氯甲烷-甲醇的混合液中，三氯甲烷：甲醇的比值为1：1，置于通风橱里4小时，平均2小时换一次液，并且每半个小时搅拌一次。
（4）脱细胞：将脱脂后的SIS用去离子水漂洗20次，反复清洗，漂至无味。然后放入浓度为0.25%的胰蛋白酶液里，4℃脱细胞处理过夜。
（5）用去离子水漂洗10次后用0.5%的SDS处理至少4小时，清洗，制得新鲜的SIS膜，如图1A所示。
（6）冻干：清洗后依次置于-20℃，-40℃，-80℃中依次预冻后在真空冷冻干燥机中冻干保存，制得冻干后的SIS膜，如图1B所示。
2、本发明消化道粘膜修复材料的制备
（1）称取粉末状GP溶于PBS（pH=7.2）溶液中，充分搅拌，使GP完全溶解，分别制成质量体积比为0.01%，0.05%，0.1%，0.3%，0.5%，0.6%的GP溶液。
（2）将制备的SIS浸泡到GP溶液中，在37℃的恒温摇床上交联24h。
（3）将交联后的SIS从GP溶液中取出，用PBS溶液反复冲洗，至少5次，并浸泡在PBS溶液中24h。
（4）将交联后的SIS从PBS溶液中取出，用蒸馏水反复冲洗，至少5次，并浸泡在蒸馏水中24h。
（5）将SIS从蒸馏水中取出，冷冻干燥即得本发明消化道粘膜修复材料。
二、本发明促消化道粘膜修复材料的检测
1、检测方法
（1）交联指数（CI）的测定：
①茚三酮反应液的制备：将1.05g的柠檬酸和10ml(1.0M)的NaOH和0.04g的氯化亚锡(SnCl2·2H2O)混合，加去离子水调至25ml，另将1g的茚三酮加入25ml乙二醇甲醚中，再将上述两液体混合搅拌45min，制成茚三酮溶液，存于黑瓶中备用。
②分别称取各交联组SIS以及未交联SIS样品1.5mg，加入茚三酮溶液1ml，100℃下水浴加热20min，冷却至室温，加15ml异丙醇(isopropylglyeoho1)，用分光光度计在570nm下测量吸光度。样品中的自由氨基加热后与茚三酮发生反应，生成的蓝紫色色素与吸光度成正比。在不同浓度的甘氨酸制得的标准曲线中查得不同样本中自由氨基的含量。所有反应均在暗室中进行。以MSIS组表示未交联的SIS中含自由α-氨基酸摩尔数，MGP组表示各组样品中α-氨基酸摩尔数，按以下公式计算各组材料的交联度：
CI=(MSIS－MGP)/MSIS×100％
（2）抗酸抗酶解性能检测
为进一步确定适宜的GP交联浓度，将制得的不同浓度GP交联的SIS浸泡到人工胃液中，观察其抗酸抗酶解的情况。
①人工胃液的配制
称取2.0g的NaCl和3.2g的胃蛋白酶（来自于猪的胃粘膜，胃蛋白酶的酶活为800-2500U/mg），溶于7ml的浓盐酸，加水稀释至1000ml，pH约为1.2。
②整体降解情况
将未交联的SIS以及各交联组的SIS制成2cm×2cm的样品，每组选取3片，浸泡在人工胃液中，每隔两天换液，37℃条件下观察3周的降解情况。
结果如图3所示，1组：SIS+人工胃液；2组：SIS+PBS；3组：0.01%GP交联SIS+人工胃液；4组：0.05%GP交联SIS+人工胃液；5组；0.1%GP交联SIS+人工胃液；6组：0.3%GP交联SIS+人工胃液；7组：0.5%GP交联SIS+人工胃液；8组：0.6%GP交联SIS+人工胃液。
③降解率测定
将未交联的SIS以及浓度为0.05%，0.1%，0.3%和0.5%京尼平交联的SIS制成直径为16mm的圆片，每3片浸泡在人工胃液中，每隔两天换液，37℃条件下处理8周。分别测定2周，4周，8周时材料的剩余质量百分比。
统计方法：采用SPSS16.0软件，用独立样本T检验统计。
2、检测结果
结果如图2～4和表1所示：
表1本发明促消化道粘膜修复材料的交联指数和抗酸抗酶解性能
通过统计学分析交联指数，各个交联组与未交联的SIS相比，均有统计学差异（P＜0.05）；在交联组中，0.05%至0.6%交联组与0.01%组相比均具有统计学差异（P＜0.05）。“—”表示未检测。“#”表示与与0.5%组相比有统计学差异（P<0.05）。
从图2和表1可以看出，采用本发明方法制备的修复材料，小肠黏膜下层的交联指数为30.63%～86%，随着京尼平浓度的增加，交指数先增加后降低，京尼平浓度为0.5%时，交联指数最高。
