CN116531567B - 一种子宫内膜修复材料 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种子宫内膜修复材料，它是经京尼平溶液浸泡，再冷冻干燥的小肠黏膜下层；所述冷冻干燥的预冻温度为‑40℃，时间30～120min，升华温度为‑40～0℃，速度0.1～0.4℃/min。本发明通过特定冻干工艺制成的子宫内膜修复材料表面平整光滑，纤维排列清晰，力学强度高，在宫腔镜下宫腔粘连切除术过程中，通过宫腔镜钳递送至子宫修复部位而不发生破损，且容易展开，有利于术中材料的递送及铺展，具有很好预防子宫创面粘连及子宫内膜再生修复的作用。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种子宫内膜修复材料。
背景技术
宫腔粘连(intrauterine adhesion,IUA)指创伤、感染等任何因素使子宫内膜基底层受到损害，造成子宫内膜功能性修复异常，从而引起纤维结缔组织过度增生，子宫内膜发生纤维化导致部分或全部宫腔堵塞所引起的一系列综合征。妊娠期及非妊娠期的子宫腔损伤、生殖系统感染、先天性子宫畸形及遗传易感因素都是导致宫腔粘连的原因。目前在宫腔粘连或者薄型子宫内膜的患者中未能成功的再生出具有正确形态和功能性子宫内膜仍然被认为是生殖医学中的三个未解决的临床问题之一。
目前，治疗宫腔粘连最主要的方法为宫腔镜下宫腔粘连切除术(transcervicalresection of adhesions,TCRA)，通过宫腔镜直接观察粘连情况并准确分离粘连。TCRA对于轻、中度IUA患者的治疗效果不错，但部分患者在手术后会出现反复粘连的情况，重度宫腔粘连治疗后再复发率仍高达20％～60％，无法达到预期治疗效果。因此，IUA分离术后预防再粘连是其治疗的重大挑战，目前临床上采用的预防措施主要包括宫腔放置宫内节育器、球囊支架、透明质酸钠(sodium hyaluronate,SH)、羊膜等屏障，及预防性使用抗生素和口服雌激素等。而重度宫腔粘连患者因基底层受损严重，需要寻求创新的治疗方式，来促进子宫内膜的再生修复，预防宫腔粘连。
专利CN104107458A公开了一种消化道粘膜修复材料，其通过京尼平交联小肠黏膜下层，使之能促进消化道黏膜修复。由于宫腔位于骨盆的中央，就像一个倒置的梨形器官，分为宫颈、宫体二个部分，构造相对复杂，经试验发现：经过交联提高了在胃酸环境下抗降解能力的消化道粘膜修复材料，虽然适用于环境更温和的子宫腔，但在宫腔镜手术递送时，会发生卷曲，不易展开，不能达到隔离创面、促进子宫内膜再生修复，预防宫腔粘连的作用。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种子宫内膜修复材料，它是经京尼平溶液浸泡，再冷冻干燥的小肠黏膜下层；所述冷冻干燥的预冻温度为-40℃，时间30～120min，升华温度为-40～0℃，速度0.1～0.4℃/min。
进一步地，所述冷冻干燥的预冻温度为-40℃，时间30min，升华温度为-40～0℃，速度0.1℃/min。
进一步地，它是由如下方法制备而成：
(1)取京尼平溶于缓冲液，制成浓度不低于0.01％，w/v的京尼平溶液；
(2)将小肠黏膜下层浸泡于步骤(1)制得的京尼平溶液中，浸泡时间不低于3h；
(3)取出小肠黏膜下层，清洗，冷冻干燥，即得。
更进一步地，步骤(1)所述缓冲液为PBS溶液，pH为4～11；优选pH为7.2。
更进一步地，步骤(1)所述京尼平溶液的浓度为0.01～0.6％，w/v；优选0.05～0.6％，w/v；进一步优0.05～0.3％，w/v；再进一步优选0.3％，w/v或者0.05％，w/v。
更进一步地，步骤(2)所述小肠黏膜下层表面积与京尼平溶液体积的比值为(200～3):1；浸泡时间为3～24h，温度为4℃～65℃，优选温度为37℃。
本发明还提供了一种制备子宫内膜修复材料的方法，包括如下步骤：
