CN104645415A - 一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，该方法取新鲜动物眼球进行消毒；消毒后用蘸有酒精的滤纸处理，然后擦除去净上皮细胞层；在手术显微镜下做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜；用角膜环钻取出板层角膜；将新鲜板层角膜经血清浸泡之后进行漂洗或冰浴电泳处理；处理完毕后进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥，得到干燥脱细胞板层角膜；将干燥后的样品进行钴60消毒，复水处理，得到复水板层角膜基质片。本发明得到的角膜基质片透明度高、结构破坏少、生物相容性好、性能与新鲜角膜接近、脱细胞彻底。
Description
技术领域
本发明属于生物医学的组织工程技术领域，具体涉及一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法。
背景技术
角膜病是常见的致盲性眼病之一,临床上各种因素所致的角膜炎症和角膜损伤均可致角膜缺损、糜烂和溃疡，若得不到有效治疗,则将严重损伤患者的视功能和生活质量。据世界卫生组织报告，目前角膜病是引起视力丧失的第二位主要病因，仅次于白内障，每年因角膜溃疡、眼外伤等造成的新增角膜盲为150万至200万，严重威胁着患者的健康。治疗角膜盲的唯一有效方法是角膜移植术。但是由于宗教信仰、风俗习惯的影响，身故后捐献角膜者甚少；加上人类免疫缺陷病毒(HIV)、乙肝病毒、狂犬病毒、克雅氏病毒可以通过植片传播、角膜屈光手术、人口老龄化等原因使角膜供体材料严重不足，极大地限制了角膜盲患者脱盲。我国角膜移植的对象大部分为严重感染、化学伤等高危角膜移植患者,术后的免疫排斥反应发生率高达60％-90％，由于角膜材料来源不足、免疫排斥反应、角膜移植并发症等因素严重限制了角膜移植技术的开展。随着角膜外伤、肿瘤、化学烧伤(碱烧伤)、血管化严重干眼症、角膜缘干细胞缺乏、免疫性疾病、角膜移植排斥反应等患者人数的增多，角膜材料的来源也就成为了目前眼科医生存在的一个棘手的问题。如何高质量长时间维持板层角膜替代物在眼内的功能，寻找一种能达到理想状态的角膜替代物也就成了当前眼科界研究的一个热点。然而，目前国内外研制的各种种子细胞支架材料在角膜曲率及地形图，生物相容性、强度、降解率、透明性、同源性、抗原性及病原性等性能方面均存在着缺陷。而被认为最有研究前景的为经过脱细胞处理的异种角膜基质片，但是目前常用脱细胞方法步骤烦琐，过程复杂，易损伤组织结构，严重影响了角膜的透明度而使效果欠佳。
发明内容
本发明的目的是要提供一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，与现有技术相比制作过程简单、时间较短，无需使用外源性酶，使得经过本方法研制的角膜基质片透明度高、结构破坏少、生物相容性好、性能与新鲜角膜接近，是一种脱细胞彻底的生物支架材料，可用于角膜移植各种供体材料的替代物，取材方便，安全性强，能被广大患者接受并长期应用于临床。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一，取新鲜动物眼球进行消毒；
步骤二，消毒后用蘸有酒精的滤纸处理，然后擦除去净上皮细胞层；
步骤三，在手术显微镜下做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜；
步骤四，用角膜环钻取出板层角膜；
步骤五，将新鲜板层角膜经过血清浸泡，然后将浸泡后的板层角膜基质片进行漂洗或冰浴电泳处理；
步骤六，将漂洗或电泳处理完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；
步骤七，将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥，得到干燥脱细胞板层角膜；
步骤八，将干燥后的样品进行钴60消毒，进行复水处理，得到复水板层角膜基质片，即得所述的板层组织工程角膜基质支架，保存备用。
