CN107854727B - 生物肌腱修复材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种生物肌腱修复材料及其制备方法，包括经免疫原去除处理的细胞外基质本体，所述的细胞外基质本体为一层或者多层，一层或者多层构成的细胞外基质本体包括第一表面和第二表面，所述的第一表面包括第一区域和第二区域，所述第一区域的力学强度低于所述第二区域的力学强度。该修复材料经免疫原去除处理的细胞外基质制备、不会发生分层现象，且该材料具有第一区域和第二区域构成的一个表面,既有利于缺损组织的细胞浸润、完成组织的修复,也可以使得修复材料受到的应力能够均匀分布，避免出现局部应力过大的情况；此外还具有相对较高的缝合保持力，能够作为修补材料的缝合区的第二表面，能够在有利于缺损组织修复的同时保证修复材料的强度。

Description

生物肌腱修复材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物肌腱修复材料及其制备方法。具体而言，涉及一种经免疫原去除处理后的细胞外基质生物修复材料。该生物材料适于修复肌腱，尤其适于肩袖修补。
背景技术
利用细胞外基质制造的可降解生物修复材料是一种良好的组织修复材料。细胞外基质是由同种或异种异体的组织采用脱细胞技术，去除能引起宿主免疫排斥反应的所有成分，得到完整保留细胞外基质和立体支架结构。利用细胞外基质修复缺损组织时，宿主细胞在细胞外基质上生长，分泌新的细胞外基质成分，形成自身组织，从而完成对缺损组织的修复和重建。
基于组织工程学原理，以动物组织为原料的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)材料是主要发展方向。ECM是由多种大分子物质如胶原、非胶原性蛋白、氨基聚糖、弹性蛋白等成分，按一定比例和结构建成的复杂的有机三维整体，为各种细胞的生存及活动提供适宜的场所和微环境，能够调节各种细胞的生长、形状、代谢、迁移、增殖和分化，进而调控组织和器官功能。组织缺损的一个重要原因是ECM的丧失，这也是机体自身无法实现组织修复和再生的原因。天然的ECM可以作为组织再生的“土壤”，是理想的组织修复材料。去除动物组织的细胞成分可以去除大部分的免疫原性，并保留ECM成分，可以开发出理想的生物修补材料。目前，已经用于临床的生物活性材料包括同种异体真皮、猪小肠粘膜下层、猪真皮、胚胎牛真皮等ECM材料。其中脱细胞小肠粘膜下层(small intestinal submucosa,SIS)基质材料是目前学术界公认的最理想的组织修复材料。
现有的移植材料中，通常使用复合结构改善材料性能。例如中国专利申请CN106420109A其中请求保护具有粗糙面和光滑面的补片，利用光滑面阻隔细胞，并利用粗糙面诱导细胞长入。而中国专利申请CN102698318A公开了一种生物材料复合补片，其中利用医用缝合线或医用胶将人工合成材料补片与生物材料补片结合而获得该复合补片。该补片同时具备生物材料的易于周围组织长入及新生血管生成的优点，还具有持续的远期力学强度。
然而上述材料为层叠结构。在植入人体后，补片材料在使用过程中会因为人的运动而产生形变。虽然在所用的各层材料之间使用了连接线或粘合剂，但是由于层叠结构使用不同材质的材料，各材料对发生的形变和产生的应力不同，因而在使用过程中会因为形变及应力的不相匹配而导致出现层叠结构的分层现象。这种现象使层叠结构的分层区域形成空腔，组织液在这些形成的空腔中留滞，导致出现炎症等并发症。
此外，上述两种移植材料都引入了其它的材料或物质提高强度，例如使用交联剂、缝合线、医用胶或者试剂粘合等。这样的复合材料由于引入了新材料或新物质而有可能引入新的免疫原或者不可降解物质，另一方面为保证结合强度将导致修补材料厚度大大增加而带来植入后的不适感。尤其是不可降解材料的引入降低了生物相容性，剩余的不可降解的高分子材料作为永久植入物留置体内，有可能引发体内组织粘连或瘘等并发症。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供一种生物肌腱修复材料，该修复材料经免疫原去除处理的细胞外基质制备、不会发生分层现象，且该材料具有第一区域和第二区域构成的一个表面,既有利于缺损组织的细胞浸润、完成组织的修复,也可以使得修复材料受到的应力能够均匀分布，避免出现局部应力过大的情况；此外还具有相对较高的缝合保持力，能够作为修补材料的缝合区的第二表面，能够在有利于缺损组织修复的同时保证修复材料的强度。
