TWI533860B - 細胞移除後生物結構 - Google Patents
細胞移除後生物結構 Download PDFInfo
- Publication number
- TWI533860B TWI533860B TW101150482A TW101150482A TWI533860B TW I533860 B TWI533860 B TW I533860B TW 101150482 A TW101150482 A TW 101150482A TW 101150482 A TW101150482 A TW 101150482A TW I533860 B TWI533860 B TW I533860B
- Authority
- TW
- Taiwan
- Prior art keywords
- decellularized
- membrane structure
- tissue layer
- structure according
- small intestinal
- Prior art date
Links
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Description
本發明係關於一種用於組織修補用之植入物,特別係一包含有奈米級細胞間質纖維於其中之去細胞之組織層膜結構且該膜結構於冷凍乾燥後之奈米細胞間質纖維的寬度係界於50nm~500nm。
製作去細胞化組織間質之技術係於1980年代初期發源於Purdue University,至今已分別有就各不同組織為去細胞化處理之技術為揭露,例如自豬隻小腸
之submucosa組織(US Pat.Nos.6206931、6358284、7652077、8007542)、自豬隻小腸之黏膜下層(tunica submucosa)(如US Pat.No.7713552)、腎囊膜(renal capsule)(如US Pat.Nos.7087089及7745217)以及尿道(如US Pat.No.7699895)製作去細胞化基質之技術等。此外,基於去細胞化小腸黏膜下層技術更亦衍生出一系列具瓣膜通道的植入物或支架之複合結構等導管或支架技術(如US Pat.Nos.6200336、6508833、7452371、7503928、7550004、7815923、7887576、7914567等);US Pat.Nos.4902290、5955110、5922028、6986735以及7959554等專利亦揭露有透過壓合或塗覆等其他方式將複數個去細胞化組織間質膜製作成多層式基材之概念,而US Pat.No.8021692則係一可注射式基材之製作技術。在此類去細胞化組織間質膜的製作流程、配方與系統方面,現今一般已有以反覆冷凍乾燥、酵素處理、鹼性溶液浸潤、變性或非變性有機溶劑以及(或)在溶液張力或壓力差下灌流等方法實施。
前開技術所採之溶劑多為強效界面活性劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)者,惟以該SDS做為界面活性劑之去細胞洗劑,一般必須面臨SDS對組織成份之不
利效果以及殘留SDS之細胞毒性的問題。目前已知SDS會抑制細胞之增生與接合附著,此於上皮細胞、纖維母細胞或心肌纖維母細胞在去細胞化組織間質為播植(seeding)時可以發現。另外,SDS對蛋白質本身係有很強的致變性力,目前已觀察到1%的SDS洗劑會造成去細胞化組織間質內之膠原蛋白其三股螺旋結構不穩且實質改變了elastin網絡,更甚者,SDS還會使得去細胞化組織間質中之葡萄醣胺含量大幅降低致使膠原蛋白發生纏捲的程度與頻度上升而易受蛋白質脢之降解攻擊;總括言之,殘留SDS本身之毒性與致過敏性,以及受SDS處理後導致結構與物化性質改變之組織基質皆對細胞的移附殖生上,有相當不利的影響。然而,在處理細胞洗劑選用問題的考量上,如改採溫和之界面活性劑時仍還需兼顧到具有良好脫除細胞效能與能有效避免DNA殘留此等要求之滿足。
本發明係一以較溫和之界面活性劑為主要作用成分的去細胞洗劑所製作出之去細胞化組織基質膜結構,且係一保持低DNA殘留程度之具奈米級組織纖維的去細胞化組織基質膜。前開溫和界面活性劑係指
烷基聚葡萄糖苷(alkyl polyglucoside,APG)而去細胞洗劑則係該烷基聚葡萄糖苷之水溶液。此製程之界面活性劑其本身毒性以及對組織基質成分的影響都較SDS為低,而所製得之去細胞化組織基質膜的DNA殘留狀態在DAPI下仍維持在無細胞核之點狀訊號表現的程度。本發明之去細胞化組織基質膜能維持極為完整之微結構,其在去細胞化後所到得的組織基質膜經過冷凍乾燥後,仍保留了寬度界於50nm~500nm奈米級之細胞間質纖維於其中;此外,本發明之去細胞化組織基質膜還進一步以人工方式覆蓋有一膠原蛋白或其衍生物之膜層,藉此更可提升其表面對細胞移入、附著與增生的效果。