进一步，在步骤一中，将新鲜动物眼球采用碘伏浸泡或含抗菌素的PBS浸泡的方式进行消毒，浸泡后采用PBS冲洗三次，每次冲洗5min。
进一步，在步骤三中，在手术显微镜下用宝石刀做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜，角膜缘切口深约1/3，厚为0.2-0.8mm，长为3mm，分离的板层厚度为0.2-0.8mm。
进一步，在步骤五中，浸泡所用血清为人新鲜血清或人灭活血清，将板层角膜基质片放于装有人新鲜血清或人灭活血清的密闭无菌培养皿或EP管内浸泡，浸泡时间为12-30小时。
进一步，将板层角膜基质片放于装有人新鲜血清或人灭活血清的密闭无菌培养皿或EP管内浸泡的时间为16-24小时。
进一步，在步骤五中，进行漂洗采用的漂洗液为等渗液，漂洗液选自PBS，林格氏液或生理盐水，漂洗时间为0.5-5小时。
进一步，在步骤五中，进行漂洗的时间为1-2小时。
进一步，在步骤五中，冰浴电泳所用电泳液为TA电泳液，将整个电泳槽放于密闭消毒盒内进行冰浴电泳，3-5℃恒温冰箱内进行冰浴电泳，电泳的时间为1.5-2hs,电泳的电压为为120-150V；其中1×TA溶液配置方法:将4.84g TrisBase溶于100ml双蒸水中，滴加1.142ml冰醋酸，然后加双蒸水至1L。
本发明通过单纯使用物理及生物学方法来进行组织脱细胞，不使用任何有毒化学试剂，同时完全保留了天然角膜基质的胶原结构。利用动物源性的角膜在人血清中引起的体外急性排斥反应脱细胞方法去除基质细胞的核酸及蛋白成分；利用漂洗或电泳的方法将细胞残留碎屑和带电成分去除干净，达到彻底去除了支架材料的抗原成分的目的，通过完全电泳出残留的核酸成分和Co60消毒的方法去除了支架材料的病原性。为了能达到开发产品的要求，在脱细胞处理的各个环节如时间、温度、电压、如何保证无菌及电解液、漂洗液的配置等方面均经过详细周密的设计和反复严格的摸索；通过一系列制作过程的反复改良和优化，使本发明具有以下优点：
(1)采用本发明的技术方案，制作流程简单可靠，时间短且易于实施；
(2)板层组织工程角膜支架来源广泛，成本低，使用方便；
(3)采用本发明技术方案制作的板层组织工程角膜支架，经过血清浸泡不含有对人体有潜在危害的毒性物质，如去污剂等，具有可加工性，便于根据需要加工成不同屈光度；
(4)采用本发明的技术方案，脱细胞彻底，采用电泳方法能最小的减少角膜基质骨架细胞外基质的破坏，不留有任何核酸物质及可溶性蛋白成分，表面由Ⅳ型胶原构成的前弹力层以及基底膜得以保留，有利于自体细胞增殖爬行；
(5)采用本发明技术方案制作的板层组织工程角膜支架，具有良好的生物相容性和极低的免疫原性，移植后不引起免疫排斥反应；生物学性质检测(透明度、含水量、膨胀率、最大拉伸长度)，显微结构观察及视光学检测，结果发现此种材料与人角膜基质极其相近；
(6)本发明方法不仅有利于优化动物角膜基质脱细胞条件，同时将为组织工程角膜产业化提供重要的技术支持。
附图说明
图1是本发明提供的脱细胞板层角膜基质片的制备方法的实现流程图；
图2是经过本发明方法制作的未干燥脱细胞猪板层角膜基质片的DAPI染色结果；
图3是经过浸泡于A型血清的板层角膜基质片各时间点残留细胞核数的比较结果；
图4是经过本发明方法制作的未干燥脱细胞猪板层角膜基质片的DNA Gel结果；
图5是经过本发明方法制作的未干燥猪板层角膜基质片在兔角膜中央囊袋内平铺术后2月后的裂隙灯照片；
图6是经过本发明方法制作的未干燥猪板层角膜基质片用于兔眼角膜移植术后40天的裂隙灯照片。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定发明。
图1示出了本发明实施例提供的脱细胞板层角膜基质片的制备方法的实现流程。该方法包括以下步骤：
在步骤S101中，取新鲜动物眼球进行消毒；
在步骤S102中，消毒后用蘸有酒精的滤纸处理，然后擦除去净上皮细胞层；
在步骤S103中，在手术显微镜下做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜；