为实现上述一个或多个目的，本发明采用的技术方案为：一种生物肌腱修复材料，包括经免疫原去除处理的细胞外基质本体，所述的细胞外基质本体为一层或者多层，一层或者多层构成的细胞外基质本体包括第一表面和第二表面，所述的第一表面包括第一区域和第二区域，所述第一区域的力学强度低于所述第二区域的力学强度。
所述的第一区域为经过复水处理的区域。如作为一些实施例，所述复水处理的所用水的面密度为0.005～0.5g/cm2，优选0.01～0.2g/cm2，更优选0.02～0.1g/cm2。
所述第一区域具有疏松结构，所述第二区域具有致密结构。
所述第二表面具有致密结构。
作为优选，所述第一区域的断裂强度低于所述第二区域的断裂强度。
作为优选，所述第一区域的缝合保持力低于所述第二区域的缝合保持力。
作为优选，所述第一区域为一个或多个条状区域或者所述第一区域为一个或多个矩形区域或者所述第一区域为一个或多个环形或多边形或圆形区域。
作为优选，所述第一区域为多个时，多个第一区域通过第二区域隔离实现间隔设置。
作为进一步优选，所述第一区域为多个时，所述的多个第一区域均贯穿整个修复材料长度方向或者多个第一区域均贯穿整个修复材料宽度方向。所述的贯穿即当第一区域的长度延伸方向与修复材料长度的延伸方向一致时，二者长度等长；当第一区域的宽度延伸方向与修复材料宽度的延伸方向一致时，二者宽度等宽。
作为优选，所述第二区域包围所述第一区域。
作为优选，所述第一区域优选为条状或环形或多边形或圆形区域。所述第一区域的条状或环形区域的宽度为修复材料(植入材料)最大宽度的1/10～1/2，优选1/8～1/4。与第二区域相比，第一区域生物活性相对更高，但是力学强度相对较低，因而可以根据修补区域所需的力学强度调整修补材料的整体强度。例如修补肌腱时，特别是对桥接形修补，可以选择相对小的第一区域的宽度。而对于应力较低的修补情况，例如内膜修补，可以选择相对较大的第一区域宽度，使与待修复组织接触、具有较高生物活性的第一区域占据更大的面积，而位于修补材料周围的第二区域可以提供较高的缝合保持力。通过多种设置区域形状可以针对多种修复区域进行修复，由于复合表面结构能够分散应力，因而非常有利于修复应力比较集中的肌腱，尤其可以修复肩袖缺损。该修复材料在保证缺损组织细胞生长的同时能够保证应力的均匀分布。
本发明所述第一表面为连续表面。
本发明所述的细胞外基质来自同种异体或异种生物的组织材料，优选真皮基质、腹膜、粘膜下层或器官包膜。
本发明所述的粘膜下层包括膀胱粘膜下层、子宫粘膜下层或小肠粘膜下层，优选猪或牛的小肠粘膜下层。
本发明所述的器官包膜包括心包膜，优选牛心包膜。
本发明所述的第一表面接触缺损组织，所述的第二表面接触产生创面的组织。
本发明还提供一种用于制备前述生物肌腱修复材料的制备方法，制备步骤包括：1)对生物组织材料进行初步处理；2)对初步处理后的生物组织进行免疫原去除处理，得到细胞外基质材料；3)将一层或多层细胞外基质材料放置于模具上，并进行干燥；4)对所述模具上细胞外基质材料的至少部分区域复水；5)进行冷冻干燥。
所述步骤4)中的复水操作包括通过转移的方式向所述至少部分区域施加水。
所述步骤4)中的复水操作包括通过喷洒的方式向所述至少部分区域施加水。
所述复水操作的所用水的面密度(即水在修复材料单位面积内的含量)为0.005～0.5g/cm2，优选0.01～0.2g/cm2，更优选0.02～0.1g/cm2。
