CN108888804A - 一种软组织修复材料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种软组织修复材料及其制备方法，属于生物医用材料加工技术领域。本发明提供的制备方法包括以下步骤：1)去除掉哺乳动物小肠组织上的小肠黏膜、肌层和浆膜，用含抗生素的无菌缓冲液冲洗3～5次，得到冲洗后的小肠黏膜下层组织；2)裁剪为段，沿中线剖开、展平，得到前处理小肠黏膜下层组织；3)置于含表面活性剂和核酸酶的无菌缓冲液中，37℃振荡处理1～4h，得到脱细胞小肠黏膜下层组织；4)振荡清洗，切割，干燥，得到干燥后的中央基质膜；5)辐照灭菌，得到软组织修复材料。本发明制备方法能够得到安全有效的并具有良好生物活性和生物相容性的软组织修复材料。

Description

一种软组织修复材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及生物医用材料加工技术领域，具体涉及一种软组织修复材料及其制备方法。
背景技术
用于组织修复的理想支架材料需要为种植细胞或体内细胞的再生提供与自体组织细胞外基质相似的微环境(包括胞外基质的蛋白组成、结构和生物力学特性)。由于天然细胞外基质复杂精细的微观组织结构和现有技术的局限性，利用人工的方法制备替代天然细胞外基质的材料仍然是一个难题。利用脱细胞的方法，从异体组织中去除细胞成分，保留天然细胞外基质为解决这一难题提供了新的有效解决途径。
小肠黏膜下层主要以细胞外基质成分为主，含有少量细胞和部分较大的血管和淋巴管组织，自身具有低免疫原性、抗微生物活性的特点，是制备脱细胞外基质材料的优质来源。
随着生命科学和现代医学的发展，脱细胞方法已经得到了长足发展。但脱细胞技术仍旧处于探索阶段，缺少规范化的体系和标准。存在这灭毒工艺不当，造成细胞外基质蛋白失活；处理时间过长，造成组织细胞因子和大量可溶性蛋白流逝；选材不当，待脱细胞处理的组织主要由细胞结构构成，胞外基质含量少，无法进行高效的脱细胞处理；处理方法不当，组织过厚，不能完全去除内部细胞成分，造成潜在的免疫源；所选试剂不当，例如强酸强碱对蛋白造成不可逆的变性，有毒试剂残留体内造成潜在风险。中国专利申请号为200710177285.6的发明专利涉及一种SIS组织修复材料的制备方法。虽然对小肠黏膜下层组织达到了脱细胞效果，但在脱细胞过程中使用了大量有机溶剂例如过氧乙酸，甲醇，氯仿和甲烷等，这些试剂不仅对组织的生物活性造成一定程度不可逆的变性而且试剂的残留对体内移植有着潜在的风险。中国专利申请号为200810150792.5的发明专利涉脱细胞小肠黏膜下层生物材料的制备方法，同样存在残留试剂具有潜在生物毒性和强碱性脱细胞环境造成生物活性降低的不足。目前仍缺乏一种安全性高、生物活性好的生物材料的制备方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种软组织修复材料及其制备方法。本发明采用小肠黏膜下层组织为材料，应用更加安全高效的脱细胞方法，提供了一种安全有效的并具有良好生物活性、生物相容性和适当的生物降解速率的软组织修复材料。
本发明提供了一种软组织修复材料的制备方法，包括以下步骤：
1)去除掉哺乳动物小肠组织上的小肠黏膜、肌层和浆膜，得到小肠黏膜下层组织，用含抗生素的无菌缓冲液冲洗3～5次，得到冲洗后的小肠黏膜下层组织；
2)将步骤1)得到的冲洗后的小肠黏膜下层组织裁剪为不长于5cm的段，沿中线剖开、展平，浸泡于无菌缓冲液中，得到前处理小肠黏膜下层组织；
3)将步骤2)得到的前处理小肠黏膜下层组织置于含质量百分含量为0.2～1％表面活性剂和200～600U/mL核酸酶的无菌缓冲液中，37℃振荡处理1～4h，得到脱细胞小肠黏膜下层组织；
所述表面活性剂包括生物表面活性剂；
4)将步骤3)得到的脱细胞小肠黏膜下层组织置于无菌缓冲液中，振荡清洗6～8次，每次5～10min，将清洗后的小肠黏膜下层组织切割，留取中央基质膜，干燥，得到干燥后的中央基质膜；