在步骤S104中，用角膜环钻取出板层角膜；
在步骤S105中，将新鲜板层角膜经过血清浸泡，然后将浸泡后的板层角膜基质片进行漂洗或冰浴电泳处理；
在步骤S106中，将漂洗或电泳处理完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；
在步骤S107中，将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥，得到干燥脱细胞板层角膜；
在步骤S108中，将干燥后的样品进行钴60消毒，进行复水处理，得到复水板层角膜基质片，即板层组织工程角膜基质支架，保存备用。
在本发明实施例中，在步骤S101中，将新鲜动物眼球采用碘伏浸泡或含抗菌素的PBS浸泡的方式进行消毒，浸泡后采用PBS冲洗三次，每次冲洗5min。
在本发明实施例中，在步骤S103中，在手术显微镜下用宝石刀做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜，角膜缘切口深约1/3，厚为0.2-0.8mm，长为3mm，分离的板层厚度为0.2-0.8mm。
在本发明实施例中，在步骤S105中，浸泡所用血清为人新鲜血清或人灭活血清，将板层角膜基质片放于装有人新鲜血清或人灭活血清的密闭无菌培养皿或EP管内浸泡，浸泡时间为12-30小时。
在本发明实施例中，将板层角膜基质片放于装有人新鲜血清或人灭活血清的密闭无菌培养皿或EP管内浸泡的时间为16-24小时。
在本发明实施例中，在步骤S105中，进行漂洗采用的漂洗液为等渗液，漂洗液选自PBS，林格氏液或生理盐水，漂洗时间为0.5-5小时。
在本发明实施例中，在步骤S105中进行漂洗的时间为1-2小时。
在本发明实施例中，在步骤S105中冰浴电泳所用电泳液为TA电泳液，将整个电泳槽放于密闭消毒盒内进行冰浴电泳，3-5℃恒温冰箱内进行冰浴电泳，电泳的时间为1.5-2hs,电泳的电压为为120-150V；其中1×TA溶液配置方法:将4.84g TrisBase溶于100ml双蒸水中，滴加1.142ml冰醋酸，然后加双蒸水至1L。
实施例一
将新鲜动物眼球采用浓度为0.5-2％的碘伏浸泡的方式进行消毒，浸泡时间为2-5min，浸泡后采用PBS冲洗三次，每次冲洗5min；消毒后用蘸有浓度15-30％酒精的滤纸覆盖于角膜表面或直接浸泡1-5min，然后用棉签/角膜上皮刀轻轻的擦除上皮细胞层；在手术显微镜下用宝石刀做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜，角膜缘切口深约1/3，厚为0.2-0.8mm，长为3mm，分离的板层厚度为0.2-0.8mm，或直接用板层角膜分离刀分离深约1/3(厚约0.2-0.8mm)的前板层角膜；然后将分离下前板层角膜放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，用角膜环钻取出3-10mm直径的板层角膜；将新鲜板层角膜经过血清浸泡，浸泡所用血清为人新鲜血清，将板层角膜基质片放于装有人新鲜血清的密闭无菌的5mlEP管或培养皿内浸泡，浸泡时间为12-30小时，浸泡时间优选为16-24小时，血清可以为A、B、O、AB的任意一种；然后将浸泡后的板层角膜基质片进行漂洗处理，进行漂洗采用的漂洗液为等渗液，漂洗液选自PBS，林格氏液或生理盐水，将浸泡后的板层角膜基质片放置于水平或垂直摇床上漂洗，漂洗时间为0.5-5小时，漂洗的时间优选为1-2小时；漂洗处理完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥，所用的干燥技术处理为真空冻干，真空晾干，干燥无水Cacl2真空干燥，自然晾干，吹干，30-60℃温箱内烘干等其中的一种或一种以上的组合，时间为6-24hs，得到干燥脱细胞板层角膜；将干燥后的样品进行钴60消毒，进行复水处理，所用的复水剂包括林格氏液，平衡液，1×PBS溶液，DMEM培养液，短、中期角膜保存液的一种或一种以上的组合，得到复水板层角膜基质片，即板层组织工程角膜基质支架，保存备用。