作为一些实施例，本发明步骤1)进行初步处理，初步处理还可包括病毒灭活，例如采用病毒灭活液，例如过氧乙酸-乙醇溶液，浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活，该过程可在不锈钢桶中采用过氧乙酸-乙醇溶液进行。其中，过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的浓度为0.1％-5％(体积百分比)，优选0.5-2％；乙醇的体积百分比浓度为5％-40％；过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间0.1-10小时，温度范围为10-40℃(即浸泡小肠粘膜下层组织材料的过氧乙酸-乙醇溶液的温度)。病毒灭活后清洗小肠粘膜下层组织。
作为一些实施例，本发明步骤2)对初步处理后的生物组织进行免疫原去除处理，得到细胞外基质材料：包括采用免疫原去除液处理，免疫原去除液包括胰蛋白酶和PBS溶液，还包括乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)或乙二胺四乙酸四钠(EDTA-4Na)；溶液可以在双频超声环境下进行免疫原去除；免疫原去除液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.01-0.2％，优选0.02-0.05％；EDTA、EDTA-2Na或EDTA-4Na的浓度为0.1-1mmol/L，优选0.4-0.8mmol/L；脱细胞液的pH值为7.0-8.0，优选为7.2-7.5，免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1；免疫原去除过程在双频超声波装置中进行，其中低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，脱细胞液的温度范围为20-35℃；超声功率5000W以上；采用胰蛋白酶和EDTA，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到脱细胞目的。采用上述超声方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞从基质上完全脱离，到达最佳的免疫原去除效果。免疫原去除还可以采用氢氧化钠溶液、氯化钠溶液，以及含有DNA酶和α-半乳糖苷酶的溶液完成。得到经免疫原去除处理的细胞外基质。免疫原去除处理后，对得到的细胞基质进行清洗。
作为一些实施例，本发明步骤3)将一层或多层细胞外基质材料放置于模具上，并进行干燥：将经过前述步骤得到的细胞外基质材料组装至模具上，模具包括带针底板与压框，将多层细胞外基质材料平铺于带针底板上，然后将所述压框放置于细胞外基质上，并将带针底板和所述压框相对固定；在干燥箱内进行初步干燥，通过真空或鼓风的方式进行干燥。此次干燥使得细胞外基质中的胶原纤维紧密结合，形成低孔隙结构，具有较为致密的结构以及较高的力学性能。
作为一些实施例，本发明步骤4)对所述模具上细胞外基质材料的至少部分区域复水：将干燥后的材料取出并进行局部复水，已经干燥的细胞外基质复水后，其中的胶原纤维排布发生变化，再进行冷冻干燥将形成较疏松的多孔结构；在初步干燥后的材料中，如果施加过多的水，水的扩散可能导致复水区域范围不可控制，因而需要控制复水所用的水量；经比较发现，完全复水后经冷冻干燥的材料的厚度可以达到第一次干燥后厚度的1.5倍以上或2倍以上，即厚度增加0.5倍以上或1倍以上；通常经第一次干燥后材料厚度为0.005～0.5cm，优选0.01～0.2cm，更优选0.02～0.1cm。为避免所用复水的水过量，可以以面密度为0.005～0.5g/cm2，优选0.01～0.2g/cm2，更优选0.02～0.1g/cm2的水量施加水；复水可以通过滴加或喷洒的方式，例如通过移液枪通过框型模具将水滴加到经干燥的细胞外基质材料表面；复水的方式还可以是通过转移的方式，例如通过利用亲水材料或经亲水处理的材料，例如经亲水处理的聚四氟乙烯块，在其表面吸附水分后转移至细胞外基质材料表面。
作为一些实施例，本发明步骤5)进行冷冻干燥：细胞外基质局部复水后移入冷冻干燥机中，进行冷冻干燥；开启压缩机对冻干箱致冷，进行预冻及保温；然后开启真空泵，逐步调整温度完成冻干。经冷冻干燥后的材料经局部复水一侧的表面包括第一区域和第二区域，其中经复水后冷冻干燥的为第一区域、其具有多孔的表面，相对第二区域在结构上更疏松(第一区域可称为疏松结构区域，第二区域可称为致密结构区域)，具有相对较低的力学强度以及更利于缺损组织细胞长入。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
