CN107050529A - 一种宫腔内置物、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种宫腔内置物、制备方法及其应用，其特征在于，所述宫腔内置物具有袋状结构，所述宫腔内置物包括经脱细胞处理的动物小肠粘膜下层基质材料。能够治疗和预防宫腔粘连的植入性医疗器械，该医疗器械包括生物组织基质材料，对现有生物修补材料的脱细胞工艺技术进行改进，使本发明生物组织基质材料与现有产品相比，DNA残留量更低，免疫原性更低、抗感染能力更高、修复能力更强；有利于宫腔基底层、粘膜下层、粘膜层等组织的恢复。此外本发明更将生物修补材料制作为宫腔内置结构，用于隔离创面、宫腔组织修复和减少瘢痕的形成，从而处理宫腔粘连问题，并解决由此产生的不孕问题。

Description

一种宫腔内置物、制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及医用生物材料技术领域，具体涉及一种动物源宫腔内置物、制备方法和用途。该宫腔内置物为动物源性材料，用于治疗和预防宫腔粘连。

背景技术

子宫内膜(endometrium)是指构成哺乳类子宫内壁的一层。子宫内膜分为致密层、海绵层和基底层三层。内膜表面2/3为致密层和海绵层统称功能层，受卵巢性激素影响发生周期变化而脱落。基底层为靠近子宫肌层的1/3内膜，富有血管，不受卵巢性激素影响，不发生周期性的变化。

临床上，当子宫内壁出现创伤时，如吸宫或刮宫、子宫肌瘤剔除术、子宫内膜结核等，造成内膜过度损伤，进而损伤子宫内膜基底层，结果会导致上皮、间质细胞再生障碍，新生血管形成受损，内膜难以实现自我修复。此时，宫腔缺乏内膜覆盖，前后壁可发生纤维化、瘢痕化及形成宫腔粘连，引起子宫内膜或结缔组织、肌肉粘着，导致出现月经过少、痛经、经血反流、闭经和习惯性流产甚至导致不孕等临床综合征。

20世纪70年代以来，随着宫腔镜等技术的发展，宫腔镜下行宫腔粘连分离术(TCRA) 目前已成为治疗宫腔粘连以及由此治疗不孕的标准方法。但是行TCRA术后宫腔再次粘连仍有可能发生，且一旦再发宫腔粘连，子宫内膜修复将无法顺利完成，临床表现为月经量无明显增加或仍然闭经，故TCRA术后仍需要采取一定防粘连措施。

子宫粘连预防和治疗的关键在于以下三个方面：隔离创面、宫腔组织修复和减少瘢痕的形成。目前临床使用及研究中的宫腔操作后防止粘连和减少瘢痕的方法有：术后全身给予雌激素治疗；机械屏障法如宫内节育器和Foley带气囊导尿管、透明质酸膜，新鲜羊膜。目前研究的促进组织再生的研究主要包括支架材料的应用、生长因子、基因疗法、细胞疗法(如干细胞的应用)、机械疗法、电疗等。天然生物材料如胶原、脱细胞基质因其良好的生物相容性而越来越受到科研人员的重视，尤其是脱细胞基质已有研究证明可作为组织修复的良好基础。

理想的子宫粘连和是提供屏障隔离创面以防止粘连的发生；提供引导细胞分化、生长的“模板”，诱导组织再生，促进宫腔组织自我修复。本发明提供具有上述功能的植入性材料。

发明内容

本发明提供一种能够治疗和预防宫腔粘连的植入性医疗器械，该医疗器械包括生物组织基质材料，对现有生物修补材料的脱细胞工艺技术进行改进，使本发明生物组织基质材料与现有产品相比，DNA残留量更低，免疫原性更低、抗感染能力更高、修复能力更强；此外本发明提供的植入性材料保留了细胞外基质的生长因子促进细胞的生长和分化，有利于宫腔基底层、粘膜下层、粘膜层等组织的恢复。此外本发明更将生物修补材料制作为宫腔内置结构，用于隔离创面、宫腔组织修复和减少瘢痕的形成，从而处理宫腔粘连问题，并解决由此产生的不孕问题。

具体为，一种宫腔内置物，其特征在于，所述宫腔内置物具有袋状结构，所述宫腔内置物包括经脱细胞处理的动物小肠粘膜下层基质材料。

小肠粘膜下层基质材料包含碱性纤维生长因子(FGF-2)、转化生长因子(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGF)。

宫腔内置物包括纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)，其质量百分比含量大于2％。纤维粘连蛋白用于新生细胞在细胞外基质上的固定，有助于各组织的再生和修复。

袋状结构具有内腔和开口，所述内腔由所述小肠粘膜下层基质材料围成。

所述宫腔内置物还包括支撑构件，所述宫腔内置物的内腔能够容纳所述支撑构件，所述支撑构件能够在所述开口处进出所述袋状结构的所述内腔；支撑构件用于支撑宫腔内置物，使其在宫腔内扩张，有效隔离创面，防止发生宫腔粘连。