从图3～4和表1可以看出，单纯的SIS在1天内就全部降解，而本发明经过京尼平交联的修复材料在处理2周时，材料残留率为49.93%～96.5%，可以有效抗酸抗酶解。其中，京尼平浓度为0.05%～0.6%时，交联指数为67.28%～86.52%，材料的抗酸抗酶解性能优良，处理8周时，材料残留率高达89.91%～93.51%；京尼平浓度为0.05%～0.3%时，交联指数为67.28%～85.22%，材料的抗酸抗酶解性能优良，处理8周时，材料残留率也高达89.91%～93.51%，而且用的京尼平的量较少；京尼平浓度为0.05%时，交联指数为68.6±1.32%，修复材料的抗酸抗酶解性能优良，京尼平用量很少；京尼平浓度为0.3%时，交联指数为84.48±0.74%，修复材料的抗酸抗酶解性能最佳。
实验结果说明，本发明促消化道修复材料可以有效抗酸抗酶解，可用于制备消化道修复材料。
实施例2本发明促消化道粘膜修复材料的制备
一、本发明促消化道粘膜修复材料的制备
1、SIS的制备
本发明SIS可以购买市售品，也可以按照如下方法制备。
（1）清洗整理：取屠宰后半个小时的新鲜猪小肠，用水冲去小肠内容物，翻转小肠，加入盐揉搓后用水反复冲洗3次，用手术刀剖开小肠，然后剪成15厘米长的肠段。
（2）分离出SIS：用压舌板刮除肌层，浆膜层，置于生理盐水中4℃保存过夜。
（3）脱脂：用去离子水漂洗干净后用纱布滤干水。浸入三氯甲烷-甲醇的混合液中，三氯甲烷：甲醇的比值为1：1，置于通风橱里4小时，平均2小时换一次液，并且每半个小时搅拌一次。
（4）脱细胞：将脱脂后的SIS用去离子水漂洗20次，反复清洗，漂至无味。然后放入浓度为0.25%的胰蛋白酶液里，4℃脱细胞处理过夜。
（5）用去离子水漂洗10次后用0.5%的SDS处理至少4小时，清洗，制得新鲜的SIS膜，如图1A所示。
（6）冻干：清洗后依次置于-20℃，-40℃，-80℃中依次预冻后在真空冷冻干燥机中冻干保存，制得冻干后的SIS膜，如图1B所示。
2、本发明消化道粘膜修复材料的制备
（1）称取粉末状GP溶于PBS（pH=4.0）溶液中，充分搅拌，使GP完全溶解，分别制成质量体积比为0.3%的GP溶液。
（2）将制备的SIS浸泡到GP溶液中，小肠黏膜下层表面积与京尼平溶液体积的比值为200:1（cm2:ml），在37℃的恒温摇床上交联24h。
（3）将交联后的SIS从GP溶液中取出，用PBS溶液反复冲洗，至少5次，并浸泡在PBS溶液中24h。
（4）将交联后的SIS从PBS溶液中取出，用蒸馏水反复冲洗，至少5次，并浸泡在蒸馏水中24h。
（5）将SIS从蒸馏水中取出，冷冻干燥即得本发明消化道粘膜修复材料。
实施例3本发明促消化道粘膜修复材料的制备
一、本发明促消化道粘膜修复材料的制备
1、SIS的制备
本发明SIS可以购买市售品，也可以按照如下方法制备。
（1）清洗整理：取屠宰后半个小时的新鲜猪小肠，用水冲去小肠内容物，翻转小肠，加入盐揉搓后用水反复冲洗3次，用手术刀剖开小肠，然后剪成15厘米长的肠段。
（2）分离出SIS：用压舌板刮除肌层，浆膜层，置于生理盐水中4℃保存过夜。
（3）脱脂：用去离子水漂洗干净后用纱布滤干水。浸入三氯甲烷-甲醇的混合液中，三氯甲烷：甲醇的比值为1：1，置于通风橱里4小时，平均2小时换一次液，并且每半个小时搅拌一次。
（4）脱细胞：将脱脂后的SIS用去离子水漂洗20次，反复清洗，漂至无味。然后放入浓度为0.25%的胰蛋白酶液里，4℃脱细胞处理过夜。
（5）用去离子水漂洗10次后用0.5%的SDS处理至少4小时，清洗，制得新鲜的SIS膜，如图1A所示。
（6）冻干：清洗后依次置于-20℃，-40℃，-80℃中依次预冻后在真空冷冻干燥机中冻干保存，制得冻干后的SIS膜，如图1B所示。
2、本发明消化道粘膜修复材料的制备
（1）称取粉末状GP溶于碱性缓冲液（pH=11）溶液中，充分搅拌，使GP完全溶解，分别制成质量体积比为0.3%的GP溶液。