1.本发明中的材料为在同侧表面具有力学性能不同的区域结构构成的复合表面结构，因而兼具两种细胞外基质的优点。该第一区域的结构更利于细胞的生长和爬附，而第二区域的结构具有较高的抗拉伸强度。
2.本发明的修复材料，当为多层时，每层材料为同一细胞外基质制造，因而不会出现分层的情况。
3.本发明的修复材料，在使用过程中，第二区域能够使产生的拉力均匀分布于整个材料表面，避免了局部拉力过大，保证了补片(修复材料)的结构安全性；该第二区域还具有较高的拉伸强度以及缝合保持力，有利于在组织修复中的应用。
4.本发明的修复材料仅仅包括经免疫原去除处理的生物材料，无需增加额外的粘合材料或缝线等层间固定物质；不会产生传统由于使用交联剂、缝合线、医用胶或者试剂粘合等修复材料而导致的如下缺陷：由于引入了新材料或新物质而有可能引入新的免疫原或者不可降解物质，另一方面为保证结合强度引入粘合剂等将导致修补材料厚度大大增加而带来植入后的不适感，尤其是不可降解材料的引入降低了生物相容性，剩余的不可降解的高分子材料作为永久植入物留置体内，有可能引发体内组织粘连或瘘等并发症。
5.本发明的生物组织基质肌腱修复材料能够适应肌腱修补，提供足够强度以及细胞爬附表面；因而可以针对多种适应症形成多种医用肌腱修复产品。
6.本发明的修复材料，在一侧表面同时提供有疏松结构区域和致密结构的区域，且两种区域的形状可以根据修复位置而进行定制，即根据修补区域通过控制复水区域来形成具有疏松结构的区域和致密结构的区域，该疏松结构区域具有微孔，有利于缺损组织的细胞浸润，缺损组织细胞长入疏松区域完成组织的修复；致密结构区域力学强度较高，起到加强筋作用，使得修复材料受到的应力能够均匀分布，避免出现局部应力过大的情况；此外致密结构区域还具有相对较高的缝合保持力，能够作为修补材料的缝合区；总之，本发明具有复合表面的修复材料，能够在有利于缺损组织修复的同时保证修复材料的强度。
7.本发明的修复材料的结构，其一侧表面(第二表面)由于未经复水再干燥操作，因而具有均一的致密结构，在使用修补材料进行修补过程中，修补材料两侧表面分别接触不同组织，具有复合结构的表面接触缺损组织，具有均一的致密结构接触其它组织；当其它组织因炎症、手术器械碰撞等因素出现创面时，其表面细胞若直接接触缺损组织则会发生粘连，当具有均一的致密结构接触创面时，能够促使创面自身细胞在这一侧表面上爬附生长，并在此上皮化。细胞上皮化后不会再与其它细胞发生粘连。本发明所提供的修补材料两侧分别具有不同性质，从而避免在修复过程中修补材料两侧组织之间发生粘连。
附图说明
图1是根据本发明一种实施方式的生物肌腱修补材料示意图；
图2是根据本发明另一种实施方式的生物肌腱修补材料示意图；
图3是根据本发明另一种实施方式的生物肌腱修补材料示意图；
图4是根据本发明另一种实施方式的生物肌腱修补材料示意图；
图5是根据本发明另一种实施方式的生物肌腱修补材料示意图；
图6是根据本发明实施方式中作力学性能测试所取的动物组织；
图7是在不同时间点取得的修补肩袖肌腱抗拉强度；
图8是在不同时间点取得的肩袖肌腱弹性模量；
图9是无复合结构的修补材料的受力分析示意图；
图10是根据本发明实施方式的具有复合结构的修补材料上受力分析示意图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但本发明实施方案不局限于此。
对生物组织材料进行初步处理。取小肠进行分割，剥离出小肠粘膜下层组织材料，清洗后滤干。取用时，将滤水后的小肠用量筒等量取体积的装置进行量取。取用其它生物组织时，也须先将细胞外基质剥离，并进行初步清洗。初步处理还可包括病毒灭活，例如采用病毒灭活液，例如过氧乙酸-乙醇溶液，浸泡小肠粘膜下层组织材料进行病毒灭活，该过程可在不锈钢桶中采用过氧乙酸-乙醇溶液进行。其中，过氧乙酸-乙醇溶液中过氧乙酸的浓度为0.1％-5％(体积百分比)，优选0.5-2％；乙醇的体积百分比浓度为5％-40％；过氧乙酸-乙醇溶液与小肠粘膜下层组织材料的体积比为(3-20)︰1，灭活时间0.1-10小时，温度范围为10-40℃(即浸泡小肠粘膜下层组织材料的过氧乙酸-乙醇溶液的温度)。病毒灭活后清洗小肠粘膜下层组织上残余的病毒灭活液。
