CN109498840B - 一种眼表修复膜及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种眼表修复膜及其制备方法。该制备方法包括：(1)取猪小肠空肠段，清洗，径向切开，去除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜；(2)将步骤(1)所得猪小肠粘膜下层组织膜分别置于过氧乙酸溶液和氢氧化钠溶液中浸泡，取出清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质；(3)用多巴胺溶液浸泡步骤(2)所得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料。该制备方法获得的猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料具有较合适的机械硬度，这样的机械硬度能保证猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质能够很好的贴附在眼表上。

Description

一种眼表修复膜及其制备方法
技术领域
本发明涉及组织修复材料技术领域，特别是涉及一种眼表修复膜及其制备方法，具体涉及一种猪小肠粘膜下层组织去细胞基质材料及其制备方法。
背景技术
眼表疾病是眼科的常见病、多发病，且复发率高，是眼科主要致盲疾病之一。比如有：化学烧伤、表浅眼表溃疡、巩膜溃疡和穿孔、翼状胬肉手术和眼表外伤等。对于各种意外导致的眼表上皮细胞缺损的治疗，目前以眼表面重建术效果最好，常采用的方法是自体或异体眼表移植术。其中，眼表上皮透明、无血管，位于眼表的最外层，其完整性是维持眼表稳定及正常视觉功能的关键。眼表上皮缺损，必须由周围的上皮细胞移行和增殖才能得以修复，所以保护和促进眼表上皮的再生是治疗的一个重要环节。自体移植需要有一只眼保持完整无损，但是手术期间仍有可能带来二次伤害。异体移植鉴于当时临床上大多应用保存羊膜作为异体移植材料，但是其来源的局限性限制了其广泛的应用。
细胞外基质(ECM)是围绕身体几乎所有组织中的细胞的结构和功能性物质，属于天然的生物材料。ECM经过机械法、化学法、酶法等方法，除去原组织中的DNA及细胞，再通过交联、消毒等处理后制备而成，它是一种具有一定的机械强度、低免疫原性的动物源性材料。其中，胶原蛋白是天然活组织中的主要结构框架，是ECM中最丰富的蛋白质。ECM被动地支持着细胞，并调节细胞与细胞之间的联系，影响细胞的迁移、增殖和分化。ECM还提供了组织修复所需的微孔结构和环境。由于ECM是组织维持所必需的，它在组织修复中也起着重要作用。没有功能性ECM，修复就会停止，因为ECM不再能够支持正常的细胞过程。
目前，细胞外基质(ECM)已经广泛应用于现代生物医学领域，如肌腱重建、下泌尿道重建、硬脑膜修补、血管重建、修复部分或全层皮肤损伤、生物疝修补，抗粘连和骨修复引导膜等方面。例如：贾晓静将兔眼表内皮细胞与SIS联合培养构建眼表后板层，兔眼表内皮细胞可在SIS上黏附生长；Goulle F将SIS用于106例狗和猫的眼表损伤的修复。虽然这些技术成功获得了细胞外基质(ECM)材料，但是在用于眼表缺损修复时还存在一定的弊端，例如这些细胞外基质材料的硬度不合适，严重阻碍了ECM在眼表修复中的广泛应用。
因此，亟待提供一种适用于眼表修复的猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料。
发明内容
基于此，本发明的主要目的是提供一种眼表修复膜及其制备方法。该制备方法获得的猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料具有较好的机械硬度，这样的机械硬度能保证猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质能够很好的贴附在眼表上。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种脱细胞基质材料的制备方法，所述的制备方法包括：
(1)取猪小肠空肠段，清洗，径向切开，去除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜；
(2)将步骤(1)所得猪小肠粘膜下层组织膜分别置于过氧乙酸溶液和氢氧化钠溶液中浸泡，取出清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质；