（2）将制备的SIS浸泡到GP溶液中，小肠黏膜下层表面积与京尼平溶液体积的比值为3:1（cm2:ml），在37℃的恒温摇床上交联24h。
（3）将交联后的SIS从GP溶液中取出，用PBS溶液反复冲洗，至少5次，并浸泡在PBS溶液中24h。
（4）将交联后的SIS从PBS溶液中取出，用蒸馏水反复冲洗，至少5次，并浸泡在蒸馏水中24h。
（5）将SIS从蒸馏水中取出，冷冻干燥即得本发明消化道粘膜修复材料。
实施例4本发明促消化道粘膜修复材料的参数筛选
1、实验方法
（1）促消化道粘膜修复材料交联时间的筛选
本发明促消化道粘膜修复材料的制备方法，除SIS浸泡在浓度为0.3%的京尼平溶液中，浸泡时间分别为0h，3h，6h，12h，24h，48h，72h，96h和120h以外，其余条件同同实施例1。
（2）促消化道粘膜修复材料交联温度的筛选
本发明促消化道粘膜修复材料的制备方法，除SIS浸泡在浓度为0.3%的京尼平溶液中，浸泡温度分别为4℃，16℃，25℃，37℃和56℃以外，其余条件同同实施例1。
2、实验结果
（1）交联时间
结果如图5和表2所示，
表2不同交联时间下SIS的交联指数
实验结果显示，在京尼平的浓度和温度一定，交联时间小于24h时，交联指数随着交联时间的延长而逐渐增加；当交联时间大于等于24小时，SIS的交联指数不再上升到达平台期，各个时间点的交联指数之间无统计学差异（P>0.05）。
实验结果说明，本发明消化道粘膜修复材料的方法中，交联时间可以为3h以上，优选为24～72h，最优选为24h。
（2）交联温度
结果如图6和表制备3所示，
表3不同温度下SIS交联指数
实验结果显示，在京尼平的浓度和交联时间一定时，SIS的交联指数随着温度的升高而逐渐增加；当交联温度超过37℃时，交联指数上升不明显。37℃和56℃下，SIS的交联指数没有明显的统计学差异（P>0.05）。
实验结果说明，本发明消化道粘膜修复材料的方法中，交联温度可以为4℃以上，优选为4℃～56℃，进一步优选为37℃～56℃，最优选为37℃。
实施例5本发明促消化道粘膜修复材料的性能检测
1、检测方法
实验材料：实施例1制备的SIS和本发明消化道粘膜修复材料。
（1）溶胀率的测定
将不同材料（2cm×2cm）分别浸泡在10ml PBS中，浸泡前测定材料重量，37℃浸泡24h后，吸干材料表面水分再测定材料的重量。溶胀率按如下公式进行计算：
Sw(%)=(Ws-Wi)/Wi×100%
Sw代表溶胀率，Ws代表材料吸水后的重量，Wi是材料的初始重量。
（2）红外光谱分析
将不同材料用美国Nicolet公司170SX型傅里叶变换红外光谱仪进行测试，扫描波数范围为4000～650cm-1。
（3）力学性能
①不同浓度京尼平交联后SIS力学性能测试
分别取各材料裁剪成1cm×4cm大小，各样品取8组进行单轴拉伸，测定极限抗张强度和刚度。
②人工胃液处理不同时间后，促消化道粘膜修复材料的力学性能
将各材料浸泡在人工胃液中，分别在2周，4周和8周将样品取出，洗涤冻干并将样品裁剪成1cm×4cm大小，各样品取8组进行单轴拉伸，测定人工胃液处理不同时间后促消化道粘膜修复材料的极限抗张强度和刚度。
（4）VEGF，TGF-β1生长因子释放情况
取0.1g SIS膜和0.1g0.3%京尼平交联得到的本发明修复材料各3组，无菌条件下37℃浸润于3ml PBS中，每48小时取出1ml材料浸提液，并补进1ml新鲜无菌PBS，连续取样14天。ELISA法测定材料浸提液中VEGF和TGF-β1含量。
（5）扫描电镜检测GP交联后SIS结构
通过扫描电镜观察未交联SIS和本发明修复材料的胶原纤维以及孔隙的变化。
（6）细胞毒性实验
①浸提液的制备。将未交联的SIS以及本发明修复材料裁剪成1cm×3cm(表面积约为6cm2)，环氧乙烷灭菌。按照受试材料表面积/浸提液体积=3:1，取表面积为18cm2的材料浸泡在6mL的DMEM（10%FBS）中，在无菌条件下，置于37℃隔水式恒温培养箱中浸提24h取出，制得浸提液原液。