5)将所述干燥后的中央基质膜辐照灭菌，得到软组织修复材料。
优选的是，所述小肠组织包括猪小肠组织。
优选的是，所述无菌缓冲液包括PBS缓冲液、D-Hanks缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
优选的是，所述抗生素包括庆大霉素、青链霉素或妥布霉素。
优选的是，步骤3)所述所述生物表面活性剂包括氨基酸表面活性剂或槐糖脂，所述氨基酸表面活性剂包括月桂酸肌氨酸或椰油酰谷氨酸钠盐。
优选的是，步骤4)所述切割为沿自然脉络纹理进行切割，所述自然脉络纹理包括可见血管网络、淋巴管网络和神经网络。
本发明还提供了基于上述技术方案所述制备方法得到的软组织修复材料。
本发明还提供了上述技术方案所述软组织修复材料作为原材料或组成部分，在制备药品或医疗器械中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述软组织修复材料在制备非角化的上皮和内皮损伤或缺失后替代品中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述软组织修复材料在体外3D细胞培养和构建研究模型中的应用。
本发明提供了一种软组织修复材料的制备方法。本发明在维持小肠黏膜下层组织三维组织构造不变的前提下，彻底清除了细胞成分，得到具有完整的三维组织构造的小肠黏膜下层组织基质；本发明选择肠黏膜下层组织中细胞成分最少的中央基质膜脱细胞过程所用试剂对组织和宿主无毒无害，保证了脱细胞材料的生物活性和产品的安全性；且本发明方法简便、高效、经济、合理，整个工艺过程属于清洁化制备，对环境无污染。本发明方法采用小肠黏膜下层组织为材料，应用更加安全高效的脱细胞方法，提供了一种安全有效的并具有良好生物活性和生物相容性的软组织修复材料。试验结果表明，本发明制备方法在有效维持组织胞外基质的微观结构和蛋白活性的基础上，有效去除细胞成分，移植后无明显免疫排斥反应，同时具有材料来源广泛、易得，价格低廉的优点。
附图说明
图1本发明提供的小肠黏膜下层组织裁剪时中线示意图；
图2为本发明实施例1提供的显微观察结果图；
图3为本发明实施例1提供的不同部位软组织修复材料的扫描电子显微镜照片结果图；
图4为本发明实施例1提供的猪小肠黏膜下层组织DNA含量和脱细胞处理后猪小肠黏膜下层组织中的DNA含量对比图；
图5为本发明实施例2提供的四只新西兰大白兔用软组织修复材料修复结膜缺损一周后的照片。
具体实施方式
本发明提供了一种软组织修复材料的制备方法，包括以下步骤：
1)去除掉哺乳动物小肠组织上的小肠黏膜、肌层和浆膜，得到小肠黏膜下层组织，用含抗生素的无菌缓冲液冲洗3～5次，得到冲洗后的小肠黏膜下层组织；
2)将步骤1)得到的冲洗后的小肠黏膜下层组织裁剪为不长于5cm的段，沿中线剖开、展平，浸泡于无菌缓冲液中，得到前处理小肠黏膜下层组织；
3)将步骤2)得到的前处理小肠黏膜下层组织置于含质量百分含量为0.2～1％表面活性剂和200～600U/mL核酸酶的无菌缓冲液中，37℃振荡处理1～4h，得到脱细胞小肠黏膜下层组织；
所述表面活性剂包括氨基酸表面活性剂或生物表面活性剂；
4)将步骤3)得到的脱细胞小肠黏膜下层组织置于无菌缓冲液中，振荡清洗6～8次，每次5～10min，将清洗后的小肠黏膜下层组织切割，留取中央基质膜，干燥，得到干燥后的中央基质膜；
5)将所述干燥后的中央基质膜辐照灭菌，得到软组织修复材料。