(3)用多巴胺溶液浸泡步骤(2)所得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质，获得脱细胞基质材料。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述的过氧乙酸溶液的质量浓度为0.05％～0.1％；所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.05％～0.1％；所述浸泡的时间为4h～7h。
在其中一个实施例中，步骤(2)中，所述的过氧乙酸溶液的质量浓度为0.1％；所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.1％；所述浸泡的时间为7h。
在其中一个实施例中，步骤(3)中，所述多巴胺溶液为含1.5mg/mL～3mg/mL多巴胺的pH8.5、10mM的Tris缓冲液，用所述多巴胺溶液浸泡的时间为10h～13h。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，去除粘膜层的方式为采用木质刮板均匀刮除。
在其中一个实施例中，步骤(1)中，去除肌膜层、浆膜层的方式为采用木质刮板、手术刀刮除。
在其中一个实施例中，步骤(3)还对小肠粘膜下层组织脱细胞基质材料进行冷冻干燥、灭菌。
在其中一个实施例中，步骤(1)、步骤(2)中，所述的清洗采用磷酸缓冲盐溶液。
本发明的另一目的是提供一种上述的制备方法获得的脱细胞基质材料。
本发明的再一目的是提供一种上述的脱细胞基质材料作为修复材料在眼表损伤修复中的应用。
与现有技术相比，本发明具备如下有益效果：
本发明从猪小肠组织中挑选猪小肠粘膜下层组织膜，并采用过氧乙酸溶液浸泡搭配氢氧化钠溶液浸泡的方式去除猪小肠粘膜下层组织膜中的DNA等从而制备猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质，然后再在猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质上积累一层多巴胺，从而获得脱细胞基质材料。本发明挑选猪小肠粘膜下层组织膜作为脱细胞基质来源，生物安全性得到了提高，免疫原性降到了可以接受的范围，同时避免了交联剂带来的细胞毒性；本发明工艺制备的脱细胞基质材料不仅拉伸强度变大满足临床所需要的生物力学强度，关键是还具有较合适的机械硬度，这样的机械硬度能保证猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质能够很好的贴附在眼表上。另外，采用本发明制备的脱细胞基质材料进行眼表损伤修复，能够避免传统修复技术例如自体移植带来的二次伤害和供体不足的缺点、羊膜材料修复带来的潜在处理不当危险等等，很好的引导眼表上皮组织细胞移行粘附、增殖、促进上皮化，从而修复与重建眼表。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例1
本实施例提供一种猪小肠粘膜下层组织去细胞基质材料及其制备方法。该制备方法包括：
步骤1、取猪小肠空肠段，清洗并径向剪开，并使用PBS溶液(磷酸缓冲溶液)反复冲洗以去除污染物。
步骤2、物理去除粘膜，使用木质刮板，小心均匀地刮去SIS膜内层的粘膜层。
步骤3、物理去除肌膜和浆膜，木质刮板和手术刀配合使用，去除SIS膜外层的肌膜层和浆膜层。
步骤4、配置0.2％(质量分数)过氧乙酸溶液，然后将除去粘膜层、肌膜层和浆膜层的SIS膜浸泡在0.2％过氧乙酸溶液7个小时。
步骤5、取出过氧乙酸溶液处理后的SIS去细胞基质，使用PBS溶液反复清洗3次。
步骤6、将清洗过的SIS去细胞基质再浸泡于0.2％(质量分数)氢氧化钠溶液中7个小时，取出后PBS溶液反复清洗3次。
步骤7、将SIS膜放置于玻璃器皿中，使其完全铺展开。
步骤8、配置10mM的Tris缓冲液，使其pH值为8.5，随后加入多巴胺粉末，使其终浓度为2mg/mL。
步骤9、将多巴胺溶液缓缓倒入放置SIS膜的玻璃器皿，使其完全浸没SIS膜。静止12小时。
步骤10、取积累有多巴胺的猪小肠粘膜下层组织去细胞基质材料，冷冻干燥。
步骤11、用上述方法制备的猪小肠粘膜下层组织去细胞基质材料用射线灭菌备用。
实施例2
本实施例提供一种猪小肠粘膜下层组织去细胞基质材料及其制备方法。该制备方法包括：
步骤1、取猪小肠空肠段，清洗并径向剪开，并使用PBS溶液反复冲洗以去除污染物。
步骤2、物理去除粘膜，使用木质刮板，小心均匀地刮去SIS膜内层的粘膜层。
步骤3、物理去除肌膜和浆膜，木质刮板和手术刀配合使用，去除SIS膜外层的肌膜和浆膜。