②取对数期生长的人胃粘膜上皮细胞（GES-1），按2×103个细胞/孔接种于3个96孔板内（分别为3个不同的时间点），培养24h使细胞充分贴壁，弃掉原液，加入浸提液，阴性对照为正常的DMEM组，阳性对照为含1%苯酚的DMEM培养液。每组3孔细胞置于培养箱内培养，隔天换液。
③分别于1，3，5d后各取出一块培养板，每孔加入10μL5g／L MTT，37℃孵育4h，吸弃培养液后加入150μL的二甲基亚砜置于室温下15～20min，震荡10min，采用酶标仪在553nm波长测定各孔光吸收值，并计算出各组的均值。按公式RGR=实验组A553/阴性对照组A553×100%，计算出细胞的相对增值率（RGR），并根据国家医疗器械生物学评价标准进行材料毒性分级评定。
（7）直接毒性
将未交联的SIS和本发明修复材料裁剪成直径大小为16mm的圆片，并用环氧乙烷灭菌。将圆形材料浸泡在培养基中，24h后将培养基吸出，每孔均匀地接种1×104个人胃黏膜上皮细胞GES-1在材料表面。在1ml含10%的FBS的DMEM培养基中培养3天，吸出培养基，用PBS进行洗涤，添加200ul浓度为2μM的钙黄绿素对活细胞进行染色。37℃条件下避光孵育30min，用激光共聚焦显微镜对材料上细胞的形态进行观察。
（8）细胞溶血实验
①将未交联的SIS以及本发明修复材料裁剪成1cm×3cm(表面积约为6cm2)，环氧乙烷灭菌。按照受试材料表面积/浸提液体积=3:1，取表面积为18cm2的材料浸泡在6ml的生理盐水中，在无菌条件下，置于37℃隔水式恒温培养箱中浸提24h取出，制得浸提液原液。
②另取健康家兔耳缘静脉抗凝血10ml，然后按新鲜抗凝血：生理盐水=4：5的比例制成稀释兔血。
③取洁净玻璃试管编号1-7，其中1号试管加入5ml生理盐水作为阴性对照，2号试管加入5ml蒸馏水作为阳性对照，3-7号试管分别加入SIS和0.05%、0.1%、0.3%、0.5%GP交联的SIS浸提液5ml，每试管加稀释兔血0.2m1，混匀，37℃恒温水浴箱保温60min。所有试管经1500rpm，离心5min。
④观察其溶血情况并吸取上清至96孔板，分光光度计在545nm波长处测吸光度值，取平均值计算溶血率。溶血率=（实验组A值-阴性对照组A值）/（阳性对照组A值-阴性对照组A值）×100%。
（9）组织相容性研究
分别将SIS膜、本发明修复材料SIS（1cm×1cm）用环氧乙烷灭菌后植入雄性SD大鼠（150-160g）背部皮下，植入后于1，2，4，8周分别取材（n=3）进行组织学观察，并用Image–Proplus6.0软件，每组材料选取6个不同区域在400倍显微镜视野范围下进行炎性细胞计数。
（10）钙化研究
采用原子吸收光谱法分析定量分析植入大鼠皮下4周后京尼平交联的SIS钙化情况。将植入前的材料以及植入大鼠皮下4周的材料冻干称重，并将其用硝酸/高氯酸消化降解，采用火焰原子吸收分光光度法测定钙原子的含量。材料中的钙含量用每毫克干重材料中所含钙元素的质量来表示。
2、检测结果
（1）溶胀率
结果如图7和表4所示，
表4溶胀率
通过统计学分析，与单纯SIS相比，本发明修复材料的溶胀率显著下降（P<0.05）且随着京尼平浓度的升高溶胀率逐渐下降，京尼平的浓度超过0.1%时，SIS的溶胀率下降到100%左右。
实验结果说明，本发明修复材料中，SIS与京尼平发生了交联反应。
（2）红外光谱分析
结果如图8所示，与单纯SIS相比，本发明修复材料在1549cm-1处的氨基吸收峰出现了下降，且随着京尼平浓度的升高该吸收峰缓慢下降。
实验结果说明，本发明修复材料中自由氨基被消耗，SIS与京尼平发生了交联反应。
（3）力学性能
①不同浓度京尼平交联后SIS力学性能测试
结果如图9和表5所示：
表5极限抗张强度的测定
通过统计学分析极限抗张强度，与未交联SIS组相比，浓度为0.05%，0.1%，0.3%，0.5%GP交联得到的本发明修复材料组均有统计学差异（P＜0.05）。在四组交联材料中，与0.5%交联组相比，0.05和0.1%组有统计学差异(P＜0.05)，而0.5%交联组与0.3%交联组相比无统计学差异(P>0.05)。
②人工胃液处理不同时间后，促消化道粘膜修复材料的力学性能
结果如图10、图11所示：