所述内置物的形状基本上呈以下形状：梯形，所述梯形底边长为0.5-6cm，高度为0.5-7.5cm，所述开口位于梯形的较短底边处；优选地，所述梯形的至少一个角部为弧线形；三角形，所述三角形底边长为0.5-6cm，高度为0.5-7.5cm，所述开口位于三角形的一个侧边上；优选地，所述三角形的至少一个角部为弧线形；圆形，所述圆形直径为 0.5-7.5cm，所述开口位于圆形的圆边处或圆形的圆面上；或者椭圆形，所述椭圆形短轴为0.5-6cm，长轴为0.5-7.5cm，所述开口位于椭圆形的圆边处或圆面上。这些形状与宫腔内腔形状基本上适配，并与支撑构件形状适配，即能被支撑构件较好地扩张，也有利于有效隔离创面，防止发生宫腔粘连。

其中支撑构件可以为节育器或气囊。

其中支撑构件为Foley带气囊。宫腔内置物的内腔可以容纳气囊结构，气囊充气后扩张，也是宫腔内置物扩张，有效隔离创面，防止发生宫腔粘连。

其中的支撑构件为可收缩节育器，该可收缩节育器可选用花式、母体乐、T形、元宫形、γ型、宫腔形等各种样式。

其中用动物的小肠粘膜下层为原料，经过清洗、病毒灭活、脱细胞、干燥和成型处理制备小肠粘膜下层基质材料，然后将得到的小肠粘膜下层基质材料成型为所需要的袋状结构。所述袋状结构，包括开口端和封闭端。

开口端用于在使用时将节育器放入袋状结构中，将其撑开，使小肠粘膜下层基质材料与子宫内壁紧密的接触，辅助并促进子宫内膜损伤的修复。

根据需要在宫腔内置物的袋状结构表面可包括通孔，免于组织液在袋装结构内积累，利于组织修复。优选地，所述孔间距0.2-1厘米，孔直径0.5-3毫米。

本发明提供一种治疗宫腔粘连的植入性医疗器械。该产品的细胞外基质材料可以来自于动物的小肠粘膜下层组织材料，例如哺乳动物的小肠粘膜下层组织材料，更优选猪或牛的的小肠粘膜下层组织材料。本产品以小肠粘膜下层组织材料为原料，去除细胞、 DNA及其它引发免疫原反应的成分。本发明所述的细胞外基质中动物源DNA残留量(动物源性生物材料DNA残留量)小于10ng/mg，优选小于3ng/mg，α-Gal抗原清除率不低于99％。DNA和α-Gal是抗原，如果生物材料中这些物质含量过高，放入人体后会使人体发生免疫排斥反应，而上述含量的有效控制克服了上述免疫排斥反应的缺陷，上述这些物质的去除是通过脱细胞步骤实现的。

本发明还提供一种宫腔内置物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)组织前置处理；(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活；(3)清洗；(4)脱细胞：脱细胞液液为溶有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液，脱细胞过程在多频超声波装置中进行；(5)清洗；(6)真空冷冻干燥：在真空冷冻干燥机中进行；(7)成型：将由步骤(6)得到的经真空冷冻干燥的小肠粘膜下层基质材料制成袋状结构。

所述步骤(1)中，取小肠粘膜下层组织材料，清洗，滤干。

所述步骤(2)的过氧乙酸-乙醇溶液，其中过氧乙酸的体积百分比浓度为0.1％-5％、乙醇的体积百分比浓度为5％-40％，用水配置成溶液，过氧乙酸-乙醇溶液与猪小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间2-4小时，灭活的温度范围为10-40℃。

本发明步骤(3)的清洗过程中，采用清洗液清洗猪小肠粘膜下层组织材料，清洗液为pH值为7.2-7.4的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与猪小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为(20-40)︰1；然后采用纯化水清洗，纯化水与猪小肠粘膜下层组织材料比例(体积比)为(20-40)︰1，至检测电导率为10μS/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，频率优选40kHz，功率优选3000W以上。

本发明步骤(4)的脱细胞液为含有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液；脱细胞液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.01-0.2％，优选0.02-0.05％；EDTA的浓度为0.1-1mmol/L，优选0.4-0.8mmol/L；脱细胞液的pH值为7.0-8.0，优选为7.2-7.5；所述脱细胞液与猪小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1，脱细胞过程在双频超声波装置中进行，其中低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，脱细胞液的温度范围为20-35℃，超声功率5000W以上。采用胰蛋白酶和 EDTA，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到脱细胞目的。采用上述方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞被从基质上完全脱离。到达最佳的免疫原去除效果。

本发明步骤(5)的清洗过程中，采用清洗液清洗猪小肠粘膜下层组织材料，清洗液为pH值为7.2-7.4的PBS溶液，PBS溶液与猪小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为(20-40)︰1；然后采用降温的注射用水清洗，注射用水与猪小肠粘膜下层组织材料比例为(20-40)︰1，注射用水温度20-35℃，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于1μS/cm终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，频率优选40kHz，功率优选3000W以上。