实施例二
将新鲜动物眼球采用含抗菌素的PBS浸泡的方式进行消毒，浸泡时间为5-10min，该抗菌素选自5万U/L青霉素、8万U/L妥布霉素、100mg/L链霉素中的一种或两种以上的组合，浸泡后采用PBS冲洗三次，每次冲洗5min；消毒后用蘸有浓度15-30％酒精的滤纸覆盖于角膜表面或直接浸泡1-5min，然后用棉签/角膜上皮刀轻轻的擦除上皮细胞层；在手术显微镜下用宝石刀做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜，角膜缘切口深约1/3，厚为0.2-0.8mm，长为3mm，分离的板层厚度为0.2-0.8mm，或直接用板层角膜分离刀分离深约1/3(厚约0.2-0.8mm)的前板层角膜；然后将分离下前板层角膜放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，用角膜环钻取出3-10mm直径的板层角膜；将新鲜板层角膜经过血清浸泡，浸泡所用血清为人新鲜血清，将板层角膜基质片放于装有人新鲜血清的密闭无菌的5mlEP管或培养皿内浸泡，浸泡时间为12-30小时，浸泡时间优选为16-24小时，血清可以为A、B、O、AB的任意一种；然后将浸泡后的板层角膜基质片进行漂洗处理，进行漂洗采用的漂洗液为等渗液，漂洗液选自PBS，林格氏液或生理盐水，将浸泡后的板层角膜基质片放置于水平或垂直摇床上漂洗，漂洗时间为0.5-5小时，漂洗的时间优选为1-2小时；漂洗处理完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥，所用的干燥技术处理为真空冻干，真空晾干，干燥无水Cacl2真空干燥，自然晾干，吹干，30-60℃温箱内烘干等其中的一种或一种以上的组合，时间为6-24hs，得到干燥脱细胞板层角膜；将干燥后的样品进行钴60消毒，进行复水处理，所用的复水剂包括林格氏液，平衡液，1×PBS溶液，DMEM培养液，短、中期角膜保存液的一种或一种以上的组合，得到复水板层角膜基质片，即板层组织工程角膜基质支架，保存备用。
实施例三
将新鲜动物眼球采用浓度为0.5-2％的碘伏浸泡的方式进行消毒，浸泡时间为2-5min，浸泡后采用PBS冲洗三次，每次冲洗5min；消毒后用蘸有浓度15-30％酒精的滤纸覆盖于角膜表面或直接浸泡1-5min，然后用棉签/角膜上皮刀轻轻的擦除上皮细胞层；在手术显微镜下用宝石刀做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜，角膜缘切口深约1/3，厚为0.2-0.8mm，长为3mm，分离的板层厚度为0.2-0.8mm，或直接用板层角膜分离刀分离深约1/3(厚约0.2-0.8mm)的前板层角膜；然后将分离下前板层角膜放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，用角膜环钻取出3-10mm直径的板层角膜；将新鲜板层角膜经过血清浸泡，浸泡所用血清为人新鲜血清，将板层角膜基质片放于装有人新鲜血清的密闭无菌的5mlEP管或培养皿内浸泡，浸泡时间为12-30小时，浸泡时间优选为16-24小时，血清可以为A、B、O、AB的任意一种；然后将浸泡后的板层角膜基质片进行冰浴电泳处理，冰浴电泳所用电泳液为TA电泳液，将整个电泳槽放于密闭消毒盒内进行冰浴电泳，3-5℃恒温冰箱内进行冰浴电泳，电泳可为单相水平或双相电泳的一种，电泳的时间为1.5-2hs,电泳的电压为为120-150V；其中1×TA溶液配置方法:将4.84g TrisBase溶于100ml双蒸水中，滴加1.142ml冰醋酸，然后加双蒸水至1L；电泳处理完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥，所用的干燥技术处理为真空冻干，真空晾干，干燥无水Cacl2真空干燥，自然晾干，吹干，30-60℃温箱内烘干等其中的一种或一种以上的组合，时间为6-24hs，得到干燥脱细胞板层角膜；将干燥后的样品进行钴60消毒，进行复水处理，所用的复水剂包括林格氏液，平衡液，1×PBS溶液，DMEM培养液，短、中期角膜保存液的一种或一种以上的组合，得到复水板层角膜基质片，即板层组织工程角膜基质支架，保存备用。