通过统计学分析极限抗张强度，与未经人工胃液处理前相比，本发明修复材料经过人工胃液处理2周后极限抗张强度显著下降（P<0.05），下降到未处理前的1/5。但在随后的6周，本发明修复材料极限抗张强度变化不大。而人工胃液处理8周后刚度无明显变化。未交联组SIS在24h内已完全溶解，无法获得力学数据。
实验结果表明，本发明修复材料具有良好的力学性能，经过胃液处理后也仍然保持了一定的极限抗张强度和刚度，有利于材料在长期组织修复过程中发挥作用。
（4）VEGF，TGF-β1生长因子释放情况
结果如图12所示，0.3%京尼平交联得到的本发明修复材料持续释放VEGF和TGF-β1生长因子，在第14天时，VEGF累积释放量达到72pg，SIS膜的累积释放量为84pg；TGF-β1的累积释放量达到50pg，SIS膜74pg的累积释放量。
实验结果说明，本发明修复材料可以持续的释放生长因子VEGF和TGF，可以在消化道粘膜的修复过程中促进损伤组织再生。
（5）扫描电镜检测结构
结果如图13所示，本发明修复材料与未交联的SIS材料相比，无论是低浓度交联还是高浓度交联，都未出现胶原纤维融合以及明显的孔径大小以及孔隙率的变化，适于细胞粘附和生长。
实验结果说明，本发明修复材料适于细胞粘附和生长，可用于体内组织修复。
（6）细胞毒性实验
结果如表6和表7所示：
MTT实验结果显示，本发明修复材料的浸提液培养人消化道粘膜上皮细胞1天，3天，5天后细胞增值率都在90%以上，材料毒性分级为0级或1级，表明材料无细胞毒性。
实验结果说明，本发明修复材料无细胞毒性，适于体内修复。
（7）直接毒性
结果如图14所示，在激光共聚焦显微镜488nm波长激发下显示绿色荧光的为人的胃粘膜上皮细胞，638nm波长激发下显示红色荧光的为本发明修复材料的胶原结构。培养3天之后，未交联的SIS和本发明修复材料表面都有大量的细胞，且细胞呈明显的延展态。
实验结果说明，本发明修复材料无毒性，适于体内修复。
（8）细胞溶血
溶血结果图15所示，本发明修复材料上层液体为无色透明，红细胞全部沉淀。计算后，溶血率见表8。
实验结果显示，不同浓度的GP交联得到的本发明修复材料溶血率均低于5%，符合国家《医疗器械生物学评价-与血液相互作用试验选择》标准。
实验结果说明，本发明修复材料无明显溶血性，适于体内修复。
（9）组织相容性研究
结果如图16、图17所示，图16为第2周和第8周不同材料炎性细胞浸润情况。图17为不同时间点，SIS及本发明修复材料周围400倍视野下炎性细胞的数目。
实验结果显示，术后第1周和第2周，SIS组炎性反应相对于本发明修复材料较为严重，炎性细胞数目显著高于本发明修复材料。术后第8周，未交联SIS已基本全部降解，而本发明修复材料结构相对完整。SIS组炎性细胞在术后第4周出现明显下降，术后第8周已基本消失。本发明修复材料组炎性细胞数维持在较低水平，基本不变。
实验结果说明，本发明修复材料具有良好的组织相容性，可用于体内修复。
（10）钙化研究
结果如表9所示，
表9SIS及本发明修复材料SIS植入大鼠皮下4周后钙含量
实验结果显示，未交联的SIS以及本发明修复材料植入大鼠皮下4周后，钙原子的含量都有少量的增加，但无明显的钙化现象。
实验结果说明，将本发明修复材料用于体内修复，无明显钙化，可用于消化道粘膜修复。
综上，本发明促消化道修复材料，可以有效抵抗酸和胃蛋白酶的降解，力学性能优良，无细胞毒性，溶血率低，组织相容性性好，孔径大小合适，适于细胞生长，同时含有大量生长因子，体内修复无明显钙化现象，可用于促进消化道粘膜修复，使用安全，制备方法简单，具有良好的临床应用价值。
Claims (11)
1.一种促消化道粘膜修复材料，其特征在于：它是由京尼平交联小肠黏膜下层制备而成，其中，交联指数为30%～100%。
2.根据权利要求1所述的修复材料，其特征在于：所述交联指数为30.63%～86.52%；
优选地，所述交联指数为67.28%～86.52%；
进一步优选地，所述交联指数为67.28%～85.22%；
再进一步优选地，所述交联指数为83.74～85.22%或者67.28～69.92%。
