CN104971381A - 一种异种角膜移植物的无菌加工制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种异种角膜移植物的无菌加工制备方法，采用眼球整体处理，包括两步病毒灭活——紫外线照射和次氯酸钠溶液浸泡、去上皮层、两步脱细胞——血清浸泡和渗透压法、削切脱水和甘油溶液保存步骤。本发明的制备方法不需要干燥和终端灭菌步骤，工艺简单，生产周期短，生产成本低；柔和脱细胞处理，最大程度地保持了天然角膜基质的结构和组成，透明度、力学强度与天然角膜基质无显著性差异，降解与新生角膜组织再生速度相匹配；抗原去除和病毒灭活彻底，生物相容性和生物安全性高；甘油保存，结构和性能能够长期保持稳定；临床使用方便，可替代异体角膜进行角膜移植。

Description

一种异种角膜移植物的无菌加工制备方法

技术领域

本发明属于组织工程生物医用材料技术领域，具体涉及一种异种角膜移植物的无菌加工制备方法。该异种角膜移植物可替代异体角膜进行角膜移植。

背景技术

角膜(Cornea)是眼睛最前面的透明部分，覆盖虹膜、瞳孔及前房，并为眼睛提供大部分屈光力。加上晶体的屈光力，光线便可准确地聚焦在视网膜上构成影像。据WHO报告，因外伤、化学烧伤、肿瘤、严重干眼症、感染等原因引起的角膜病已成为第二大致盲性眼病，全球每年新增150万~200万角膜盲患者。目前，唯一有效的治疗方法是异体角膜移植。然而供体来源极度缺乏，全球每年只有12万例患者能够接受异体角膜移植治疗，我国每年人捐献角膜每年仅3000例。由于捐献角膜的严重缺乏，又没有替代产品，致使角膜病人的医治问题长期无法解决。

为了解决角膜供体不足的问题，人们尝试采用人工合成的方法来构建人工角膜，但是目前人工构建的角膜还无法达到天然角膜精密复杂的超微结构，不能实现与宿主植床的完美融合，或难以实现上皮化，移植后的外观和宿主的舒适度与自然角膜差异大。

在利用生物材料进行人工角膜构建研究的同时，随着脱细胞技术的发展以及脱细胞组织在临床上的广泛应用，人们逐渐聚焦于异种角膜移植物的研发。人们所采用的脱细胞方法主要有酶消化法（胰酶、DNA酶和RNA酶等）、反复冻融法、表面活性剂法（TritonX-100、SDS等）和螯合剂法（EDTA）等，但是这些方法都会在一定程度上破坏角膜基质中胶原纤维结构和损失糖胺聚糖成分，使角膜组织特性丧失，透明度、力学强度和屈光性能降低，植入体内后还没愈合就提前降解掉。并且脱细胞试剂都具有一定的毒性，难以洗脱并伴有毒性风险。

异种角膜移植还需要面对的问题是病毒传染的风险。目前的异种角膜制备方法中人们往往忽略了这一问题。有专利（申请公开号CN201310527550.4）提出采用γ射线辐照进行病毒灭活，辐照剂量高达25KGy。单一的物理病毒灭活方法不符合我国动物源植入性医疗器械相关法规要求，并且如此高的辐照剂量必然会引起角膜基质中胶原纤维结构的破坏和胶原、糖胺聚糖等生物大分子的变性，对角膜基质的透明度、力学强度和降解性能的影响依旧不可避免。

综上所述，目前还没有一种理想的异种角膜制备方法：既可以达到脱细胞去抗原和病毒灭活目的，又可以最大程度地保留天然角膜的组织结构和组成特性。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种异种角膜移植物的无菌加工制备方法。通过本发明无菌加工技术，保留了天然角膜的组织结构和组成特性，透明度好、力学强度高，降解与角膜再生速度相匹配，病毒灭活彻底，生物相容性和生物安全性高，结构和性能长期保持稳定，可替代异体角膜进行角膜移植。