步骤4、配置0.2％(质量分数)氢氧化钠溶液，然后将除去粘膜层、肌膜层和浆膜层的SIS膜浸泡在0.2％氢氧化钠溶液7个小时。
步骤5、取出氢氧化钠溶液处理后的SIS去细胞基质，使用PBS溶液反复清洗3次。
步骤6、配置0.2％(质量分数)过氧乙酸溶液，然后将SIS去细胞基质浸泡在0.2％过氧乙酸溶液7个小时。取出，使用PBS溶液反复清洗3次。
步骤7、将SIS膜放置于玻璃器皿中，使其完全铺展开。
步骤8、配置10mM的Tris缓冲液，使其票pH值为8.5，随后加入多巴胺粉末，使其浓度为2mg/mL。
步骤9、将多巴胺溶液缓缓倒入放置SIS膜的玻璃器皿，使其完全浸没SIS膜。静止12小时。
步骤10、取积累有多巴胺的猪小肠粘膜下层组织去细胞基质材料，冷冻干燥。
步骤11、用上述方法制备的猪小肠粘膜下层组织去细胞基质材料用射线灭菌备用。
实施例3
本实施例是实施例1的变化例，变化之处主要是过氧乙酸溶液、氢氧化钠溶液的浓度以及浸泡时间。本实施例采用的过氧乙酸溶液的浓度为0.1％、浸泡时间为7h，氢氧化钠溶液的浓度为0.5％、浸泡时间为4h。
实施例4
本实施例是实施例1的变化例，变化之处主要是过氧乙酸溶液、氢氧化钠溶液的浓度以及浸泡时间。本实施例采用的过氧乙酸溶液的浓度为0.5％、浸泡时间为4h，氢氧化钠溶液的浓度为0.1％、浸泡时间为7h。
对比例1
本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1，主要差别在于仅将SIS膜浸泡在0.2％过氧乙酸溶液7个小时，而没有配合采用氢氧化钠溶液浸泡，即省略了步骤6。
对比例2
本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1，主要差别在于仅将SIS膜浸泡在0.2％氢氧化钠溶液7个小时，而没有配合采用过氧乙酸溶液浸泡，即省略了步骤4、5。
对比例3
本对比例是实施例1的对比例，相对于实施例1，主要差别在过氧乙酸溶液、氢氧化钠溶液的浓度以及浸泡时间。本对比例采用的过氧乙酸溶液的浓度为0.05％、浸泡时间为3h，氢氧化钠溶液的浓度为0.55％、浸泡时间为8h。
性能测试：
(1)测试方法：将实施例和对比例的脱细胞SIS膜使用万能试验机测试其器械性能。
(2)根据：《中国药典》2015年版四部“3407外源性DNA残留量测定法测得脱细胞SIS膜的DNA残留含量。
测试结果参见下表1。
表1
Figure BDA0001883105550000081
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：
(1)取猪小肠空肠段，清洗，径向切开，去除粘膜层、肌膜层、浆膜层，获得猪小肠粘膜下层组织膜；
(2)将步骤(1)所得猪小肠粘膜下层组织膜分别置于过氧乙酸溶液和氢氧化钠溶液中浸泡，取出清洗，获得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质；
(3)用多巴胺溶液浸泡步骤(2)所得猪小肠粘膜下层组织脱细胞基质，获得脱细胞基质材料；
步骤(2)中，所述的过氧乙酸溶液的质量浓度为0.2％；所述的氢氧化钠溶液的质量浓度为0.2％；所述浸泡的时间为7h。
2.根据权利要求1所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述多巴胺溶液为含1.5mg/mL～3mg/mL多巴胺的pH8.5、10mM的Tris缓冲液，用所述多巴胺溶液浸泡的时间为10h～13h。
3.根据权利要求1所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，去除粘膜层的方式为采用木质刮板均匀刮除。
4.根据权利要求1所述的基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，去除肌膜层、浆膜层的方式为采用木质刮板、手术刀刮除。
5.根据权利要求1所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(3)还对脱细胞基质材料进行冷冻干燥、灭菌。
6.根据权利要求1所述的脱细胞基质材料的制备方法，其特征在于，步骤(1)、步骤(2)中，所述的清洗采用磷酸缓冲盐溶液。
7.权利要求1至6任一项所述的制备方法获得的脱细胞基质材料。
8.权利要求7所述的脱细胞基质材料在制备眼表损伤修复材料中的应用。
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