(1)取京尼平溶于缓冲液，制成浓度不低于0.01％(w/v)的京尼平溶液；
(2)将小肠黏膜下层浸泡于步骤(1)制得的京尼平溶液中，浸泡时间不低于3h；
(3)取出小肠黏膜下层，清洗，冷冻干燥，即得；
所述冷冻干燥的预冻温度为-40℃，时间30～120min，升华温度为-40～0℃，速度0.1℃/min。
进一步地，步骤(1)所述缓冲液为PBS溶液，pH为4～11；优选pH为7.2。
进一步地，步骤(1)所述京尼平溶液的浓度为0.01～0.6％，w/v；优选0.05～0.6％，w/v；进一步优0.05～0.3％，w/v；再进一步优选0.3％，w/v或者0.05％，w/v。
进一步地，步骤(2)所述小肠黏膜下层表面积与京尼平溶液体积的比值为(200～3)：1；浸泡时间为3～24h，温度为4℃～65℃，优选温度为37℃。
本发明还提供了一种前述子宫内膜修复材料在制备预防宫腔粘连和/或子宫内膜再生修复的药物中的用途。
本发明子宫内膜修复材料，通过特定冻干工艺使其膜表面趋于平整，浆膜面纤维排列清晰，黏膜面光滑，同时，力学强度(拉伸强度、顶破强度)大，在宫腔镜下宫腔粘连切除术过程中，通过宫腔镜钳递送至子宫修复部位而不发生破损，且容易展开，有利于术中材料的递送及铺展，具有很好预防子宫创面粘连及子宫内膜再生修复的作用，具备实际推广应用价值。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1SIS膜(A：新鲜制备的SIS膜呈半透明状；B：冻干后SIS膜呈白色纸状)；
图2不同厚度GP-CR SIS的形貌；
图3SIS及GP-CR SIS修复术后子宫大体图(A、B、C修复2周；D、E、F：修复4周)；
图4SIS及GP-CR SIS修复术后HE染色(A、D对照组；B、E：SIS组；C、F：GP-CR SIS组)。
具体实施方式
实施例1本发明子宫内膜修复材料的制备
1)小肠黏膜下层(SIS)的制备
本发明SIS可以购买市售品，也可以按照如下方法制备。
(1)清洗整理：取屠宰后半个小时的新鲜猪小肠，用水冲去小肠内容物，翻转小肠，加入盐揉搓后用水反复冲洗3次，用手术刀剖开小肠，然后剪成15厘米长的肠段。
(2)分离出SIS：用压舌板刮除肌层，浆膜层，置于生理盐水中4℃保存过夜。
(3)脱脂：用去离子水漂洗干净后用纱布滤干水。浸入三氯甲烷-甲醇的混合液中，三氯甲烷：甲醇的比值为1：1，置于通风橱里4小时，平均2小时换一次液，并且每半个小时搅拌一次。
(4)脱细胞：将脱脂后的SIS用去离子水漂洗20次，反复清洗，漂至无味。然后放入浓度为0.25％的胰蛋白酶液里，4℃脱细胞处理过夜。
(5)用去离子水漂洗10次后用0.5％的SDS处理至少4小时，清洗，制得新鲜的SIS膜，如图1A所示。
(6)冻干：清洗后依次置于-20℃，-40℃，-80℃中预冻(时间5min内)后在真空冷冻干燥机中冻干保存，制得冻干后的SIS膜，如图1B所示。
2)子宫内膜修复材料的制备
(1)称取粉末状京尼平(GP)溶于PBS(pH＝7.2)溶液中，充分搅拌，使GP完全溶解，制成质量体积比为0.3％的GP溶液。
(2)将制备的SIS浸泡到GP溶液中，在37℃的恒温摇床上交联24h。
(3)将交联后的SIS从GP溶液中取出，用PBS溶液反复冲洗，至少5次，并浸泡在PBS溶液中24h。
(4)将交联后的SIS从PBS溶液中取出，用蒸馏水反复冲洗，至少5次，并浸泡在蒸馏水中24h。
(5)将SIS从蒸馏水中取出，在预冻温度-40℃，时间30min，升华温度为-40～0℃，速度0.1℃/min的条件下冷冻干燥，即得。
实施例2本发明子宫内膜修复材料的制备
1)SIS的制备
本发明SIS可以购买市售品，也可以按照如下方法制备。
(1)清洗整理：取屠宰后半个小时的新鲜猪小肠，用水冲去小肠内容物，翻转小肠，加入盐揉搓后用水反复冲洗3次，用手术刀剖开小肠，然后剪成15厘米长的肠段。
(2)分离出SIS：用压舌板刮除肌层，浆膜层，置于生理盐水中4℃保存过夜。