优选地，异种角膜可采用猪、马、驴、猴、猫和鸵鸟等非传染性海绵状脑病(TSE)易感动物中的一种。

本发明提出的异种角膜移植物的无菌加工制备方法，采用眼球整体处理，包括两步病毒灭活——紫外线照射和次氯酸钠溶液浸泡、去上皮层、两步脱细胞——血清浸泡和渗透压法、削切脱水和甘油溶液保存步骤。具体如下：

步骤一、紫外线病毒照射

将无菌的动物眼球眼表部分朝上，置于短波紫外线（200-280nm）下照射。紫外线波长优选254nm，照射时间为1-8h，照射强度为0.03-0.5J/cm²，优选0.1-0.3J/cm²。

紫外线照射是血液制品中常用的病毒灭活方法，能够灭活各种有包膜病毒和无包膜病毒，主要是利用紫外线的能量破坏病毒中DNA或RNA分子链，从而使病毒失去复制能力，从而达到病毒灭活目的。紫外线辐照对蛋白分子影响非常小，并且也能起到杀菌和交联效果。眼球整体进行照射，能最大程度保持角膜中生物大分子的结构完整性，提高稳定性。

步骤二、次氯酸钠溶液浸泡

将紫外线照射后的眼球再次用浓度为0.1-1g/l的次氯酸钠溶液进行浸泡病毒灭活，浸泡时间为10-60min，溶液用量为眼球重量的5-20倍（v/m）。然后用10-100倍量清洗液（v/m）进行振荡清洗3-10遍，每遍10-60min，去除残留次氯酸钠。

优选地，所述清洗液可采用纯化水、注射用水、生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4左右）中的一种。

根据我国动物源植入性医疗器械相关法规要求，为了将病毒风险降到最低，进行病毒灭活时必须采用至少两种不同性质的方法，即至少一种物理方法和一种化学方法。因此，本发明在紫外线病毒灭活后，再采用化学试剂进行进一步病毒灭活，可以将病毒风险降到最低。

步骤三、去上皮层

经过振荡清洗后的眼球表面已经充分溶胀，然后用灭菌滤纸轻轻搓去上皮层，暴露出前弹力层。

步骤四、脱细胞

经过步骤二化学病毒灭活和振荡溶胀处理后，角膜中的大部分细胞结构都得到破坏，但细胞碎片还残存在细胞外基质中，为此可通过血清浸泡和渗透压清洗将细胞碎片洗脱出来，达到彻底脱细胞效果。

将去上皮的眼球先浸泡于5-20倍量（v/m）经过常规纳滤膜病毒灭活处理的动物自体血清或人血清中，于20-38℃条件下浸泡2-24h。

然后将眼球移入5-50倍量（v/m）浓度为1-5M、温度为2-25℃的高渗盐溶液中，50-250rpm下振荡处理1-24h。完成一次高渗盐振荡处理后，再采用相同的条件进行低渗振荡清洗。如此重复高渗-低渗振荡清洗处理5-20遍。本步骤中所述溶液均需经过0.22μm滤膜过滤，最大程度降低处理过程中的微生物污染风险。

所述高渗盐溶液可采用氯化钠、氯化钾或混合物溶液中的一种。

所述低渗溶液可采用纯化水、注射用水、生理盐水或磷酸盐缓冲液等中的一种。

动物血清中还有可以消解细胞和细胞碎片的酶，通过浸泡处理可以将之前步骤未能破碎的细胞进一步破碎，并破坏细胞碎片与角膜基质间的物理结合力，使得细胞碎片被消解或更容易洗脱出来。所采用的高渗-低渗循环振荡处理，可以使角膜基质中的细胞碎片在处理过程中得到进一步的破碎、释放和溶出。采用高渗-低渗处理可以最大程度地保护角膜基质的纤维结构，避免糖胺聚糖等重要功能蛋白的损失。