本发明制备过程优选在无菌环境下进行，更优选在无菌超净工作台中进行。本发明去除掉哺乳动物小肠组织上的小肠黏膜、肌层和浆膜，得到小肠黏膜下层组织，用含抗生素的无菌缓冲液冲洗3～5次，得到冲洗后的小肠黏膜下层组织。本发明对去除的方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员处理小肠常规方法即可。本发明对所述小肠组织的来源没有特殊的限定，采用常规市售小肠组织即可，所述小肠组织优选为健康的、新鲜的、无病毒感染的、无病史的哺乳动物小肠组织。在本发明中，所述小肠组织优选包括猪小肠组织。在本发明中，所述无菌缓冲液包括PBS缓冲液、D-Hanks缓冲液或Tris-HCl缓冲液，当所述无菌缓冲液为Tris-HCl缓冲液时，所述Tris-HCl缓冲液的pH值优选为7.4。本发明对所述PBS缓冲液、D-Hanks缓冲液和Tris-HCl缓冲液的制备方法没有特殊的限定，采用本领域技术人员熟知的常规PBS缓冲液、D-Hanks缓冲液或Tris-HCl缓冲液缓冲液配制方法即可。在本发明中，所述抗生素包括庆大霉素、青链霉素或妥布霉素。在本发明中，当所述抗生素为庆大霉素或青链霉素时，所述抗生素的浓度优选独立地为50～100ug/mL；当所述抗生素为妥布霉素时，所述妥布霉素的浓度优选为100～200U/mL。在本发明中，所述抗生素的使用能够预防在脱细胞过程中，细菌的感染，造成抗原物质的积累。在本发明中，所述冲洗的次数优选为4次。
得到冲洗后的小肠黏膜下层组织后，本发明将冲洗后的小肠黏膜下层组织裁剪为不长于5cm的段，沿中线剖开、展平，浸泡于无菌缓冲液中，得到前处理小肠黏膜下层组织。在本发明中，优选将冲洗后的小肠黏膜下层组织裁剪为4～5cm的段，更优选为5cm。小肠黏膜下层组织裁剪后为柱形中空桶装结构，沿垂直方向的中线(中线：与柱形中空桶状底面相垂直的任意一条线，如图1所示)剪开后，可将其展开，提高脱细胞效率，以及方便后续的剪裁。剪开后优选留取全部组织。在本发明中，所述前处理小肠黏膜下层组织优选为5×5cm的正方形，相比整块小肠黏膜组织面积更小，可提高后续脱细胞过程的效率，缩短脱细胞时间，以及方便后续的剪裁。
得到前处理小肠黏膜下层组织后，本发明将前处理小肠黏膜下层组织置于含质量百分含量为0.2～1％表面活性剂和200～600U/mL核酸酶的无菌缓冲液中，37℃振荡处理1～4h，得到脱细胞小肠黏膜下层组织；所述表面活性剂包括生物表面活性剂。在本发明中，所述所述生物表面活性剂包括氨基酸表面活性剂或槐糖脂，所述氨基酸表面活性剂包括月桂酸肌氨酸或椰油酰谷氨酸钠盐。本发明对所述表面活性剂的来源没有特殊的限定，采用常规市售表面活性剂即可。在本发明中，所述表面活性剂的使用浓度更优选为0.5～0.8％。本发明所选的表面活性剂与常规脱细胞所选用的离子型表面活性剂和非离子型表面活性剂相比，具有可降解，无生物毒性，脱细胞温和的优点。本发明选用的表面活性剂有效避免了由于脱细胞试剂残留可能带来的安全风险，此外所述表面活性剂在保证达到优良脱细胞效果的基础上，对细胞外基质微观结构破坏小，为移植后体内细胞的再生提供更加接近于体内的微环境。在本发明中，所述核酸酶包括核糖核酸酶和脱氧核糖核酸酶或全能核酸酶。本发明在脱细胞液中添加核酸酶，具有效率高，处理时间短的优点，可以有效去除脱细胞材料的核酸，明显降低脱细胞材料的免疫原性。本发明所述核酸酶采用符合医药类产品技术要求的商业来源的核酸酶即可。在本发明中，所述核酸酶的浓度优选为400U/mL。在本发明中，所述振荡处理的时间优选为2h。
得到脱细胞小肠黏膜下层组织后，本发明将脱细胞小肠黏膜下层组织置于无菌缓冲液中，振荡清洗6～8次，每次5～10min，将清洗后的小肠黏膜下层组织切割，留取中央基质膜，干燥，得到干燥后的中央基质膜。在本发明中，所述切割优选为沿自然脉络纹理进行切割，所述自然脉络纹理包括可见血管网络、淋巴管网络和神经网络。细胞结构主要集中于自然脉络纹理区域，本发明沿自然脉络纹理切割，可最大限度的避开细胞碎片集中区域，留取中央细胞外基质，从而最大限度的减少潜在的细胞碎片，降低脱细胞材料的免疫原性，提高材料的生物相容性。在本发明中，所述干燥优选为自然风干和冷冻干燥。在本发明中，所述自然风干优选为室温风干2～3小时；所述冷冻干燥优选为真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥的条件优选为：冷却到-40～-50℃在2～7Pa大气压下保持15～30min。