所述步骤(6)中，将一层或多层由步骤(5)得到的小肠粘膜下层基质材料放置在模具上，放入真空冷冻干燥机中进行猪小肠粘膜下层基质材料的冷冻干燥。上述步骤(6) 所述的模具包括带针底板与压框，将一或多层小肠粘膜下层基质材料平铺于所述带针底板上，将所述压框放置于猪小肠粘膜下层基质材料上，将所述带针底板和所述压框相对固定。本发明提到的模具，具体的结构可以参考发明专利ZL201310203602.2。真空冷冻干燥为：将带有小肠粘膜下层基质材料的模具放置于真空冷冻干燥机中；先预冻至 -45℃，保温1-2小时；然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4小时，完成真空冷冻干燥；冷冻干燥装置的腔室内的压强为1-50Pa。

所述步骤(7)中，以由步骤(6)得到的经真空冷冻干燥的小肠粘膜下层基质材料为原料，将其缝制或粘接成袋状结构；所述袋状结构包括内腔、开口端和封闭端，所述开口端能够允许支撑构件(例如节育器)在所述开口端处进出所述袋状结构的内腔，所述内腔能够容纳所述支撑构件。

其中袋状结构可以使用的可降解线缝制，也可以通过可降解胶粘接而成袋状结构，所用的可降解胶例如是蛋白胶。

子宫呈倒置扁梨形，前面扁平，后面稍突出，壁宽腔小，上端宽而游离，朝前上方；下端较窄，呈圆柱状，插入阴道的上部。成年女性的子宫宫腔容量约5ml。所述袋状结构的封闭端的尺寸大于所述开口端的尺寸。袋状结构可以基本上呈梯形或三角形形状，或者将梯形或三角形的钝角或锐角部分裁切并缝制成弧线形。所述袋状结构能够保证节育器套管放入，且保证已经在其内打开的节育器不会掉出来。袋状结构具有不同的大小规格，适合不同个体需要。-缝线使用可生物降解的外科手术线。缝制过程亦需控制无菌。袋状结构还可以呈圆形或椭圆，以安放于宫腔中。圆形或椭圆形的袋状结构也可以适用于相应形状的节育器。

本发明还提供宫腔内置物在宫腔内置医疗器械中的应用，宫腔内置医疗器械用于修复宫腔内膜或基底层损伤，用于预防和治疗宫腔粘连，用于防止宫腔前后壁发生纤维化或瘢痕化，或者用于预防和治疗由宫腔粘连所导致的不孕、习惯性流产、月经过少、痛经、经血反流或闭经。

本发明提供一种宫腔内置物及其制备方法，经该制备方法成型的宫腔内置物，适用于不同大小的子宫。通过与不同类型的节育器等配合使用，针对性的修复子宫内膜不同部位的损伤。

本发明提供一种宫腔内置物，该产品由细胞外基质材料制成，所用细胞外基质材料优选具有较高的纯度的类型。优选材料的内毒素水平低于12EU/g，更优选低于5EU/g，最优选的是低于1EU/g。作为额外的偏好，ECM材料可的生物负载低于1CFU/g，更优选的是低于0.5CFU/g。真菌的水平低于1CFU/g，更优选的是低于0.5CFU/g。核酸水平最好小于5ug/mg，更优选的是小于2ug/mg，病毒含量优选小于50PFU/g，更优选的是小于5PFU/g。

本发明提供一种宫腔内置物，由小肠粘膜下层基质材料制成。小肠粘膜下层基质材料保留生长因子或其他的有益的生物活性成分。小肠粘膜下层基质材料包含碱性成纤维细胞生长因子(FGF-2)，转化生长因子-β(TGF-β)、表皮生长因子(EGF)，血管内皮细胞生长因子(VEGF)，和/或血小板衍生生长因子(PDGF)。细胞外基质材料还包含肝素、硫酸肝素、透明质酸和/或纤维粘连蛋白。通常来说，小肠粘膜下层基质材料可能包含一个生物活性成分，能够直接或间接的诱导细胞反应，如细胞在形态、分裂、生长、蛋白质或基因表达上的变化。

本发明提供一种宫腔内置物的制备方法中，可以在模具的带针底板上铺设一层或多层小肠粘膜下层基质材料，优选4-6层。

相比现有技术，本发明具有以下显著优点：

小肠粘膜下层基质材料用于宫腔操作后前后壁创面的隔离，不会造成如宫内节育器等机械隔离对创面造成的二次伤害，也不会发生排异反应。

小肠粘膜下层基质材料用于宫腔操作后前后壁创面的隔离，不会产生如透明质酸膜、聚乳酸膜用于创面隔离的炎症反应。

小肠粘膜下层基质材料用于宫腔操作后前后壁创面的隔离，不会产生如新鲜羊膜用于创面隔离修复的排异反应。

小肠粘膜下层基质材料与节育器配合使用，有效解决了子宫内膜不适合缝合的特殊问题，使用与宫腔形状契合的节育器将修复材料小肠粘膜下层基质固定于宫腔内，极大地提高了小肠粘膜下层基质材料发挥修复功能的水平。

本发明选用的小肠粘膜下层基质材料，DNA残留少，能够达到10ng/mg以下，半乳糖苷酶去除率较高，能够达到99％以上；且完整保留了天然细胞外基质的三维结构，保留了本源性有益成分，生长因子如碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)，透明质酸(HA)和硫酸氨基聚糖(sGAGs)等，保证了产品具有低的免疫原性，高的抗感染能力，并具有诱导细胞分化、促进细胞生长的修复功能。