(3)脱脂：用去离子水漂洗干净后用纱布滤干水。浸入三氯甲烷-甲醇的混合液中，三氯甲烷：甲醇的比值为1：1，置于通风橱里4小时，平均2小时换一次液，并且每半个小时搅拌一次。
(4)脱细胞：将脱脂后的SIS用去离子水漂洗20次，反复清洗，漂至无味。然后放入浓度为0.25％的胰蛋白酶液里，4℃脱细胞处理过夜。
(5)用去离子水漂洗10次后用0.5％的SDS处理至少4小时，清洗，制得新鲜的SIS膜，如图1A所示。
(6)冻干：清洗后依次置于-20℃，-40℃，-80℃中依次预冻(时间5min内)后在真空冷冻干燥机中冻干保存，制得冻干后的SIS膜，如图1B所示。
2)子宫内膜修复材料的制备
(1)称取粉末状GP溶于PBS(pH＝4.0)溶液中，充分搅拌，使GP完全溶解，制成质量体积比为0.3％的GP溶液。
(2)将制备的SIS浸泡到GP溶液中，在37℃的恒温摇床上交联24h。
(3)将交联后的SIS从GP溶液中取出，用PBS溶液反复冲洗，至少5次，并浸泡在PBS溶液中24h。
(4)将交联后的SIS从PBS溶液中取出，用蒸馏水反复冲洗，至少5次，并浸泡在蒸馏水中24h。
(5)将SIS从蒸馏水中取出，在预冻温度-40℃，时间120min，升华温度为-40～0℃，速度0.1℃/min的条件下冷冻干燥，即得。
实施例3本发明子宫内膜修复材料的制备
1)SIS的制备
本发明SIS可以购买市售品，也可以按照如下方法制备。
(1)清洗整理：取屠宰后半个小时的新鲜猪小肠，用水冲去小肠内容物，翻转小肠，加入盐揉搓后用水反复冲洗3次，用手术刀剖开小肠，然后剪成15厘米长的肠段。
(2)分离出SIS：用压舌板刮除肌层，浆膜层，置于生理盐水中4℃保存过夜。
(3)脱脂：用去离子水漂洗干净后用纱布滤干水。浸入三氯甲烷-甲醇的混合液中，三氯甲烷：甲醇的比值为1：1，置于通风橱里4小时，平均2小时换一次液，并且每半个小时搅拌一次。
(4)脱细胞：将脱脂后的SIS用去离子水漂洗20次，反复清洗，漂至无味。然后放入浓度为0.25％的胰蛋白酶液里，4℃脱细胞处理过夜。
(5)用去离子水漂洗10次后用0.5％的SDS处理至少4小时，清洗，制得新鲜的SIS膜，如图1A所示。
(6)冻干：清洗后依次置于-20℃，-40℃，-80℃中依次预冻(时间5min内)后在真空冷冻干燥机中冻干保存，制得冻干后的SIS膜，如图1B所示。
2)子宫内膜修复材料的制备
(1)称取粉末状GP溶于PBS(pH＝11)溶液中，充分搅拌，使GP完全溶解，制成质量体积比为0.3％的GP溶液。
(2)将制备的SIS浸泡到GP溶液中，在37℃的恒温摇床上交联24h。
(3)将交联后的SIS从GP溶液中取出，用PBS溶液反复冲洗，至少5次，并浸泡在PBS溶液中24h。
(4)将交联后的SIS从PBS溶液中取出，用蒸馏水反复冲洗，至少5次，并浸泡在蒸馏水中24h。
(5)将SIS从蒸馏水中取出，在预冻温度-40℃，时间30min，升华温度为-40～0℃，速度0.1℃/min的条件下冷冻干燥，即得。
以下通过试验例来说明本发明的有益效果。
试验例不同冻干工艺对子宫内膜修复材料影响研究
1、试验用不同子宫内膜修复材料的制备
1)SIS的制备
本发明SIS可以购买市售品，也可以按照如下方法制备。
(1)清洗整理：取屠宰后半个小时的新鲜猪小肠，用水冲去小肠内容物，翻转小肠，加入盐揉搓后用水反复冲洗3次，用手术刀剖开小肠，然后剪成15厘米长的肠段。
(2)分离出SIS：用压舌板刮除肌层，浆膜层，置于生理盐水中4℃保存过夜。
(3)脱脂：用去离子水漂洗干净后用纱布滤干水。浸入三氯甲烷-甲醇的混合液中，三氯甲烷：甲醇的比值为1：1，置于通风橱里4小时，平均2小时换一次液，并且每半个小时搅拌一次。
(4)脱细胞：将脱脂后的SIS用去离子水漂洗20次，反复清洗，漂至无味。然后放入浓度为0.25％的胰蛋白酶液里，4℃脱细胞处理过夜。
(5)用去离子水漂洗10次后用0.5％的SDS处理至少4小时，清洗，制得新鲜的SIS膜，如图1A所示。