組織或器官工程是在取得性低、免疫排斥顧慮高及需免疫抑制劑之器官移植外的有效醫療替換選項之一,惟組織或器官工程在生體材料與人工或天然材料的技術脈絡上各有所擅長與不足之處,例如人工材料在功能與生物相容性上不足的問題,人工或天然材料在材料特性與細微仿生結構製作困難所導致的功能與持久性不足的問題,而天然材料在規格、製作與汙染上亦有所限制的問題;本發明不同於傳統的結
構性蛋白純化及再塑型技術,而以活體組織進行細胞溶解及界面處理,並於除去活體細胞及殘留抗原後,再結合到膠原蛋白技術,並一併對膠原蛋白之端肽(telo-peptide)部位實施交聯處理以及運用蛋白質清洗技術,最終製得一兼具能保有原本生體組織之結構與特性,以及能解決去細胞化組織中結構蛋白的表面抗原問題之膜結構。此外,先前技術多半會破壞或擾亂原有的細胞外基質纖維結構並有去氧核醣核酸及細胞碎屑殘留,此往往導致接受植入物的個體發生嚴重不良反應,反觀此技術所製得之產品,於電子顯微鏡底下進行觀測時,仍能保有組織原始之完美架構,並且在拉壓力試驗下比單純以純化後膠原蛋白製成之膜還具有更接近該組織原有之韌性及強度的特性(見圖二中純化後膠原蛋白製成之膜(2曲線)以及本發明之去細胞組織層膜結構(1曲線)之差異);此外,以L929纖維母細胞共同培養時,可觀察到細胞整體型態完整、無空泡化細胞、也幾乎沒有貼附分離、細胞凋亡的情形;生物負荷量也極低,可以減少滅菌的照射劑量及熱源殘留的機率,並在DAPI及即時聚合酶連鎖反應檢測中顯示出絕大部分的去氧核醣核酸已獲清除。
本發明中用於製作去細胞組織層之膜結構的活體組織係指哺乳類之小腸黏膜下層及哺乳類之小腸黏膜外層;一實施例中係以哺乳類之豬小腸黏膜下層及外層,惟仍不限其他牛馬羊等或者靈長類、人類等哺乳類者皆可運用於本技術範圍內。本發明下前開小腸黏膜下層及外層,如以習知之公開資料如US Pat.No.4902508者之圖示為例,係分別指前開圖示內之D、E及F以及A、B及C,而G則為小腸黏膜上層。
首先就取得之哺乳類小腸充分清理以清除殘留食麋與其他雜汙,前開清理不限於以物理方式刮剃、液體或空氣衝壓、灌流等方式單獨或合併為之,以達組織中之脂肪塊或血汙等雜質的盡量去除。之後分別取下小腸黏膜下層及外層,各就其上、下兩面分別以去細胞洗劑(活性物比例為重量百分比10%之烷基聚葡萄糖苷水溶液)搓洗至少10~30分鐘以上。
本發明下之前開去細胞洗劑除指上開實施例中之濃度者外,另可為活性物重量百分比界於1~53%之烷基聚葡萄糖苷(alkyl polyglucoside,APG)水溶液,其中,一實施例係以活性物重量百分比為1%之烷基聚葡萄糖苷水溶液,另一實施例係以活性物重量百分比為5%之烷基聚葡萄糖苷水溶液,此外,尚有實
施例係以活性物重量百分比為50~53%之烷基聚葡萄糖苷水溶液者,此皆有有效去除細胞之效果。前開之非離子界面活性劑-烷基聚葡萄糖苷係指月桂基葡萄糖苷(Lauryl Glucoside、INCI NAME:Lauryl Glucoside),其碳鏈分布(C-chain distribution)為C12~16,葡萄糖聚合度為1.4或一般市售之界於1.4~2.0者。小腸黏膜下層及外層經前開去細胞洗劑充分清洗至呈現半透狀,再以超純水清洗數次後,置於pH 8之環境下以0.05% Trypsin及0.05% EDTA或0.25% Trypsin及0.05% EDTA之酵素水溶液中處理12至24小時。隨後在4℃下以異丙醇水(異丙醇對水體積比為1:4)攪動清洗後,以緩衝鹽類調整pH至7.4左右,再以超純水或生理食鹽水反覆清洗多次即可置入-80℃冰箱中進行急速冷凍再於冷凍乾燥機中進行冷凍乾燥。
前開完成冷凍乾燥後之去細胞化之小腸黏膜下層或外層,可另以複數個去細胞化基質片層予以疊放後,經過壓力及熱交聯等等方式拼接,此特別於尺寸較小亦較脆弱之去細胞化小腸黏膜外層在製作時更能符合實際厚度與強度的需求。
冷凍乾燥後單獨或拼接出之去細胞化小腸黏膜
下層或外層於取出後,可以再以膠原蛋白對水之重量百分比為1%之膠原蛋白液灌流(管狀之小腸黏膜下層)或覆蓋於小腸黏膜下層或外層,之後放入-80℃冰箱進行急速冷凍再至冷凍乾燥機中進行冷凍乾燥,直到真空度小於20m Torr。前開製作膠原蛋白人工層時,1%之膠原蛋白與水之混合物中尚另可含有其他成分例如葡萄醣胺(HA、chondroitin、keratin...)、biodegradable polymer(PGA、PLA、PLGA、PDO...)、bone grafting(calcium sulphate、hydroxyapatite,beta-tricalcium phosphate、demineralized bone matrix...)、cytokine或growth factor等蛋白質(EGF、IGF、PRP、Amelogenin...),或幾丁質等其他成份之物質,該等物質對膠原蛋白之重量比例係低於15:85。前開製作膠原蛋白人工層中之膠原蛋白或膠原蛋白之衍生物,其包含膠原蛋白粗纖維、中性鹽可溶膠原蛋白、鹼可溶膠原蛋白、酸可溶膠原蛋白、去端肽膠原蛋白、發酵或生物科技重組之膠原蛋白、水解膠原蛋白、明膠、或有膠原蛋白特殊排列方式之G-X-Y(X、Y分別為proline及hydroxyproline)之小分子胜肽。