本发明选用的小肠粘膜下层基质材料，因其在制备过程中将基质材料定型与脱水过程同步化，使多层结构致密，不分层，极大地提高脱细胞基质补片的力学性能与抗降解能力。并且通过控制灭菌工艺，能够有效的控制降解时间，可以根据需要制备不同使用周期的产品。

本发明采用更温和的胰蛋白酶和EDTA复合溶液以及双频超声处理相配合进行脱细胞处理，这一步骤是制造生物材料很重要的一个环节，只有将作为免疫原的细胞含量降至极低或完全去除，植入体内的材料才不会引发免疫反应，从而保证了材料的安全性；采用胰蛋白酶和EDTA使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏，然后采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，从而达到脱细胞目的，针对脱细胞的各个环节采用对应的方法进行细节上的处理，使脱细胞效果更好，细胞残留更低。

附图说明

图1是根据本发明一个实施方式的宫腔内置物所用的经脱细胞及成型处理的小肠粘膜下层基质材料的正面扫描电镜图。

图2是根据本发明一个实施方式的宫腔内置物所用的经脱细胞及成型处理的小肠粘膜下层基质材料的侧面的扫描电镜图。

图3为根据本发明一个实施方式的宫腔内置物所用的小肠粘膜下层基质材料的X射线衍射谱(XRD)。

图4是根据本发明一个实施方式的宫腔内置物所用的小肠粘膜下层基质材料的亲水角测试图。

图5为宫腔内置物所用的小肠粘膜下层基质材料的红外图谱。

图6示出宫腔植入材料的脱细胞基质材料与现有基质材料的SDS-PAGE电泳结果图。

图7为经脱细胞处理后的小肠粘膜下层基质材料经Masson染色照片。

图8为经脱细胞处理后的小肠粘膜下层基质材料经Masson染色照片(小倍率)。

图9根据本发明的一个实施方式的宫腔内置物的示意图；

图10是根据本发明的另一个实施方式的宫腔内置物的示意图；

图11是根据本发明的另一个实施方式的宫腔内置物的示意图；

图12是一种节育器的示意图；

图13为一种节育器安放装置的示意图。

上述附图是为了帮助理解本发明的各个方面，用于解释本发明，而非用于限制本发明。

具体实施方式

为了帮助理解本发明的各个方面，提供以下实施例。需要说明的是，实施例是为了解释本发明，本发明并不为这些实施方式所限制。

图1和图2是本发明中宫腔内置物所用的经脱细胞及成型处理的小肠粘膜下层基质材料的正面和侧面的扫描电镜图。本发明的基质材料采用非交联工艺，将多层脱细胞基质复合后形成胶原蛋白微纤维网络，优秀的力学性能足以满足使用需求，因此整个生产过程中无需使用化学交联剂，避免了化学交联产生的纤维包裹、糜烂、钙化及炎症等不良反应。从图1中可以看到小肠粘膜下层基质材料呈多孔网络结构，孔隙率可以达到90％以上，为引导细胞长入提供适宜的微环境。从图2中可以看到，小肠粘膜下层基质材料经过处理使胶原蛋白纤维形成层层叠加的多层结构，可以调整材料的降解性能与力学性能，以适应不同组织修复的需要。另外，小肠粘膜下层基质材料的顶破强度与缝合强度较高，可以应用于需要缝合、承力的手术条件。

图3为宫腔内置物所用的小肠粘膜下层基质材料的X射线衍射谱(XRD)结果，其中在2θ＝8°范围存在一个较尖锐的峰，而2θ＝15-25°存在一个较为平缓的圆峰，表明基质材料在经过脱细胞工艺与成型工艺处理后，已改变了原来胶原蛋白的晶体结构，形成无定形结构，从而使X射线的衍射峰变宽变圆。这样的微结构，能够极大消除材料在微结构中的各向异性。而材料微结构中的各向异性导致细胞生长分布的各向异性，形成某些方向上的优势生长，从而形成瘢痕。而本发明的宫腔内置物使细胞生长分布无各向异性，从而避免瘢痕产生，防止宫腔粘连。

图4为宫腔内置物所用的小肠粘膜下层基质材料的亲水角测试图。生物材料表面的亲疏水性对表面吸附蛋白质的构象具有重要的影响，宫腔内置物所用的小肠粘膜下层基质材料的亲水角为45°，非常有利于细胞的黏附和铺展。