得到干燥后的中央基质膜后，本发明将所述干燥后的中央基质膜辐照灭菌，得到软组织修复材料。在本发明中，优选采用18～25kGy的辐照剂量对软组织修复材料进行辐照灭菌。在该辐照剂量下可以保证脱细胞材料保留良好生物活性的前体下，达到最佳的灭菌效果。
本发明还提供了基于上述技术方案所述制备方法得到的软组织修复材料。本发明所述软组织修复材料安全有效、具有良好生物活性和生物相容性。
本发明还提供了上述技术方案所述软组织修复材料作为原材料或组成部分，在制备药品或医疗器械中的应用。
本发明还提供了上述技术方案所述软组织修复材料在制备非角化的上皮和内皮损伤或缺失后替代品中的应用。例如软组织修复材料可用于制备材料以替代眼表结膜，修复结膜缺损造成的睑球粘连或修复肠粘膜的溃疡等内皮的损伤和缺失。
本发明还提供了上述技术方案所述软组织修复材料在体外3D细胞培养和构建研究模型中的应用。本发明所述软组织修复材料可为体外培养的细胞提供近似于体内的物理和生物学环境，使体外细胞特征更加接近于体内，可作为基础医学良好的研究模型。
下面结合具体实施例对本发明所述的一种软组织修复材料及其制备方法做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
实施例1
(1)选取健康的猪的小肠组织，去除小肠黏膜、肌层和浆膜，用含有100ug/ml青链霉素的无菌缓冲液反复冲洗3次；
(2)将小肠黏膜下层组织裁剪为5cm的小段，并沿中线从中间将其刨开，浸泡于250ml的无菌缓冲液中；
(3)将小肠黏膜下层组织置于含有椰油酰谷氨酸钠盐(1％)和核酸酶(200U/ml)的无菌缓冲液中，在37℃震荡处理2小时；
(4)将小肠黏膜下层组织置于无菌缓冲溶液中，震荡清洗10分钟，重复清洗6次。
(5)将清洗后的小肠黏膜下层组织在无菌不锈钢板上展品，沿自然脉络纹理将其分割为小片，留取中央基质膜部分。
(6)小肠黏膜下层组织在超净工作台中自然风干，并密封双层包装。
(7)在25kGY的伽马射线下辐照灭菌，得到软组织修复材料。
结果评价
1、微观结构观察：制备的软组织修复材料放入1.5mL干净离心管中，加入OCT包埋剂没过组织；放置于冰冻切片机的托物台上，-20℃待冷冻成白色模块；切成4～8μm的薄片，切好的切片，用冷的丙酮固定30分钟；用PBS缓冲液清洗2次，5分钟/次；在组织切片上滴加荧光探针DIOC6(3)，染色30min，用PBS缓冲液清洗2次；滴加40ul含DAPI的放荧光淬灭封片剂，避光保存；倒置荧光显微镜观察拍照。显微观察结果图如图2所示，如图2a为小肠黏膜下层组织切片荧光染色结果，可见小肠黏膜细胞和细胞核的染色。而在软组织修复材料(图2b)中只有细胞外基质的染色，并且胞外基质结构没有明显的变化。证明了软组织修复材料中的小肠黏膜下层细胞被有效去除，并且保存了原有细胞外基质结构的完整性。
2、软组织修复材料中DNA含量检测：将待测组织磨碎后，用GeneJET Genomic DNAPurification Kit(Thermo Scientific)裂解消化提取DNA，并用Quant-iT PicoGreendsDNA Assay Kit(invitrogen)测定DNA含量，并与新鲜的肠粘膜下层组织的DNA含量进行对比，结果如图3所示，新鲜的肠粘膜下层组织DNA含量平均为459.03ng/mg，而脱去细胞后的软组织修复材料平均DNA含量为7.69ng/mg，可见用本发明方法制得的软组织修复材料成功去除了绝大部分核酸残留。
