CN112426566A - 一种再生性角膜材料与其制备方法及用途 - Google Patents

一种再生性角膜材料与其制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于角膜交联保护后脱细胞处理技术领域，本发明涉及一种再生性角膜材料与其制备方法及用途。所述方法为：将轻度脱细胞角膜片放入交联溶液中进行交联保护、再次脱细胞得到再生性角膜材料；角膜片来源于人或动物角膜，交联溶液中含有甲醛、戊二醛、京尼平、EDC/NHS中的一种或多种。解决脱细胞角膜基质作为植入体构建角膜前板层后会出现角膜透明度降低甚至植片溶解等问题。

Description

一种再生性角膜材料与其制备方法及用途
技术领域
本发明属于角膜交联保护后脱细胞处理技术领域，具体涉及一种再生性角膜材料与其制备方法及用途。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
严重的角膜感染、角膜外伤或者自身免疫疾病会造成角膜病变，进而发展为角膜穿孔甚至致盲，角膜移植手术是目前治疗角膜盲的最有效方法，然而角膜供体来源短缺且术后免疫排斥的发生为临床上角膜缺损修复带来了很大困难。
具有良好诱导性的角膜再生材料既能引导角膜细胞再生，又能重建角膜结构，因此采用组织工程技术体外构建适用的角膜植入体替换发生病变的角膜组织可望从根本上解决上述难题。
脱细胞角膜基质具有与正常角膜相似的解剖结构和生理功能，具有一定韧性和强度，且它的免疫原性较低，是一种优良的角膜组织工程支架材料，然而，研究发现在脱细胞过程中脱细胞剂不可避免的会对角膜基质的结构及成分造成破坏，进而导致以脱细胞角膜基质作为植入体构建角膜前板层后会出现角膜透明度降低甚至植片溶解等问题。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种透明度高、力学性能好、具有良好的抗降解性和生物相容性、低免疫原性的再生性角膜材料与其制备方法及用途。
为了解决以上技术问题，本发明的技术方案为：
第一方面，一种再生性角膜材料的制备方法，
所述方法为：将轻度脱细胞角膜片放入交联溶液中进行交联保护，再次彻底脱细胞得到再生性角膜材料；
角膜片来源于人或动物角膜，交联溶液中含有甲醛和戊二醛、京尼平、EDC/NHS中的一种或多种。
再生性角膜材料的制备方法为针对角膜片进行初步轻度脱细胞、交联保护、多次彻底脱细胞处理的方法，通过交联保护的处理过程，解决了传统脱细胞技术对动物角膜破坏较大进而导致角膜移植术后出现的透明度降低及植片溶解等问题。
在本发明的实施方式中，交联溶液的浓度为0.1％-4％w/v；优选为0.2％-1％w/v；交联时间为0.5-5h；交联中加入MES缓冲剂调节pH值，交联溶液的pH值为4.5-7。
以交联剂对脱细胞角膜材料进行交联保护，不仅使角膜胶原纤维能保持原有曲率，提高透明度和力学性能，而且增加了脱细胞角膜的抗溶解性能及生物相容性等性能。
在本发明的实施方式中，角膜片取自动物眼球的角膜基质片，角膜基质片为带有细胞和天然胶原的材料。角膜片为从眼球上直接取下来的，含有前弹力层及部分基质层的角膜材料。选用动物角膜，通过交联保护后脱细胞处理方法，维持其内部天然胶原特殊的结构及纤维排列，以维持角膜透明度及力学强度等性能。
在本发明的实施方式中，角膜片来源于人、猪、牛、羊、狗等。
交联进行前，对带有细胞和天然胶原的材料进行了第一次轻度脱细胞处理，即交联的过程中角膜上还含有部分细胞，减轻脱细胞剂对角膜天然胶原纤维结构的破坏，以提高其透明度、力学性能、抗降解性和生物相容性，降低免疫原性。
在本发明的实施方式中，轻度脱细胞处理的方法为将角膜片置入初步轻度脱细胞剂溶液中，初步轻度脱细胞剂为十二烷基硫酸钠、TritonX-100，EDTA、脱氧胆酸钠、原钒酸钠、胰酶、核酸酶、磷脂酶中的一种或多种。