图5为宫腔内置物所用的小肠粘膜下层基质材料的红外图谱。材料的红外图谱中主要峰均体现为I型胶原蛋白的官能团振动峰，其中3308.26cm^-1峰值附近，是N-H伸缩振动；1640.33cm^-1附近，是酰胺I带的C＝O伸缩振动，1548.46cm^-1附近是酰胺Ⅱ带的 N-H弯曲振动；1066.41-1548.46cm^-1附近的吸收峰表明了胶原蛋白三股螺旋结构的完整性。另外，胶原的N-H伸缩振动位于3308.26cm^-1说明了肽键间氢键的存在。1240cm^-1与1450cm^-1峰强度的比值为0.99，基本上与I型胶原蛋白特征值1.0相同。因此，基质材料中，I型胶原蛋白三股螺旋结构保持较完整。为进一步明确基质材料中含有I型胶原，图6示出宫腔植入材料的脱细胞基质材料与现有基质材料的SDS-PAGE电泳结果图。图6中，最左侧条纹为对应于不同分子量标记物条纹，中间条纹为现有基质材料的电泳条纹，最右侧条纹为采用本发明方法制备的宫腔植入材料的细胞外基质材料的电泳条纹，其中表示从上至下排列的条纹依次表示I型胶原纤维、Γ链、β链、α₁链和α₂链。表面本发明中含有I型胶原蛋白。

此外，采用非交联工艺的基质材料成分除了I型胶原蛋白，还有少量的弹性蛋白与III型、IV型和VI型胶原蛋白。非交联工艺的基质材料含有有微量的活性生物分子，如纤维粘连蛋白、层粘连蛋白有利于细胞的粘附、生长；糖胺聚糖、蛋白多糖等分子作为生长因子结合位点，有利于保存各种生长因子，并阻碍胶原蛋白酶的降解，增加细胞迁移能力。此外，非交联工艺还使基质材料保留了原动物组织中的碱性纤维生长因子 (FGF-2)、转化生长因子(TGF-β1)和血管内皮生长因子(VEGF)等，保留率高于 45％，这些生长因子在组织血管化、功能重建过程起到关键性作用。与其他脱细胞材料所不同的是，小肠粘膜下层基质材料含有丰富的生物活性因子，这些活性因子使其能够积极诱导细胞进入材料，形成血管化组织，调控宿主组织的再生修复过程。

纤维粘连蛋白(fibronectin，FN)是一种大型的糖蛋白，存在于所有脊椎动物，分子含糖4.5-9.5％，糖链结构依组织细胞来源及分化状态而异。FN可将细胞连接到细胞外基质上。FN肽链中的一些短肽序列为细胞表面的各种FN受体识别与结合的最小结构单位。经质谱法测试，FN在宫腔植入材料所用的小肠粘膜下层基质材料的中的质量百分比含量>5％；经ELISA法检测，FN质量百分比含量在2.6％以上。

现有的细胞外基质材料采用皮肤、动脉、心包等弹性较大的组织，除I型胶原蛋白外，还含有较大含量的弹性蛋白。I型胶原蛋白强度比弹性蛋白强100倍以上，为细胞外基质提供力学强度，而弹性蛋白赋予基质优良的弹性，使细胞外基质可以伸长与收缩。由于弹性蛋白的存在，脱细胞基质的胶原蛋白不断降解，基质会因受力而伸长，不受力时则收缩变形，从而使组织无法重塑为正常形状，并因材料变形而使手术修复失败。另外，由于弹性蛋白在体内很难降解，而使脱细胞基质降解不完全，形成纤维包裹。而本发明所采用的粘膜下层材料中弹性蛋白含量极低，且经处理后，基本上被去除。图7、8 为经脱细胞处理后的小肠粘膜下层基质材料经Masson染色照片，其中无弹性蛋白存留。

由于宫腔植入材料所用的小肠粘膜下层基质材料为动物源性脱细胞材料，来源于异种材料的相关免疫原应尽量去除。通过脱细胞工艺处理制备的产品HE染色切片照片如图8所示，未发现残留细胞核。且DNA残留达到3.8ng/mg以下，远低于同类脱细胞材料水平，而α-Gal抗原清除率可达到99.4％。该项数据表明宫腔植入材料所用的基质材料脱细胞过程彻底，免疫原性去除率高，最大程度上降低了引起免疫排斥反应的风险。

实施方式1：

图9是根据本发明的一个实施方式的宫腔内置物的示意图，该宫腔内置物为袋状结构，外形大致为梯形，至少部分角部为弧形。开口2位于梯形较短的底边一侧。可以使用一片经真空冷冻干燥的小肠粘膜下层基质材料对折后制作，或者使用两片或多片基质材料制作。该宫腔内置物可以被放置于宫腔内并展开，从而达到隔离和保护创面，促进宫腔基底膜和粘膜等组织的恢复，防止粘连的发生。

进一步地，以上实施方式的宫腔内置物还可以包含支撑结构，从而在袋状结构内部撑开所述内置物，以进一步地防止发生宫腔粘连。支撑结构可以是气囊，优选Foley带气囊。通过预先将宫腔内置物包覆于未充气气囊表面，并置于宫腔内，后充气使气囊膨胀以支撑宫腔内置物，以进一步地防止发生宫腔粘连。

支撑结构还可以是节育器。图12是一种节育器的示意图；图13为一种节育器安放装置的示意图。在安放本实施方式的宫腔内置物1的过程中，可以将宫腔内置物1放置于宫腔内，通过将带有节育器3的节育器安放装置4穿过子宫口和宫腔内置物1的开口 2，然后使节育器3脱离节育器安放装置4，进入宫腔内置物1的内腔，节育器3在构件 1的内腔内自动扩张，与宫腔内置物1一起留置于宫腔内。