3.根据权利要求1所述的修复材料，其特征在于：它由如下方法制备而成：
（1）取京尼平溶于缓冲液，制成浓度不低于0.01%（w/v）的京尼平溶液；
（2）将小肠黏膜下层浸泡于步骤（1）制得的京尼平溶液中，浸泡时间不低于3h；
（3）取出小肠黏膜下层，清洗，冷冻干燥，即得。
4.根据权利要求3所述的修复材料，其特征在于：
步骤（1）中，所述缓冲液的pH为4～11；优选地，所述缓冲液的pH为7.2；
步骤（1）中，所述缓冲液为PBS溶液。
5.根据权利要求3所述的促消化道粘膜修复材料，其特征在于：步骤（1）中，京尼平溶液的浓度为0.01～0.6%（w/v）；
优选地，所述京尼平溶液的浓度为0.05～0.6%（w/v）；
进一步优选地，所述京尼平溶液的浓度为0.05～0.3%（w/v）；
再进一步优选地，所述京尼平溶液的浓度为0.3%（w/v）或者0.05%（w/v）。
6.根据权利要求3所述的促消化道粘膜修复材料，其特征在于：
步骤（2）中，小肠黏膜下层表面积与京尼平溶液体积的比值为（200～3）:1；
步骤（2）中，浸泡时间为3～24h；
步骤（2）中，浸泡的温度为4℃～65℃；优选地，所述浸泡的温度为37℃。
7.一种制备促消化道粘膜修复材料的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）取京尼平溶于缓冲液，制成浓度不低于0.01%（w/v）的京尼平溶液；
（2）将小肠黏膜下层浸泡于步骤（1）制得的京尼平溶液中，浸泡时间不低于3h；
（3）取出小肠黏膜下层，清洗，冷冻干燥，即得。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
步骤（1）中，所述缓冲液的pH为4～11；优选地，所述缓冲液的pH为7.2；
步骤（1）中，所述缓冲液为PBS溶液。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（1）中，京尼平溶液的浓度为0.01～0.6%（w/v）；
优选地，所述京尼平溶液的浓度为0.05～0.6%（w/v）；
进一步优选地，所述京尼平溶液的浓度为0.05～0.3%（w/v）；
再进一步优选地，所述京尼平溶液的浓度为0.3%（w/v）或者0.05%（w/v）。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
步骤（2）中，小肠黏膜下层表面积与京尼平溶液体积的比值为（200～3）:1；
步骤（2）中，浸泡时间为3～24h；
步骤（2）中，浸泡的温度为4℃～65℃，优选地，所述浸泡的温度为37℃。
11.权利要求1～6任意一项所述修复材料在制备修复消化道损伤的材料中的用途。
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Application publication date: 20141022 Assignee: Albo Ruimei (Chengdu) Medical Technology Co.,Ltd. Assignor: TOPREGMED (BEIJING) MEDICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. Contract record no.: X2022510000049 Denomination of invention: A material for promoting the repair of digestive tract mucosa and its preparation method and application Granted publication date: 20160427 License type: Common License Record date: 20221017 |
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