(6)冻干：清洗后依次置于-20℃，-40℃，-80℃中依次预冻(时间5min内)后在真空冷冻干燥机中冻干保存，制得冻干后的SIS膜，如图1B所示。
2)子宫内膜修复材料的制备
(1)称取粉末状GP溶于PBS(pH＝7.2)溶液中，充分搅拌，使GP完全溶解，制成质量体积比为0.3％的GP溶液。
(2)将制备的SIS浸泡到GP溶液中，在37℃的恒温摇床上交联24h。
(3)将交联后的SIS从GP溶液中取出，用PBS溶液反复冲洗，至少5次，并浸泡在PBS溶液中24h。
(4)将交联后的SIS从PBS溶液中取出，用蒸馏水反复冲洗，至少5次，并浸泡在蒸馏水中24h。
(5)将SIS从蒸馏水中取出，在预冻温度-40℃，时间30min，升华温度为-40～0℃，速度0.1℃/min的条件下冷冻干燥，即得GP-CR SIS-1；
将SIS从蒸馏水中取出，在预冻温度-40℃，时间120min，升华温度为-40～0℃，速度0.1℃/min的条件下冷冻干燥，即得GP-CR SIS-2；
将SIS从蒸馏水中取出，在预冻温度-40℃，时间120min，升华温度为-40～0℃，速度0.2℃/min的条件下冷冻干燥，即得GP-CR SIS-3；
将SIS从蒸馏水中取出，在预冻温度-40℃，时间120min，升华温度为-40～0℃，速度0.4℃/min的条件下冷冻干燥，即得GP-CR SIS-4；
2、不同GP-CR SIS的性能指标
a、方法
a-1、厚度(μm)
用厚度仪测试不同膜片厚度
a-2、拉伸强度(N)
制备2cm x10cm宽的样条，以夹具固定补片窄边，夹具距离为3cm，用拉力试验机以10mm/min的速度拉伸至材料断裂，记录断裂时所需拉力。
a-3、顶破强度(N)
制备8cm x8cm宽的样品，试样固定在两个夹持环之间，顶压杆以恒定的速率垂直顶压试样，记录材料顶破时压力。
b、结果
具体结果见表1和图2
表1不同厚度GP-CR SIS的性能指标
从结果可见，GP-CR SIS-1、GP-CR SIS-2、GP-CR SIS-3及GP-CR SIS-4厚度依次降低，截面三维多孔结构随着厚度减小而逐渐减少至消失，膜表面趋于平整，浆膜面纤维排列逐渐清晰，黏膜面变光滑，同时，力学强度(拉伸强度、顶破强度)随着厚度减小而降低。交联后SIS均能实现在术中通过宫腔镜钳递送至修复部位而不发生破损，且交联SIS在液体环境中弯折后，比非交联SIS更容易展开，但只有GP-CR SIS-1的综合性能指标利于术中材料的递送及铺展。
3、GP-CR SIS对大鼠子宫的防粘修复效果
1、方法
1.1分组
选取正常动情周期的雌性未受孕SD大鼠，鼠适应性喂养7天后，进行分组手术。具体分实验组和对照组，对照组(Control)为造模后不植修复材料的内膜受损大鼠、实验组为非交联SIS膜及GP-CR SIS-1、GP-CR SIS-2、GP-CR SIS-3及GP-CR SIS-4膜，分别将以上膜片植入内膜受损的大鼠子宫中。
1.2损伤粘连子宫造模(IUA)
暴露子宫，使用两个动脉夹固定子宫，间距1.5cm。向宫腔内注入95％乙醇至充盈，5min后吸出，沿半周径剪开子宫，生理盐水冲洗子宫，再缝合子宫。
2、子宫内膜修复方法：
IUA造模后，将GP-CR SIS卷成直筒状，植入到宫腔内(腐蚀区域)；对于SIS膜，鉴于其支撑性差，需先将SIS卷成直筒状，在重合边上、中、下处各缝合固定，再利用钛丝将其递送到宫腔内(腐蚀区域)，缝合固定材料后取出钛丝，缝合子宫。术后2周、4周，观察宫腔损伤区域的狭窄情况，并取损伤处子宫角截面进行HE染色，观察材料在体内留存的完整性以及创面修复效果。
2、结果
2.1手术实施情况
手术实施过程中，由于GP-CR SIS-2、GP-CR SIS-3及GP-CR SIS-4膜片在植入时，容易吸收水分皱缩，难以顺利植入子宫角中，并且由于力学支撑性较差，植入后发生塌缩，导致材料堵塞子宫腔，而GP-CR SIS-1植入顺利，故筛选GP-CR SIS-1作为能进行后续防粘连研究的GP-CR SIS组继续后续实验。