实施例四
将新鲜动物眼球采用含抗菌素的PBS浸泡的方式进行消毒，浸泡时间为5-10min，该抗菌素选自5万U/L青霉素、8万U/L妥布霉素、100mg/L链霉素中的一种或两种以上的组合，浸泡后采用PBS冲洗三次，每次冲洗5min；消毒后用蘸有浓度15-30％酒精的滤纸覆盖于角膜表面或直接浸泡1-5min，然后用棉签/角膜上皮刀轻轻的擦除上皮细胞层；在手术显微镜下用宝石刀做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜，角膜缘切口深约1/3，厚为0.2-0.8mm，长为3mm，分离的板层厚度为0.2-0.8mm，或直接用板层角膜分离刀分离深约1/3(厚约0.2-0.8mm)的前板层角膜；然后将分离下前板层角膜放于角膜枕上(前弹力层面朝下)，用角膜环钻取出3-10mm直径的板层角膜；将新鲜板层角膜经过血清浸泡，浸泡所用血清为人灭活血清，将板层角膜基质片放于装有人灭活血清的密闭无菌的5mlEP管或培养皿内浸泡，浸泡时间为12-30小时，浸泡时间优选为16-24小时，血清可以为A、B、O、AB的任意一种；然后将浸泡后的板层角膜基质片进行冰浴电泳处理，冰浴电泳所用电泳液为TA电泳液，将整个电泳槽放于密闭消毒盒内进行冰浴电泳，3-5℃恒温冰箱内进行冰浴电泳，电泳可为单相水平或双相电泳的一种，电泳的时间为1.5-2hs,电泳的电压为为120-150V；其中1×TA溶液配置方法:将4.84g TrisBase溶于100ml双蒸水中，滴加1.142ml冰醋酸，然后加双蒸水至1L；电泳处理完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥，所用的干燥技术处理为真空冻干，真空晾干，干燥无水Cacl2真空干燥，自然晾干，吹干，30-60℃温箱内烘干等其中的一种或一种以上的组合，时间为6-24hs，得到干燥脱细胞板层角膜；将干燥后的样品进行钴60消毒，进行复水处理，所用的复水剂包括林格氏液，平衡液，1×PBS溶液，DMEM培养液，短、中期角膜保存液的一种或一种以上的组合，得到复水板层角膜基质片，即板层组织工程角膜基质支架，保存备用。
本发明通过单纯使用物理及生物学方法来进行组织脱细胞，不使用任何有毒化学试剂，同时完全保留了天然角膜基质的胶原结构。利用动物源性的角膜在人血清中引起的体外急性排斥反应脱细胞方法去除基质细胞的核酸及蛋白成分；利用漂洗或单相/双相电泳的方法将细胞残留碎屑和带电成分去除干净，达到彻底去除了支架材料的抗原成分的目的，通过完全电泳出残留的核酸成分和Co60消毒的方法去除了支架材料的病原性。
为了能达到开发产品的要求，在脱细胞处理的各个环节(如时间、温度、电压、如何保证无菌及电解液、漂洗液的配置等方面)均经过详细周密的设计和反复严格的摸索；通过一系列制作过程的反复改良和优化，使本发明具有以下优点：
(1)采用本发明的技术方案，制作流程简单可靠，时间短且易于实施；
(2)板层组织工程角膜支架来源广泛，成本低，使用方便；
(3)经DAPI染色(图2)、DNA Gel结果(图4)以及经过A型血清浸泡和PBS清洗对比结果(图3)显示，本发明方法制作的猪板层角膜基质片，脱细胞彻底，残留细胞核随血清浸泡时间的增长而逐渐减少，浸泡24小时后无残留细胞数，最小的减少了对角膜基质ECM的破坏，不留有任何核酸成分及可溶性蛋白，表面由Ⅳ型胶原构成的前弹力层以及基底膜得以保留，有利于自体细胞增殖爬行；
(4)采用本发明技术方案制作的板层组织工程角膜支架，不含有对人体有潜在危害的毒性物质，如去污剂等，具有可加工性，便于根据需要加工成不同屈光度；
(5)采用本发明技术方案制作的板层组织工程角膜支架，具有良好的生物相容性和极低的免疫原性，移植后不引起免疫排斥反应；通过生物学性质检测(透明度、含水量、膨胀率、最大拉伸长度)(参见表1)，结果发现此种材料与人角膜基质极其相近，胶原排列规则，间隙均匀；