也可以将节育器3预先组装至宫腔内置物1的内腔中，并一起放置在节育器安放装置4中。然后使节育器安放装置4穿过子宫口，再使宫腔内置物1脱离节育器安放装置，进入宫腔，节育器3在构件的内腔内自动扩张并使宫腔内置物1扩张，从而使宫腔内置物1和节育器3一起形成的宫腔内置物留置于宫腔内。

实施方式2：

图10是根据本发明的另一种方式的宫腔内置物的示意图。该宫腔内置物1为袋状结构，外形大致为三角形，至少部分角部为弧形。开口2位于三角形的一个侧边上，开口2长度小于侧边长度，使得节育器3的各个端部可以卡在大致呈三角形的袋状结构1 的端部。在安放本实施方式的宫腔内置物的过程中，可以将节育器3预先放置于宫腔内置物1的内腔中，并共同放置于节育器安放装置4中。然后使节育器安放装置4穿过子宫口，再使宫腔内置物脱离节育器安放装置，进入宫腔，节育器3在构件的内腔内自动扩张并使宫腔内置物1扩张，从而使宫腔内置物1和节育器3一起形成的宫腔内置物留置于宫腔内。

实施方式3：

图11是根据本发明的另一种方式的宫腔内置物的示意图。该宫腔内置物1为袋状结构，外形大致呈圆形或椭圆形。开口2位于圆形或椭圆形的圆面上或圆边处。可以通过实施1或2的安放方式将节育器3和宫腔内置物1放置于宫腔内。

实施方式4：一种具有袋状结构的宫腔内置物的制备方法

(1)原料选择与初处理：取新鲜屠宰的猪小肠组织清洗洁净，分裂出小肠粘膜下层，将小肠粘膜下层组织材料分割，剔除淋巴组织，用自来水冲洗1-3次，再用纯化水冲洗至表面无污渍，然后将清洗后的猪小肠粘膜下层组织材料置于筛网等滤水装置上，静置五分钟以上，以将水滤干。

(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡猪小肠粘膜下层组织材料，该过程可在不锈钢桶中进行，过氧乙酸体积百分比浓度采用0.1％，乙醇体积百分比浓度采用5％，灭活时间2小时，溶液与猪小肠粘膜下层组织材料比例为5：1，温度为20℃；完成后在超声波清洗机中清洗数次至清洗液检测电导率为10以下终止。

(3)清洗：采用清洗液清洗猪小肠粘膜下层组织材料，清洗液为pH值为7.2-7.4 的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与猪小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为30︰1，优选清洗3次，每次20分钟；然后采用纯化水清洗，纯化水与猪小肠粘膜下层组织材料比例为30︰1，至检测电导率为10μS/cm以下终止；清洗过程在超声波清洗机中进行，频率40kHz，功率3000W。

(4)脱细胞：脱细胞液采用含有质量百分比浓度0.1％的胰蛋白酶溶液和浓度为0.5mmol/L的EDTA的PBS溶液，脱细胞液pH＝7.2-7.5，超声振荡清洗30分钟，温度 20℃，溶液与猪小肠粘膜下层组织材料比例为20：1，脱细胞过程在双频超声波装置中进行，包含低频和高频两个频率，其中低频频率为20KHz，高频频率为80KHz，超声功率为5KW，其中低频处理10min，高频处理10min，温度为30℃；功率5000W。

(5)清洗：采用清洗液进行清洗，清洗过程在超声波清洗机中进行，超声波的功率为3000W以上。清洗液为pH7.2-7.4的PBS溶液，PBS溶液温度为20℃，PBS溶液与猪小肠粘膜下层组织材料的比例(体积比)为30︰1，优选清洗3次，每次20分钟；然后采用20℃的降温的注射用水清洗，注射用水与猪小肠粘膜下层组织材料比例(体积比)为30︰1，检测清洗注射用水与未清洗注射用水电导率之差小于1μS/cm终止，频率优选40kHz，功率优选3000W以上。

(6)真空冷冻干燥：将一层或多层由步骤(5)得到的猪小肠粘膜下层基质材料放置在模具上，放入真空冷冻干燥机中进行猪小肠粘膜下层基质材料的冷冻干燥。上述步骤(6)所述的模具包括带针底板与压框，将一或多层猪小肠粘膜下层基质材料平铺于所述带针底板上，将所述压框放置于猪小肠粘膜下层基质材料上，将所述带针底板和所述压框相对固定。本发明提到的模具，具体的结构可以参考发明专利ZL201310203602.2。真空冷冻干燥为：将带有小肠粘膜下层基质材料的模具放置于真空冷冻干燥机中；先预冻至-45℃，保温1小时；然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温6小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4小时，完成真空冷冻干燥；冷冻干燥装置的腔室内的压强为25-30Pa。得到冷冻干燥后的小肠粘膜下层基质材料。

(7)成型：取由步骤(6)得到的冷冻干燥后的小肠粘膜下层基质材料，以折叠处为长底边缝制梯形的袋子。缝制成的袋子，短底边处开口，短底边约为长底边的1/3左右，能够保证节育器套管放入，且保证已经在其内打开的节育器不会掉出来。设计为不同的大小规格，适合不同个体需要。缝线使用可生物降解的外科手术线。缝制过程亦需控制无菌。