对初步处理后的生物组织进行免疫原去除处理，得到细胞外基质材料。该步骤包括采用免疫原去除液处理。免疫原去除液包括胰蛋白酶和PBS溶液，还包括乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)或乙二胺四乙酸四钠(EDTA-4Na)。溶液可以在双频超声环境下进行免疫原去除。免疫原去除液中胰蛋白酶的质量百分比浓度为0.01-0.2％，优选0.02-0.05％；EDTA、EDTA-2Na或EDTA-4Na的浓度为0.1-1mmol/L，优选0.4-0.8mmol/L；脱细胞液的pH值为7.0-8.0，优选为7.2-7.5。免疫原去除液与小肠粘膜下层组织材料体积比为(20-40)︰1。免疫原去除过程在双频超声波装置中进行，其中低频频率范围为20-40KHz，高频频率为60-90KHz，其中低频处理5-40min，高频处理5-40min，脱细胞液的温度范围为20-35℃；超声功率5000W以上。采用胰蛋白酶和EDTA，使细胞与细胞外基质之间的连接被破坏；采用低频超声对细胞进行破碎，同时使用高频超声作用于破碎的细胞及细胞外基质，进一步使细胞脱离细胞外基质，达到脱细胞目的。采用上述方式，对整个细胞脱离基质过程中的各个步骤进行强化，使细胞从基质上完全脱离。到达最佳的免疫原去除效果。免疫原去除还可以采用氢氧化钠溶液、氯化钠溶液，和/或含有DNA酶、α-半乳糖苷酶的溶液完成。得到经免疫原去除处理的细胞外基质。
将经过前述步骤得到的细胞外基质材料组装至模具上，模具包括带针底板与压框。将多层细胞外基质材料平铺于带针底板上，然后将所述压框放置于细胞外基质上，并将带针底板和所述压框相对固定。在干燥箱内进行初步干燥。此次干燥使得细胞外基质中的胶原纤维紧密结合，形成低孔隙结构，具有较为致密的结构以及较高的力学性能。
将干燥后的材料取出并进行局部复水。已经干燥的细胞外基质复水后，其中的胶原纤维排布发生变化，再进行冷冻干燥将形成较疏松的多孔结构。在初步干燥后的材料中，如果施加过多的水，水的扩散可能导致复水区域范围不可控制，因而需要控制复水所用的水量。经比较发现，完全复水后经冷冻干燥的材料的厚度可以达到第一次干燥后厚度的1.5倍以上或2倍以上，即厚度增加0.5倍以上或1倍以上。通常经第一次干燥后材料厚度为0.005～0.5cm，优选0.01～0.2cm，更优选0.02～0.1cm。为避免所用复水的水过量，可以以面密度为0.005～0.5g/cm2，优选0.01～0.2g/cm2，更优选0.02～0.1g/cm2的水量施加水。复水可以通过滴加或喷洒的方式，例如通过移液枪通过框型模具将水滴加到经干燥的细胞外基质材料表面。复水的方式还可以是通过转移的方式，例如通过利用亲水材料或经亲水处理的材料，例如经亲水处理的聚四氟乙烯块，在其表面吸附水分后转移至细胞外基质材料表面。
静置使细胞外基质局部复水，然后移入冷冻干燥机中，进行冷冻干燥。开启压缩机对冻干箱致冷，预冻至-60～-30℃，保温，然后开启真空泵逐渐升温，完成冷冻干燥。经冷冻干燥后的材料的经局部复水一侧的表面包括第一区域和第二区域，其中经复水后再次干燥的第一区域具有多孔的表面，相对第二区域在结构上更疏松，具有相对较低的力学强度以及更利于缺损组织细胞长入。
如附图：本发明的修复材料，具体包括经免疫原去除处理的细胞外基质本体，所述的细胞外基质本体为一层或者多层，一层或者多层构成的细胞外基质本体包括第一表面和第二表面(即一层或者多层的细胞外基质本体相互叠加，构成了相对的第一表面和第二表面，或者也可以称之为一个是上表面一个是下表面)，所述的第一表面包括第一区域1和第二区域2，所述第一区域的力学强度低于所述第二区域的力学强度。