(6)本发明方法不仅有利于优化动物角膜基质脱细胞条件，同时将为组织工程角膜产业化提供重要的技术支持；采用本发明技术方案制作的未干燥猪板层组织工程角膜支架，用于兔角膜中央内平铺术后2月(参见图5)，发现角膜透明，不影响其透明度，未见明显的炎症反应和排斥反应；
(7)采用本发明技术方案制作的未干燥猪板层组织工程角膜支架，用于兔角膜移植术后40天(图6)，发现角膜逐渐透明，上皮生长完好，未见明显的炎症反应和排斥反应；
(8)本发明不仅有利于优化动物角膜基质脱细胞条件，为临床上使用自家血清去除动物源性角膜基质细胞用于角膜移植治疗及组织工程角膜产业化提供重要的技术支持。
表1是经过本发明方法制作的各种脱细胞猪板层角膜基质片与正常猪板层角膜的生物学特性比较结果；
表1
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一，取新鲜动物眼球进行消毒；
步骤二，消毒后用蘸有酒精的滤纸处理，然后擦除去净上皮细胞层；
步骤三，在手术显微镜下做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜；
步骤四，用角膜环钻取出板层角膜；
步骤五，将新鲜板层角膜经过血清浸泡，然后将浸泡后的板层角膜基质片进行漂洗或冰浴电泳处理；
步骤六，将漂洗或电泳处理完毕的板层角膜基质片进行梯度脱水，即得到未干燥板层组织工程角膜支架，采用环氧乙烷灭菌处理，保存备用；
步骤七，将未干燥角膜基质片放于24孔板内进行干燥，得到干燥脱细胞板层角膜；
步骤八，将干燥后的样品进行钴60消毒，进行复水处理，得到复水板层角膜基质片，即得所述的板层组织工程角膜基质支架，保存备用。
2.根据权利要求1所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：在步骤一中，将新鲜动物眼球采用碘伏浸泡或含抗菌素的PBS浸泡的方式进行消毒，浸泡后采用PBS冲洗三次，每次冲洗5min。
3.根据权利要求1所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：在步骤三中，在手术显微镜下用宝石刀做角膜缘切口，伸入虹膜恢复器分离前层角膜，分离完全后用角膜剪剪下前层角膜，角膜缘切口深约1/3，厚为0.2-0.8mm，长为3mm，分离的板层厚度为0.2-0.8mm。
4.根据权利要求1所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：在步骤五中，浸泡所用血清为人新鲜血清或人灭活血清，将板层角膜基质片放于装有人新鲜血清或人灭活血清的密闭无菌培养皿或EP管内浸泡，浸泡时间为12-30小时。
5.根据权利要求4所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：将板层角膜基质片放于装有人新鲜血清或人灭活血清的密闭无菌培养皿或EP管内浸泡的时间为16-24小时。
6.根据权利要求1所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：在步骤五中，进行漂洗采用的漂洗液为等渗液，漂洗液选自PBS，林格氏液或生理盐水，漂洗时间为0.5-5小时。
7.根据权利要求6所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：在步骤五中，进行漂洗的时间为1-2小时。
8.根据权利要求1所述的一种脱细胞板层角膜基质片的制备方法，其特征在于：在步骤五中，冰浴电泳所用电泳液为TA电泳液，将整个电泳槽放于密闭消毒盒内进行冰浴电泳，3-5℃恒温冰箱内进行冰浴电泳，电泳的时间为1.5-2hs,电泳的电压为为120-150V；其中1×TA溶液配置方法:将4.84g TrisBase溶于100ml双蒸水中，滴加1.142ml冰醋酸，然后加双蒸水至1L。
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