本实施方式还可以进一步包括以下步骤：

打孔包装步骤(8)，所述步骤(8)打孔包装，具体为：干燥材料在模具上切割成固定的形状(包括方形、圆形或其他形状)，然后放入机械打孔机中，以间距0.9cm进行打孔，孔直径1.5毫米，然后采用特卫强包装袋包装。

灭菌解析步骤(9)，所述步骤(9)灭菌解析步骤具体为：采用环氧乙烷进行灭菌，灭菌条件为：先温度20-40℃保温时间2-4小时，湿度30-70％(优选60％)，然后通入浓度300-1000mg/L(优选800mg/L)环氧乙烷，灭菌4-8小时；解析过程在通风的解析室中进行，温度控制在10-30℃之间，时间14-28天。

还可以根据实际需要，在真空冷冻干燥步骤(6)与成型步骤(7)之间完成打孔，相应地，包装步骤中，则无需再次打孔。

上述打孔的步骤可以避免袋状内置物中积存液体，而引发感染。打孔步骤利于组织修复。

对上述实施例所制备的生物材料进行理化性质、生物学检测。

1.对制备的生物材料进行物理性能检测

1)孔隙率测定：采用孔隙率测定仪测定材料的孔隙率，实施方式4提供的样品的孔隙率为90％。

2)缝合保持力检测：方法：用2-0号外科缝线或相同直径的不锈钢丝缝合在生物材料一端边缘2毫米处，将缝线或不锈钢丝与生物材料的另一端固定在拉力仪上，以 20mm/min的速度进行拉伸，直到缝合点被撕裂，记录下缝合点被撕裂时的拉力。按上述方法对3批样品进行检测。结果：缝合抗拉强度大于或等于6N。

3)抗张强度检测方法：方法：使用拉伸(压缩)试验机，将补片裁剪成条状试样，裁剪后在相对湿度40％-60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2小时后立即进行试验。将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上，以100mm/min的速度依次向外拉伸直到试样断裂，以N为单位记录下试样断裂时的力。按照上述方法对3批样品进行检测。结果大于 200N。

4)爆破强度检测：方法，使用拉伸(压缩)试验机，将材料裁剪成23×23mm的正方形式样备用，在相对湿度为40％-60％，温度为22℃±2℃的条件下放置2小时后立即进行试验。用环形夹具将试样固定在拉伸试验机的工作台上，使球形探头以750mm/min 的速度穿过试样，记录下探头穿破试样的力。按上述方法对3批样品进行检测。结果：爆破强度大于120N。

2.化学性能检测

1)检验液制备：取样品的厚度均匀部分，切成1cm²的碎片，用水洗净后晾干，然后加入玻璃容器中，按样品总表面积(cm²)与水(mL)的比为5:1的比例加水，加盖后置于压力蒸汽灭菌器中，在121℃加热30min，加热结束后将样品与液体分离，冷至室温作为检验液。取同体积水置于玻璃容器中，同法制备空白对照液。

2)病毒检测：选择伪狂犬病毒为指示病毒，采用实时定量PCR法检测病毒的DNA 拷贝数，检测3批样品。结果：病毒DNA拷贝数为0。

3)酸碱度：按GB/T 14233.2-2005中5.4.1《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析法》中规定的方法试验，结果：检验液与空白对照液的PH值之差不超过1.5。

4)DNA残留检测：依据生物制剂残留DNA检测方法《中国药典》2015年版第四部，采用荧光染色法检测实施例所提供的样品DNA残留量。结果：实施例所提供的样品的DNA残留量小于10ng/mg。

5)细菌内毒素：按照GB/T 14233.2-2005《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分：生物学试验方法》进行检测，共3批样品，结果：细菌内毒为20EU/套。

6)环氧乙烷残留：按GB/T14233.1-2008《医用输液、输血、注射器具检验方法第 1部分：化学分析法》中9的规定的方法试验，结果：产品环氧乙烷残留量不超过10ug/ 套。

3.动物实验

动物模型选取12周龄成年雌性新西兰大白兔，体重2500克左右，普通级。实验前24h每只兔耳缘静脉注射绒毛膜促性腺激素50IU，使内膜生长同步。取下腹正中长约 2cm纵切口进腹，查见双侧子宫，根据分组给予相应处理后缝合腹部切口。实验分组： A组：对照组：右侧子宫，于子宫中下1/3处作1.5cm纵切口，经切口放置袋状子宫修复材料大小3*0.5cm。缝合，作为补片对照。左侧子宫仅做子宫切口后缝合作为空白对照。B组：建模组：机械损伤建模法：右侧子宫，于子宫中下1/3处作1.5cm纵切口，切除半侧宫腔内膜及粘膜下层；左侧子宫，切除半侧宫腔内膜及粘膜下层，生理盐水冲洗宫腔。经切口放置子宫修复材料大小3*0.5cm。C组：治疗组：右侧子宫，于子宫中下1/3处作1.5cm纵切口，切除全宫腔内膜及粘膜下层；左侧子宫宫腔切除全宫腔内膜及粘膜下层。生理盐水冲洗宫腔。经切口放置子宫修复材料大小3*0.5cm。围手术期应用抗生素3天。分别于手术后7d，14d，28d处死动物，留取子宫标本，行HE染色和 Masson染色，明确粘连情况及子宫内膜腺体数量、创面纤维化程度。结果表明，以A 组：对照组中样品空白对照组与空白对照组为基线，观察B组：建模组、C组：治疗组中，在造模后创面无子宫修复材料的宫腔修复时纤维化面积比例增加，腺体数量减少，发生明显粘连，妊娠能力明显下降，有显著差异(P＜0.05)。而在造模后创面加子宫修复材料的宫腔修复时纤维化面积比例、腺体数量减少两项指标与对照组相比无明显差异，未发现粘连发生，相比于无修复材料组明显改善子宫内膜修复过程，有显著差异(P＜0.05)。