3、软组织修复材料超显微结构观察：将新鲜软组织修复材料用临界点干燥仪干燥，镀金，扫描电子显微镜观察，拍摄电子显微镜照片，猪小肠黏膜下层组织DNA含量和脱细胞处理后猪小肠黏膜下层组织中的DNA含量对比图如图4所示，其中图4a为软组织修复材料纵切面的扫描电子显微镜照片，图4b为软组织修复材料横切面的扫描电子显微镜照片。在电子显微镜照片中没有观察到可见的细胞碎片，胶原纤维等细胞外基质蛋白排列紧密有序。证明了本发明方法制备的软组织修复材料，可去除小肠黏膜的原有细胞，并且完好地保留细胞外基质的纤维结构。
实施例2
(1)选取3～3.5KG的健康雄性新西兰大白兔4只，在每只兔子的右眼眼表制造2×2cm的结膜缺损；
(2)将软组织修复材料用生理盐水复水1～2分钟；
(3)在手术显微镜下将其裁剪为同眼表缺损相同大小的补片，手术缝合在结膜缺损部位。
(4)每日滴加地塞米松眼药膏两次；
(5)一周之后拆线，检测结膜缺损修复情况和炎症反应程度，并滴加荧光素钠检测上皮生长情况。
结果评价
四只新西兰大白兔用软组织修复材料修复结膜缺损一周后的照片如图5所示，其中，图5a、5b、5c、5d互为平行对照，分别是四只不同兔眼结膜缺损用软组织修复材料修复后的照片。四个眼睛移植软组织修复材料一周后，该材料表现出了良好的生物相容性，没有发生明显的溶解和脱落的现象。此外，较轻的免疫排斥反应也被观察到，四只眼睛的表面都没有发生明显的红肿和粘性分泌物。通过荧光素钠染色，生理盐水冲洗后，没有发生明显着色，证明软组织修复材料移植一周后结膜上皮已经完全再生。因此，通过动物实验证明了软组织修复具有优良组织工程材料的特性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种软组织修复材料的制备方法，包括以下步骤：
1)去除掉哺乳动物小肠组织上的小肠黏膜、肌层和浆膜，得到小肠黏膜下层组织，用含抗生素的无菌缓冲液冲洗3～5次，得到冲洗后的小肠黏膜下层组织；
2)将步骤1)得到的冲洗后的小肠黏膜下层组织裁剪为不长于5cm的段，沿中线剖开、展平，浸泡于无菌缓冲液中，得到前处理小肠黏膜下层组织；
3)将步骤2)得到的前处理小肠黏膜下层组织置于含质量百分含量为0.2～1％表面活性剂和200～600U/mL核酸酶的无菌缓冲液中，37℃振荡处理1～4h，得到脱细胞小肠黏膜下层组织；
所述表面活性剂包括生物表面活性剂；
4)将步骤3)得到的脱细胞小肠黏膜下层组织置于无菌缓冲液中，振荡清洗6～8次，每次5～10min，将清洗后的脱细胞小肠黏膜下层组织切割，留取中央基质膜，干燥，得到干燥后的中央基质膜；
5)将所述干燥后的中央基质膜辐照灭菌，得到软组织修复材料。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述小肠组织包括猪小肠组织。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述无菌缓冲液包括PBS缓冲液、D-Hanks缓冲液或Tris-HCl缓冲液。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述抗生素包括庆大霉素、青链霉素或妥布霉素。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)所述生物表面活性剂包括氨基酸表面活性剂或槐糖脂，所述氨基酸表面活性剂包括月桂酸肌氨酸或椰油酰谷氨酸钠盐。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)所述切割为沿自然脉络纹理进行切割，所述自然脉络纹理包括可见血管网络、淋巴管网络和神经网络。
7.基于权利要求1～6任一项所述制备方法得到的软组织修复材料。
8.权利要求7所述软组织修复材料作为原材料或组成部分，在制备药品或医疗器械中的应用。
9.权利要求7所述软组织修复材料在制备非角化的上皮和内皮损伤或缺失后替代品中的应用。
10.权利要求7所述软组织修复材料在体外3D细胞培养和构建研究模型中的应用。
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