2.2子宫观察结果
根据大体标本观察发现，术后2周，对照组子宫腐蚀区域宫腔狭窄，卵巢端有大量宫腔积液，说明缺损处发生粘连、堵塞，随着实验时间的增长，变化越明显。而实验组子宫损伤处宫腔狭窄程度低，卵巢端宫腔积液相对更少，堵塞发生的概率也更小。通过GP-CR SIS材料修复的子宫，术后2周，共取材7只，其中2只损伤区域出现轻微狭窄，未达到修复效果(图3A)；其中5只无粘连、狭窄和堵塞,子宫粗细均匀，长度和颜色与正常子宫角相比无明显变化，防粘连修复效果良好(图3B)。术后4周，共取材15只，其中8只(图3D)出现狭窄堵塞；7只(图3E)无粘连、狭窄和堵塞。对于通过植入SIS膜修复子宫缺损的情况，术后2周，共取材7只，其中3只(图3C)出现远端膨大现象，说明发生粘连、堵塞，未达到修复效果；4只防粘连效果良好。术后4周，共取材15只，仅3只起到防粘连作用(图3F)。数据见表2。说明GP-CR SIS对损伤子宫起到良好的隔离和支撑作用。
表2 SH及SH-SIS组对大鼠子宫粘连修复结果
2.2 HE染色结果
对损伤处子宫角截面进行HE染色观察，对照组(图4A,D)粘连情况明显，组织松散，形成大量增生，2w、4w后对照组均无腺体存在，且上皮细胞层连续性消失。在实验组中，SIS组宫腔内膜材料由于力学性能较差，植入后难以保持自身形状，受外侧组织挤压后可能发生塌陷、卷曲，会有导致SIS修复组发生宫腔堵塞的情况(图4B)。GP-CR SIS膜修复组(图4C，F)空腔截面面积较对照组及SIS组明显增大，子宫内膜腺体数量更多，间质内纤维增生较少，未见组织粘连堵塞发生，其修复效果，有效率修复率高达71.4％。术后4周，SIS发生降解(图4E)，丧失支撑作用。力学性能更优的GP-CR SIS组(图4F)与周围组织相容性好，子宫壁结构恢复完整，腔体较大，体现出更好的修复效果。体内实验证实GP-CR SIS具有较SIS更强的力学性能，能维持子宫受损区域形状，起到防止粘连的作用，随着修复时间延长，腺体增多，并且子宫壁结构修复更完整。
Claims (8)
1.一种子宫内膜修复材料，其特征在于：它是经京尼平溶液浸泡，再冷冻干燥的小肠黏膜下层；所述冷冻干燥的预冻温度为-40℃，时间30 min，升华温度为-40~0℃，速度0.1℃/min；
所述京尼平溶液的浓度为0.3%，w/v；
所述浸泡的时间为24h，温度为37℃。
2.根据权利要求1所述的子宫内膜修复材料，其特征在于：它是由如下方法制备而成：
（1）取京尼平溶于缓冲液，制成京尼平溶液；
（2）将小肠黏膜下层浸泡于步骤（1）制得的京尼平溶液中浸泡；
（3）取出小肠黏膜下层，清洗，冷冻干燥，即得。
3.根据权利要求2所述的子宫内膜修复材料，其特征在于：步骤（1）所述缓冲液为PBS溶液，pH为4～11。
4.根据权利要求3所述的子宫内膜修复材料，其特征在于：所述pH为7.2。
5.一种制备子宫内膜修复材料的方法，其特征在于：包括如下步骤：
（1）取京尼平溶于缓冲液，制成浓度0.3%，w/v的京尼平溶液；
（2）将小肠黏膜下层浸泡于步骤（1）制得的京尼平溶液中，在温度37℃的条件下浸泡24h；
（3）取出小肠黏膜下层，清洗，冷冻干燥，即得；
所述冷冻干燥的预冻温度为-40℃，时间30min，升华温度为-40~0℃，速度0.1℃/min。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述缓冲液为PBS溶液，pH为4～11。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述 pH为7.2。
8.权利要求1~4任意一项所述子宫内膜修复材料在制备预防宫腔粘连和/或子宫内膜再生修复的药物中的用途。
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