在本发明的实施方式中，轻度脱细胞处理时间15-180min，期间每隔15-60min换液一次。脱细胞处理过程为使角膜上皮细胞层、内皮细胞层脱落及部分基质细胞裂解死亡。
在本发明的实施方式中，轻度脱细胞剂溶液的浓度为0.1％-2％w/v。
在本发明的实施方式中，角膜片进行轻度脱细胞处理后，进行洗除脱细胞剂的过程，具体方法为，将角膜片置入洗除脱细胞剂的溶液中，洗除脱细胞剂为超纯水或pH值为6.5-7.5的无菌PBS溶液。
在本发明的实施方式中，角膜片进行交联保护后，对角膜片进行多次彻底脱细胞处理，脱细胞处理的方法为将角膜片置入再脱细胞剂溶液中，再脱细胞剂为十二烷基硫酸钠、TritonX-100，EDTA、脱氧胆酸钠、原钒酸钠、胰酶、核酸酶、磷脂酶中的一种或多种；脱细胞剂溶液的浓度为0.5％-6％w/v。
在本发明的实施方式中，再次彻底脱细胞处理的时间为4-72h，期间每隔0.5-6h换液一次。
在本发明的实施方式中，角膜片进行再脱细胞处理后，进行洗除脱细胞剂的过程，具体方法为，将角膜片置入洗除脱细胞剂的溶液中，洗除脱细胞剂为超纯水或pH值为6.5-7.5的无菌PBS溶液。
在本发明的实施方式中，交联溶液、初步轻度脱细胞剂溶液或再脱细胞剂溶液的体积与角膜片的体积比为2:1-40:1。
在本发明的实施方式中，角膜片厚度为100-400μm，直径为3-10mm。
在本发明的实施方式中，再脱细胞处理后，将处理后的角膜片进行封存、灭菌处理，封存处理的方法为：将角膜片置入甘油溶液中，灭菌采用钴-60或电子束辐照灭菌；可选的，辐照剂量为25-30kGy。
在本发明的实施方式中，所有处理过程均在无菌条件下进行。
第二方面，上述再生性角膜材料的制备方法制备得到的再生性角膜材料。
第三方面，上述再生性角膜材料在作为角膜基质替代物中的应用；可选的，在治疗因角膜病变或角膜损伤引起的盲性眼疾中的应用。
本发明一个或多个技术方案具有以下有益效果：
(1)以交联剂对脱细胞角膜材料进行交联保护，不仅使角膜胶原纤维能保持原有曲率，提高透明度和力学性能，而且增加了脱细胞角膜的抗溶解性能及生物相容性等性能。
(2)制备工艺较简单，成本较低，易于工业化推广和应用。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为本发明实施例1制备的再生性角膜材料与未经处理的天然角膜苏木素-伊红染色照片对比图，其中，A为天然角膜的苏木素-伊红染色照片图，B为处理后的再生性角膜材料的苏木素-伊红染色照片图；
图2为DAPI染色对比图；A为未经处理的天然角膜的DAPI染色照片图，B为处理后的再生性角膜材料的DAPI染色照片图；
图3为实施例1再生性角膜材料植片兔子角膜深板层移植30天后的苏木素-伊红染色照片图；
图4为移植30天后的效果图；其中A是再生性角膜材料植片兔子角膜深板层移植30天后的裂隙灯显微镜图(弥散照明法)；B是移植30天后的裂隙灯显微镜图(直接焦点照明法)；C是移植30天后的植片荧光染色图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面结合实施例对本发明进一步说明
实施例1
于屠宰场内摘取刚被处死猪的眼球，用75％的酒精冲洗直至眼球表面无血污后将其浸泡于4000U/L的妥布霉素溶液中带回；
于无菌室内将猪眼球取出，用浓度为0.9％的生理盐水冲洗整个眼球，然后剪除眼球周围的筋膜肌肉，接着用无菌PBS冲洗整个眼球，最后用浓度为0.9％的生理盐水冲洗整个眼球；
用5mm直径环钻从预处理后的眼球上直接钻取角膜，在显微镜下对材料进行切削，得到厚度为200μm的只含有前弹力层及部分基质层的角膜材料；将角膜材料置于脱细胞剂溶液内，在300r/min下振荡处理，使角膜上皮细胞层、内皮细胞层脱落及部分基质细胞裂解死亡；其中，所述脱细胞剂溶液为1％w/v的脱氧胆酸钠和0.1％w/v的原钒酸钠混合液，脱细胞处理时间60min，每隔20min换液一次；