如图1-5所示的修补材料提供了不同形状的第一区域示意图，其中1表示第一区域，2表示第二区域。图1所示为第一区域包括多个矩形区，第二区域为以使第一区域相互隔离的方式分布，包括位于修补材料(修复材料)周围的部分以及分别位于第一区域的矩形区之间的条带部分。修补材料中部的第二区域用于分散应力能够起到加强筋的作用，位于补片周围的第二区域除起到加强筋的作用外还可以设置缝合孔，用于提供较高的缝合保持力；该结构是第二区域包围第一区域。
图2所示为具有多个条状第一区域的修补材料；图3所示为具有多个面积不等大的块状结构第一区域的修补材料；图4所示为具有多个贯穿整个修补材料长度方向的第一区域的修补材料，该贯穿方向也可为宽度方向(即多个第一区域长度方向与修补材料的长度方向一致且等长，或者多个第一区域长度方向与修补材料的宽度方向一致且长度与修补材料的宽度相等)。图5所示为内部具有单个第一区域的修补材料。修补材料中第一区域的形状1也可以为环形，或根据实际需求进行第一区域的形状变化。修补材料本身的形状也可以根据适应症而调整为圆形、正多边形或不规则形状。
在实际制备过程中，对于具有如图4所示的结构的修补材料，例如每个条形第一区域宽施加以0.01～0.2g/cm2的面密度，更优选以0.02～0.1g/cm2的面密度施加水。
上述处理步骤还可以用于处理同样含有细胞外基质的其它生物组织，例如牛的小肠粘膜下层或牛心包膜
经冷冻干燥后的材料还可以通过以下步骤处理：
打孔包装：干燥材料取出后，在模具上用切割装置按预定尺寸切割，然后放入机械打孔机中进行打孔，然后采用双层特卫强包装袋包装。
灭菌解析：采用环氧乙烷进行灭菌；解析过程在通风的解析室中进行。
经两次干燥处理后的细胞外基质材料，在其一个表面具有复合表面结构，即同时包括疏松结构(多孔结构)区域和致密结构区域的第一表面，这完全不同于以往的修补材料。第一次的干燥使得细胞外基质的胶原纤维形成相对致密的结构。细胞外基质材料经过复水处理时，被复水的区域由于水分的渗入，胶原纤维之间的空间结构发生变化，进行冷冻干燥后形成多孔结构。复水的位置经过模板或用转移的方式进行选择，因而冻干过程对未复水的第一次干燥过的区域影响很小甚至没有影响，即未复水的结构基本上保持第一次干燥后的状态，具有较高抗拉伸强度和缝合保持力，一方面能够保证整个细胞外基质的整体强度，另一方面能够防止在缝合过程中材料的缝合孔发生破损。其中多孔结构区域容易被水或细胞浸润，更有利于细胞长入从而完成组织的修复。而致密结构区域力学强度较高，起到加强筋作用，使得修复材料受到的应力能够均匀分布，避免出现局部应力过大的情况。此外，由于细胞的爬附和生长性的差异，致密区域的体内降解速度也低于多孔区域，因而修复材料还能够在体内降解过程保持强度。
此外，由于复水的水量受到控制，另一侧表面即第二表面同样保持第一次干燥后的状态，致密而且表面光洁度较高。这层致密结构能够控制细胞在其表面爬附生长，并完成上皮化。上皮化作用避免了修复材料两侧组织之间发生粘连。
本发明修复材料具有的第一表面和第二表面，也可以理解为修复材料的上表面和下表面，两个表面相对设置。
对得到的修复材料进行力学性能测试：
利用经复水的第一区域所用的工艺制作长5cm宽2cm的待测样1，该工艺为：经层叠的细胞外基质材料在干燥箱干燥后，整个表面复水后，再进入真空冷冻干燥箱干燥。
用未经复水第二区域所用工艺制作长5cm宽2cm的待测样2，该工艺为经层叠的细胞外基质材料在干燥箱干燥后，所有表面区域不经历复水，进入真空冷冻干燥箱干燥。
利用本文提供的制备方法制备在单侧面上具有复合结构的长5cm宽2cm待测样3，该修复材料具有如图4所示结构，其中材料中部具有1cm宽的第一区域。
所有待测样复水三分钟后，使用拉力测试机(MED-01，济南兰光机电技术有限公司)进行测量，测试结果如下表1-2所示：
表1：16层样品不同处理工艺下断裂拉力
断裂拉力(N) 缝合保持力(N)
待测样1 82.2±8.3 24.4±4.6
待测样2 112.2±13.4 32.5±6.1
待测样3 98.7±10.1 31.8±5.5
表2：20层样品不同处理工艺下断裂拉力
断裂拉力(N) 缝合保持力(N)
待测样1 102.3±6.5 30.5±3.5
待测样2 146.5±3.7 42.5±4.2