步骤五、削切脱水

在百级洁净环境下，严格按照无菌操作要求，用灭菌后眼科剪从经过步骤四处理后的眼球上分离下来，获得还处于溶胀状态的全层角膜基质，然后用角膜削切器削去后弹力层和部分基质层，再用环钻进行圆形修整，面积为60-100mm²。

削切修整后的角膜基质，采用甘油溶液进行振荡脱水处理，甘油溶液的浓度为60-100%（v/v），优选75-100%，再优选85-95%；用量为角膜基质重量的100-500倍量（v/m）；脱水时间为30-120min，优选45-60min。经过脱水后的角膜基质厚度为100-500μm。

步骤六、甘油溶液保存

在百级洁净环境下，严格按照无菌操作要求，将角膜基质转移至装有浓度90-100%（v/v）的无菌甘油保存液的西林瓶中，轧盖密封，获得异种角膜移植物。

所述甘油保存液灭菌方法可采用蒸汽灭菌或滤膜过滤除菌中的一种。

甘油具有良好的抑菌功能和脱水作用，角膜基质保存其中，不但能够长期保持无菌状态，而且能够保持结构和性能的长期稳定，使得产品具有足够长的货架寿命。

经过严格的无菌生产控制，可以免去终端灭菌工艺，避免了终端灭菌处理对角膜基质结构造成的不可逆的破坏，最大程度的保持了结构和性能的完整性；采用灭菌处理后的甘油保存液进行保存，避免了晾干、冷冻干燥等干燥工艺对角膜基质结构和透明度的影响，缩短了生产时间，降低了生产成本，而且甘油可以抑制细菌的生长，还有助于角膜基质保持结构和性能的稳定性，有利于角膜基质在常温条件下长时间的保存和运输。

与现有其他技术相比，本发明具有以下优点：

1、本发明提供了一种异种角膜移植的无菌加工生产方法，可以免去终端灭菌工艺，最大程度地保持了角膜基质的天然结构和性能，具有良好的透明度（见图1）和力学强度（见图2）；

2、本发明提供了两种性质病毒灭活方式相结合进行病毒灭活的方法——紫外线照射和极低浓度的次氯酸钠浸泡相结合，不但可以将病毒风险降到最低，而且与传统的γ射线辐照、强酸强碱和表面活性剂浸泡相比，对角膜基质的结构影响最小；

3、本发明提供了在病毒灭活基础上进行整个眼球柔和脱细胞的方法，采用血清浸泡和高渗-低渗循环处理可以有效脱除细胞及残留碎片（见图3），不会引入酸碱、表面活性剂、交联剂、EDTA等有毒试剂残留风险，具有更高的安全性和良好的生物相容性（见图4）；

4、本发明提供了一种异种角膜移植物简便可行的长期保存方法，不需要进行晾干、冷冻干燥等干燥处理，不仅避免干燥工艺对角膜基质结构和透明度的影响，而且缩短了生产时间和降低了生产成本，适合产业化，还能够保持角膜基质结构与性能的长期稳定性，使得产品具有足够长的货架寿命。

附图说明

附图1为本发明异种角膜移植物和新鲜角膜的透光率检测结果，表明本发明异种角膜移植物的与新鲜角膜的透明度无显著性差异。

附图2为本发明异种角膜移植物和新鲜角膜的力学性能检测结果，拉伸强度、风险撕裂力和破裂强度二者均无显著性差异。

附图3为本发明异种角膜移植物组织学切片HE染色照片，表明本发明异种角膜移植物脱细胞彻底，无明显细胞残余碎片存在，胶原纤维排列紧密，结构保持高度取向和完成性。

附图4为本发明异种角膜移植物皮下植入组织相容性检测结果，表明本发明异种角膜移植物具有良好的组织相容性，不会引起炎症反应。☆指示为角膜基质。

具体实施方式

动物角膜来源可以是猪、马、驴、猴、猫和鸵鸟等非传染性海绵状脑病(TSE)易感动物中的一种，物种的差异不会引起制备方法实质性的差异，以下结合猪角膜和驴角膜为实例详细说明本发明技术方案的具体实施方式。