取出轻度脱细胞处理后的角膜，用无菌PBS多次洗除角膜表面的脱细胞剂溶液后，将材料浸入交联剂溶液中对脱细胞角膜进行交联保护；其中交联剂选用0.5％w/v的EDC/NHS溶液，在制备交联剂溶液时，以MES为缓冲剂调pH值至5.6；交联时间为2h。
将交联保护后的材料置于脱细胞剂溶液中在300r/min下振荡进行二次脱细胞处理，然后将成品置于无菌PBS中在300r/min下振荡，洗除净材料内部残留的脱细胞剂；其中，所述脱细胞剂溶液为2％w/v的脱氧胆酸钠和0.2％的原钒酸钠混合液，脱细胞处理时间12h，每隔3h换液一次；
采用甘油溶液进行封存，30kGy的钴-60辐照灭菌，得到透明的再生性角膜材料。
上述步骤中，所有处理角膜的溶液与角膜体积比为10:1，所有操作步骤均需在无菌条件下完成。
本实施例制备得到的角膜片厚度为200μm，直径为5mm。
实施例2
于屠宰场内摘取刚被处死牛的眼球，用75％的酒精冲洗直至眼球表面无血污后将其浸泡于4000U/L的妥布霉素溶液中带回；
于无菌室内将牛眼球取出，用浓度为0.9％的生理盐水冲洗整个眼球，然后剪除眼球周围的筋膜肌肉，接着用无菌PBS冲洗整个眼球，最后用浓度为0.9％的生理盐水冲洗整个眼球；
用8mm直径环钻从预处理后的眼球上直接钻取角膜，在显微镜下对材料进行切削，得到厚度为400μm的只含有前弹力层及部分基质层的角膜材料；将角膜材料置于脱细胞剂溶液内，于300r/min下振荡处理，使角膜上皮细胞层、内皮细胞层脱落及部分基质细胞裂解死亡；其中，所述脱细胞剂溶液为1.5％w/v的十二烷基硫酸钠，脱细胞处理时间90min，每隔30min换液一次；
取出轻度脱细胞处理后的角膜，用无菌PBS多次洗除角膜表面的脱细胞剂溶液后，将材料浸入交联剂溶液中对脱细胞角膜进行交联保护；交联剂选用0.5％w/v的戊二醛溶液，在制备交联剂溶液时，以MES为缓冲剂调pH值至6.5；交联时间为4h。
将交联保护后的材料置于脱细胞剂溶液中在300r/min下振荡进行二次脱细胞处理，然后将成品置于无菌PBS中在300r/min下振荡，洗除净材料内部残留的脱细胞剂；其中，所述脱细胞剂溶液为4％w/v的十二烷基硫酸钠，脱细胞处理时间24h，每隔4h换液一次；
采用甘油溶液进行封存，25kGy的钴-60辐照灭菌，得到透明的再生性角膜材料。
上述步骤中，所有处理角膜的溶液与角膜体积比为20:1，所有操作步骤均需在无菌条件下完成。
本实施例制备得到的角膜片厚度为400μm，直径为8mm。
实施例3
于屠宰场内摘取刚被处死羊的眼球，用75％的酒精冲洗直至眼球表面无血污后将其浸泡于4000U/L的妥布霉素溶液中带回；
于无菌室内将羊眼球取出，用浓度为0.9％的生理盐水冲洗整个眼球，然后剪除眼球周围的筋膜肌肉，接着用无菌PBS冲洗整个眼球，最后用浓度为0.9％的生理盐水冲洗整个眼球；
用10mm直径环钻从预处理后的眼球上直接钻取角膜，在显微镜下对材料进行切削，得到厚度为400μm的只含有前弹力层及部分基质层的角膜材料；将角膜材料置于脱细胞剂溶液内，于300r/min下振荡处理，使角膜上皮细胞层、内皮细胞层脱落及部分基质细胞裂解死亡；其中，所述脱细胞剂溶液为2％w/v的EDTA和0.2％w/v的DNA-RNA酶混合液，脱细胞处理时间120min，每隔30min换液一次；
取出轻度脱细胞处理后的角膜，用无菌PBS多次洗除角膜表面的脱细胞剂溶液后，将材料浸入交联剂溶液中对脱细胞角膜进行交联保护；交联剂选用1％w/v的京尼平溶液，在制备交联剂溶液时，以MES为缓冲剂调pH值至6.5；交联时间为3h。
将交联保护后的材料置于脱细胞剂溶液中在300r/min下进行二次脱细胞处理，然后将成品置于无菌PBS中在300r/min下振荡，洗除净材料内部残留的脱细胞剂；其中，所述脱细胞剂溶液为5％w/v的EDTA和0.5％w/v的DNA-RNA酶混合液，脱细胞处理时间36h，每隔6h换液一次；采用甘油溶液进行封存，25kGy的钴-60辐照灭菌，得到透明的再生性角膜材料。
上述步骤中，所有处理角膜的溶液与角膜体积比为40:1，所有操作步骤均需在无菌条件下完成。