待测样3 125.4±3.5 41.3±3.8
对于采用第二区域所用工艺制备的待测样2，细胞外基质未进行复水而经过两次干燥，因而具有最高的力学强度，但是其双侧表面均为致密结构，虽然有利于细胞上皮化，但不利于缺损细胞的长入。而经复水并真空冷冻干燥处理得到的待测样1，其微观结构因冷冻干燥而发生变化，其力学强度下降，但是其生物学功能得到加强，即形成的疏松结构，有利于细胞的长入。而具有复合结构的待测样3则同时具有二者的优点，其第二区域处具有高强度，而第一区域处具有有利于细胞长入的疏松结构。此外，通过将缝合点设置在具有高强度的第二区域处，则能够获得与待测样2基本上相同的缝合保持力。
图9是无复合结构的修补材料的受力分析示意图；图10是根据本发明实施方式的具有复合结构的修补材料上受力分析示意图。根据受力分析示意图可知，无复合结构的修补材料上各点受力情况基本相同，在薄弱处容易产生扭曲和撕裂；而带有复合结构的材料，则能将应力引导至强度相对较高的第二区域，并分散于整个第二区域形成的网络。对于具有条状第二区域的修补材料，则可以用于具有特定拉力方向的使用环境，例如肌腱修补，优选肩袖修补。而具有网状第二区域的修补材料可以适用于周边都需要缝合情况。
动物实验体内测试
图6所示为根据本发明实施方式样品作力学性能测试所取的动物组织(新西兰大白兔冈上肌腱)，图7和图8为测试结果。
72只新西兰大白兔(体重2.5-3.5kg)随机分成2组，A组36只动物于右前臂造大型肩袖肌腱撕裂模型(5mm×4mm×1mm，冈上肌腱缺损，)，采用缝合线将受损肌腱重新固定于骨组织，作为空白对照组；B组36只动物按A组方法于右前臂造大型肩袖肌腱撕裂模型(5mm×4mm×1mm，冈上肌腱缺损)，但采用本实施例样品进行加固修复将受损肌腱重新固定于骨组织。观察周期为2周、4周、6周，处死动物取组织作病理观察，并进行力学性能测试。与A组相比植入材料未引起明显炎症、感染、免疫排斥等不良反应，并能发现新生胶原纤维生成。力学性能测试表明增加的修复材料增加了受损肌腱的力学强度，其抗拉强度在6周时提高66％以上。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

Claims (28)

1.一种生物肌腱修复材料，包括经免疫原去除处理的细胞外基质本体，所述的细胞外基质本体为多层细胞外基质材料，其中所述多层细胞外基质材料经放置于模具上进行干燥，并且至少部分区域进行复水处理；所述细胞外基质本体包括第一表面和第二表面，所述的第一表面包括第一区域和第二区域，所述第一区域的力学强度低于所述第二区域的力学强度。
2.根据权利要求1所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述的第一区域为经过复水处理的区域。
3.根据权利要求1或2所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第一区域具有疏松结构，所述第二区域具有致密结构。
4.根据权利要求1或2所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第二表面具有致密结构。
5.根据权利要求1或2所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第一区域的断裂强度低于所述第二区域的断裂强度。
6.根据权利要求1或2所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第一区域的缝合保持力低于所述第二区域的缝合保持力。
7.根据权利要求1或2所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第一区域为一个或多个条状区域或者所述第一区域为一个或多个环形或圆形区域。
8.根据权利要求1或2所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第一区域为一个或多个矩形区域。