实施例1：猪角膜异种移植物的制备

1）紫外线照射

将获取的无菌猪眼球100个于超净工作台中，眼表朝上置于316L无菌钢盘，钢盘与254nm紫外灯（50w）距离为30cm，打开紫外灯，照射2h。

2）次氯酸钠溶液浸泡

将经过紫外线照射的眼球移入10倍量浓度0.1g/l的次氯酸钠溶液中，室温浸泡1h。然后用20倍量纯化水100rpm速度下振荡清洗10遍，每遍10min，获得彻底病毒灭活的眼球。

3）去上皮层

经过上步纯化水振荡清洗后的眼球已经充分溶胀，将溶胀的眼球移入超净工作台中的无菌洁净钢盘，用无菌滤纸逐个擦拭上皮部位，去除上皮层，暴露前弹力层。

4）脱细胞

将去上皮的眼球移入到10倍量的猪血清中，恒温箱中37±1℃孵育4h。将眼球移入到10倍量3M氯化钠高渗溶液中，4℃恒温水浴摇床中120rpm速度下振荡清洗4h。再将眼球移入到10倍量纯化水低渗液中，4℃恒温水浴摇床中120rpm速度下振荡清洗4h。重复高渗-低渗处理8遍，得到脱细胞眼球。

5）削切脱水

在百级洁净环境下，严格按照无菌操作要求，用灭菌后眼科剪从经过脱细胞处理的眼球上分离角膜，获得还处于溶胀状态的全层角膜基质，用角膜削切器削去后弹力层和部分基质层，并用环钻修成圆形，面积约为70mm2。将圆形的角膜基质移入到其重量100体积的75%（v/v）甘油溶液中，80rpm振荡脱水100min，获得300-400μm厚的透明角膜基质。

6）甘油溶液保存

严格按照无菌操作要求，将透明角膜基质转移至装有3ml 95%（v/v）甘油保存液的西林瓶中，轧盖密封，获得异种角膜移植物产品。

本实施例获得的角膜移植物面积约为70mm²，厚度为300-400μm。经检测透光率大于80%，缝线撕裂力大于1N，破裂强度大于3MPa，DNA残留量低于50ng/mg，I型胶原酶37℃消化3h完全降解。根据GB/T 16886系列标准进行生物学评价试验，结果表明其具有良好的生物学性能，无细胞毒性、无致敏和刺激反应，无全身毒性和遗传毒性。

实施例2：驴角膜异种移植物的制备

1）紫外线照射

将获取的无菌驴眼球100个于超净工作台中，眼表朝上置于316L无菌钢盘，钢盘与254nm紫外灯（50w）距离为30cm，打开紫外灯，照射4h。

2）次氯酸钠溶液浸泡

将经过紫外线照射的眼球移入15倍量浓度1g/l的次氯酸钠溶液中，室温浸泡20min。然后用30倍量纯化水120rpm速度下振荡清洗10遍，每遍10min，获得彻底病毒灭活的眼球。

3）去上皮层

经过上步纯化水振荡清洗后的眼球已经充分溶胀，将溶胀的眼球移入超净工作台中的无菌洁净钢盘，用无菌滤纸逐个擦拭上皮部位，去除上皮层，暴露前弹力层。

4）脱细胞

将去上皮的眼球移入到15倍量的人血清中，恒温箱中30±1℃孵育8h。将眼球移入到20倍量3M氯化钠高渗溶液中，4℃恒温水浴摇床中180rpm速度下振荡清洗8h。再将眼球移入到20倍量纯化水低渗液中，4℃恒温水浴摇床中180rpm速度下振荡清洗8h。重复高渗-低渗处理15遍，得到脱细胞眼球。

5）削切脱水

在百级洁净环境下，严格按照无菌操作要求，用灭菌后眼科剪从经过脱细胞处理的眼球上分离角膜，获得还处于溶胀状态的全层角膜基质，用角膜削切器削去后弹力层，并用环钻修成圆形，面积约为95mm²。将圆形的角膜基质移入到其重量500体积的85%（v/v）甘油溶液中，80rpm振荡脱水30min，获得400-500μm厚的透明角膜基质。