Claims (13)

1.一种宫腔内置物，其特征在于，所述宫腔内置物具有袋状结构，所述宫腔内置物包括经脱细胞处理的动物小肠粘膜下层基质材料。

2.根据权利要求1所述的宫腔内置物，其特征在于，所述小肠粘膜下层基质材料包含碱性纤维生长因子、转化生长因子和血管内皮生长因子。

3.根据权利要求1或2所述的宫腔内置物，其特征在于，所述小肠粘膜下层基质材料中纤粘连蛋白的质量百分比含量在2％以上。

4.根据权利要求1所述的宫腔内置物，其特征在于，所述袋状结构具有内腔和开口，所述内腔由所述小肠粘膜下层基质材料围成。

5.根据权利要求4所述的宫腔内置物，其特征在于，所述宫腔内置物还包括支撑构件，所述宫腔内置物的内腔能够容纳所述支撑构件，所述支撑构件能够在所述开口处进出所述袋状结构的所述内腔。

6.根据权利要求5所述的宫腔内置物，其特征在于，所述支撑构件为节育器或气囊。

7.根据权利要求1-6中的任意一项所述的宫腔内置物，其特征在于，所述内置物的形状基本上呈以下形状：

梯形，所述梯形底边长为0.5-6cm，高度为0.5-7.5cm，所述开口位于较短底边处；优选地，所述梯形的至少一个角部为弧线形；

三角形，所述三角形底边长为0.5-6cm，高度为0.5-7.5cm，所述开口位于一个侧边上；优选地，所述三角形的至少一个角部为弧线形；

圆形，所述圆形直径为0.5-7.5cm，所述开口位于圆形的圆边处或圆形的圆面上；或者

椭圆形，所述椭圆形短轴为0.5-6cm，长轴为0.5-7.5cm，所述开口位于椭圆形的圆边处或圆面上。

8.根据权利要求7中的任意一项所述的宫腔内置物，其特征在于，所述袋状结构表面打有孔；优选地，所述孔间距0.2-1厘米，孔直径0.5-3毫米。

9.一种宫腔内置物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)组织前置处理；(2)病毒灭活：采用过氧乙酸-乙醇溶液浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活；(3)清洗；(4)脱细胞：脱细胞液为溶有胰蛋白酶和EDTA的PBS溶液，脱细胞过程在多频超声波装置中进行；(5)清洗，得到小肠粘膜下层基质材料；(6)真空冷冻干燥：在真空冷冻干燥机中进行；(7)成型：将由步骤(6)得到的经真空冷冻干燥的小肠粘膜下层基质材料制成袋状结构。

10.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中，脱细胞液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.01-0.2％，优选0.02-0.05％；EDTA的浓度为0.1-1mmol/L，优选0.4-0.8mmol/L；脱细胞液的pH值为7.0-8.0，优选为7.2-7.5；所述脱细胞液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1，脱细胞过程在双频超声波装置中进行，其中低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，脱细胞液的温度范围为20-35℃；超声功率5000W以上。

11.根据权利要求9所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(6)中，将一层或多层由步骤(5)得到的小肠粘膜下层基质材料放置在模具上，放入真空冷冻干燥机中进行小肠粘膜下层基质材料的冷冻干燥；其中将带有小肠粘膜下层基质材料的模具放置于真空冷冻干燥机中；先预冻至-45℃，保温1-2小时；然后开启真空泵，调节温度至-15℃，保温5-7小时，再调节温度至0℃，保温2小时，最后调节温度至25℃，保温4小时，完成真空冷冻干燥；冷冻干燥装置的腔室内的压强为1-50Pa。

12.根据权利要求9中任意一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(7)中，所述袋状结构包括内腔和开口，所述开口能够允许支撑构件在所述开口处进出所述袋状结构的内腔，所述内腔能够容纳所述支撑构件。

13.一种宫腔内置物在宫腔内置医疗器械中的应用，其特征在于，所述宫腔内置医疗器械用于修复宫腔内膜或基底层损伤，用于预防和治疗宫腔粘连，用于防止宫腔前后壁发生纤维化或瘢痕化，或者用于预防和治疗由宫腔粘连所导致的不孕、习惯性流产、月经过少、痛经、经血反流或闭经。