9.根据权利要求1或2所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第一区域为一个或多个多边形区域。
10.根据权利要求7所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第一区域的条状或环形区域的宽度为修复材料最大宽度的1/10~1/2。
11.根据权利要求7所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第一区域的条状或环形区域的宽度为修复材料最大宽度的1/8~1/4。
12.根据权利要求1或2所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第一区域为多个时，多个第一区域通过第二区域实现间隔设置。
13.根据权利要求12所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第一区域为多个时，所述的多个第一区域均贯穿整个修复材料长度方向或者多个第一区域均贯穿整个修复材料宽度方向。
14.根据权利要求1所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第二区域包围所述第一区域。
15.根据权利要求1所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述第一表面为连续表面。
16.根据权利要求1所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述的细胞外基质来自同种异体或异种生物的组织材料。
17.根据权利要求1所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述的细胞外基质来自真皮基质、腹膜、粘膜下层或器官包膜。
18.根据权利要求17所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述的粘膜下层包括膀胱粘膜下层、子宫粘膜下层或小肠粘膜下层。
19.根据权利要求17所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述的粘膜下层包括猪或牛的小肠粘膜下层。
20.根据权利要求17所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述的器官包膜包括心包膜。
21.根据权利要求17所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述的器官包膜包括牛心包膜。
22.根据权利要求1所述的生物肌腱修复材料，其特征在于：所述的第一表面接触缺损组织。
23.一种用于制备如权利要求1至22中任意一项的生物肌腱修复材料的制备方法，其特征在于：制备步骤包括：1）对生物组织材料进行初步处理；2）对初步处理后的生物组织进行免疫原去除处理，得到细胞外基质材料；3）将多层细胞外基质材料放置于模具上，并进行干燥；4）对所述模具上细胞外基质材料的至少部分区域复水；5）进行冷冻干燥。
24.根据权利要求23所述的生物肌腱修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中的复水操作包括通过转移的方式向所述至少部分区域施加水。
25.根据权利要求23所述的生物肌腱修复材料的制备方法，其特征在于：所述步骤4）中的复水操作包括通过喷洒的方式向所述至少部分区域施加水。
26.根据权利要求23-25中任一项所述的生物肌腱修复材料的制备方法，其特征在于：所述复水操作所用水的面密度为0.005~0.5g/cm2。
27.根据权利要求23-25中任一项所述的生物肌腱修复材料的制备方法，其特征在于：所述复水操作所用水的面密度为0.01~0.2g/cm2。
28.根据权利要求23-25中任一项所述的生物肌腱修复材料的制备方法，其特征在于：所述复水操作所用水的面密度为0.02~0.1g/cm2。
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