6）甘油溶液保存

严格按照无菌操作要求，将透明角膜基质转移至装有3ml 95%（v/v）甘油保存液的西林瓶中，轧盖密封，获得异种角膜移植物产品。

本实施例获得的角膜移植物面积约为95mm2，厚度为400-500μm。经检测透光率大于85%，缝线撕裂力大于3N，破裂强度大于5MPa，DNA残留量低于50ng/mg，I型胶原酶37℃消化6h完全降解。根据GB/T 16886系列标准进行生物学评价试验，结果表明其具有良好的生物学性能，无细胞毒性、无致敏和刺激反应，无全身毒性和遗传毒性。

上面结合实施例对本发明做了进一步的叙述，但本发明并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化。

Claims (8)

1.一种异种角膜移植物的无菌加工制备方法，采用眼球整体处理，包括两步病毒灭活——紫外线照射和次氯酸钠溶液浸泡、去上皮层、两步脱细胞——血清浸泡和渗透压法、削切脱水和甘油溶液保存步骤。

2.根据权利要求1所述的异种角膜移植物，其特征在于，所述异种角膜来源选用猪、马、驴、猴、猫和鸵鸟等非传染性海绵状脑病(TSE)易感动物中的一种。

3.一种如权利要求1-2中任一项所述的异种角膜移植物的无菌加工制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

步骤一、紫外线照射

将无菌的动物眼球眼表部分朝上，置于短波紫外线（200-280nm）下照射;

紫外线波长优选254nm，照射时间为1-8h，照射强度为0.03-0.5J/cm²，优选0.1-0.3J/cm²;

步骤二、次氯酸钠溶液浸泡

将紫外线照射后的眼球再次用浓度为0.1-1g/l的次氯酸钠溶液进行浸泡病毒灭活，浸泡时间为10-60min，溶液用量为眼球重量的5-20倍（v/m）;然后用10-100倍量清洗液（v/m）进行振荡清洗3-10遍，每遍10-60min，去除残留次氯酸钠;

步骤三、去上皮层

用灭菌滤纸轻轻搓去上皮层，暴露出前弹力层;

步骤四、脱细胞

将去上皮的眼球先浸泡于5-20倍量（v/m）经过常规纳滤膜病毒灭活处理的动物自体血清或人血清中，于20-38℃条件下浸泡2-24h;

然后将眼球移入5-50倍量（v/m）浓度为1-5M、温度为2-25℃的高渗盐溶液中，50-250rpm下振荡处理1-24h;完成一次高渗盐振荡处理后，再采用相同的条件进行低渗振荡清洗;如此重复高渗-低渗振荡清洗处理5-20遍;

步骤五、削切脱水在百级洁净环境下，严格按照无菌操作要求，用角膜削切器削去后弹力层和部分基质层，再用环钻进行圆形修整;然后采用甘油溶液进行振荡脱水处理，甘油溶液的浓度为60-100%（v/v），优选75-100%，再优选85-95%；用量为角膜基质重量的100-500倍量（v/m）；脱水时间为30-120min，优选45-60min;

步骤六、甘油溶液保存在百级洁净环境下，严格按照无菌操作要求，将角膜基质转移至装有浓度90-100%（v/v）的无菌甘油保存液的西林瓶中，轧盖密封，获得异种角膜移植物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述异种角膜移植物厚度为100-500μm，面积为60-100mm²。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤二所述清洗液和步骤四所述低渗溶液可采用纯化水、注射用水、生理盐水或磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.4左右）中的一种。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述高渗盐溶液可采用氯化钠、氯化钾或二者混合物溶液中的一种。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤四所述溶液均需经过0.22μm滤膜过滤降低处理过程中的微生物污染风险。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述甘油保存液灭菌方法可采用蒸汽灭菌或滤膜过滤除菌中的一种。