本实施例制备得到的角膜片厚度为400μm，直径为10mm。
图1至图3的解释:
通过图1中的A图和B图，可看出实施例1制备的再生性角膜材料相比于未经处理的天然角膜，胶原结构保存完好。
图2中的A图为未经处理的天然角膜的DAPI染色照片图，它具有完整的全层角膜结构，可明显判断出上皮层和内皮层完整，角膜基质内存在大量基质细胞。通过图2中的B图可以看到，经过实施例1的处理后，角膜上可看出没有任何细胞残留。
图3为实施例1制备的再生性角膜材料植片兔子角膜深板层移植30天后的苏木素-伊红染色照片图，可看出再生性角膜材料植片与兔角膜愈合完好，完全整合且没有降解。
通过图4中的A图可以看到植片透明度高、无溶解现象；通过图4中的B图可以看到角膜植片弯曲度及厚度正常，植片与兔角膜结合紧密；通过图4中的C图可以看到角膜上皮细胞已覆盖植片。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种再生性角膜材料的制备方法，其特征在于：所述方法为：将轻度脱细胞角膜片放入交联溶液中进行交联保护，再次彻底脱细胞得到再生性角膜材料；
角膜片来源于人或动物角膜，交联溶液中含有甲醛和戊二醛、京尼平、EDC/NHS中的一种或多种。
2.如权利要求1所述的再生性角膜材料的制备方法，其特征在于：交联溶液的浓度为0.1％-4％w/v；优选为0.2％-1％w/v；交联时间为0.5-5h；
可选的，交联溶液中加入MES缓冲剂调节pH值，交联溶液的pH值为4.5-7。
3.如权利要求1所述的再生性角膜材料的制备方法，其特征在于：角膜片取自动物眼球的角膜基质片，角膜基质片为带有细胞和天然胶原的材料；动物为哺乳动物，优选为人、猪、牛、羊、狗。
4.如权利要求1所述的再生性角膜材料的制备方法，其特征在于：轻度脱细胞处理的方法为将角膜片置入脱细胞剂溶液中，脱细胞剂为十二烷基硫酸钠、TritonX-100，EDTA、脱氧胆酸钠、原钒酸钠、胰酶、核酸酶、磷脂酶中的一种或多种；
优选的，第一次轻度脱细胞处理时间15-180min，期间每隔15-60min换液一次；
优选的，初步轻度脱细胞剂溶液的浓度为0.1％-2％w/v。
5.如权利要求1所述的再生性角膜材料的制备方法，其特征在于：角膜片进行轻度脱细胞处理后，进行洗除脱细胞剂的过程，具体方法为，将角膜片置入洗除脱细胞剂的溶液中，洗除脱细胞剂为超纯水或pH值为6.5-7.5的无菌PBS溶液。
6.如权利要求1所述的再生性角膜材料的制备方法，其特征在于：角膜片进行交联保护后，对角膜片进行再次脱细胞处理，脱细胞处理的方法为将角膜片置入再脱细胞剂溶液中，再脱细胞剂为十二烷基硫酸钠、TritonX-100，EDTA、脱氧胆酸钠、原钒酸钠、胰酶、核酸酶、磷脂酶中的一种或多种；
优选的，再脱细胞处理的时间为4-72h，期间每隔0.5-6h换液一次；脱细胞剂溶液的浓度为0.5％-6％w/v。
7.如权利要求1所述的再生性角膜材料的制备方法，其特征在于：角膜片进行再脱细胞处理后，进行洗除脱细胞剂的过程，具体方法为，将角膜片置入洗除脱细胞剂的溶液中，洗除脱细胞剂为超纯水或pH值为6.5-7.5的无菌PBS溶液；
或，交联溶液、初步轻度脱细胞剂溶液或再脱细胞剂溶液的体积与角膜片的体积比为2:1-40:1。
8.如权利要求1所述的再生性角膜材料的制备方法，其特征在于：角膜片厚度为100-400μm，直径为3-10mm；再脱细胞处理后，将处理后的角膜片进行封存、灭菌处理，封存处理的方法为：将角膜片置入甘油溶液中，灭菌采用钴-60或电子束辐照灭菌；可选的，辐照剂量为25-30kGy。
9.权利要求1-8任一所述的再生性角膜材料的制备方法制备得到的再生性角膜材料。
10.权利要求9所述的再生性角膜材料在作为角膜基质替代物中的应用；可选的，在治疗因角膜病变或角膜损伤引起的盲性眼疾中的应用。
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