前開去細胞化之小腸黏膜下層或外層,或者一已以人工方式複合以膠原蛋白層之小腸黏膜下層或外層,需在冷凍乾燥機中以冷凍乾燥機腔體條件控制
在50Torr以下且溫度為攝氏105度之狀態下,進行24小時真空脫水熱交聯。隨後再以4510μW/cm2以上的光照強度,以每面至少1小時以上之方式持續進行紫外光交聯。此時,去細胞化小腸黏膜下層或外層中膠原蛋白之端肽(telo-peptide)部位亦因交聯作用而降低其抗原性,另外,此一經熱及紫外光交聯後之去細胞化小腸黏膜下層或外層尚可運用其他化學交聯劑進行更進一步更牢固的交聯。
前開化學交聯劑得為醛(aldehyde)類交聯劑,如formaldehyde或glutaraldehyde(GTA);Isocyanates類交聯劑,如Hexamethylene diisocyanate(HMDI);Acyl azide類交聯劑之diphenylphosphorylazide、dimethylformamide;Epoxides類交聯劑之ethylene glycol diglycidyl ether;Quinones類交聯劑之nordihydroguaiaretic acid、Carbohydrate類交聯劑之D-glucose或D-ribose;Catechin(Polyphenol)類交聯劑之epicatechin gallate或epigallocatechin gallate;Iridoid glycosides類交聯劑之Genipin;dimethyl suberimidate;dimethyl 3,30-dithiobispropionimidate或microbial transglutaminase等。本發明下一實施例則係使用carbodiimide類之化學交聯劑,其係將熱
交聯後之膜結構完全浸潤於14mM 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride與5.5mM N-hydroxy-succinimide溶液中2小時後,再以一般習知之方式例如利用胺基酸或含蛋白質之溶液洗除未反應的交聯劑,復經冷凍乾燥後即可製得本發明中去細胞組織層之膜結構。上開所示各化學交聯劑其操作、詳細參數與其終止、清洗等實施方法俱為熟習該技術領域人士所已知,並可運用於本發明中。
本發明中所有去細胞、脫除細胞應理解為一組織樣本其經處理後當使用習知之組織學(例如電子或光學顯微鏡法)評估時,該組織樣本其原本之組織細胞至少有95%至100%已不存在。
詳細參考本揭示內容之某些例示性實施例於圖式中繪示特定實施例。第一圖為一複合有一膠原蛋白人工層(103)之去細胞組織層(101)之膜結構,其中去細胞組織層(101)內具有奈米級細胞間質纖維(102),依據去細胞組織層膜結構之SEM電顯圖(第三圖)計算,其中奈米級細胞間質纖維(102)之寬度係界於50nm~500nm。第二圖則為去細胞組織層膜結構之拉伸強度應力分析的測試結果與純化後膠原蛋白製成
之膜做比較。
將L929細胞與去細胞化小腸黏膜下層或其萃取物共同培養,在5% CO2的培養箱條件下,以37±2℃進行培養;經試驗前後觀察細胞試驗前後的整體型態、空泡化程度、貼附分離情形、細胞凋亡及膜的完整性之結果顯示,本發明膜結構不論以萃取及共同培養試驗下其細胞毒性的判定皆為0等級。
將本發明膜結構固定後,於室溫下將其完全浸潤在DAPI工作溶液五分鐘(1μg/ml)後,以PBS緩衝液充分洗去游離之DAPI分子,以螢光顯微鏡確認去本發明膜結構之螢光染色結果為無細胞核之點狀訊號螢光表現。此外另取本發明膜結構進行RT-PCR,確認無動物源及豬來源DNA訊號殘留。
裁切20mm X 30mm大小之去細胞組織層之膜結構,經材料特性測試後,其尺寸應變值可藉由拉伸超過五倍以上,最大應力可超過350g(圖二曲線1),
此相較於圖二曲線2所表示相同尺寸之純化後膠原蛋白製成之膜,本發明之去細胞組織層膜結構顯較其接近於原組織具有之應力性質。
本發明中引用之所有文件或部分文件包含(但不限於)專利、專利申請案、文章、書及專著,其等之全文以參考方式明白地併入本發明中用於任何目的。
上述敘述係為本發明之較佳實施例。此領域之技藝者應得以領會其係用以說明本發明而非用以限定本發明所主張之專利權利範圍。其專利保護範圍當視後附之申請專利範圍及其等同領域而定。凡熟悉此領域之技藝者,在不脫離本發明精神或範圍內,所作之更動或潤飾,均屬於本發明所揭示精神下所完成之等效改變或設計,且應包含在下述之申請專利範圍內。
101‧‧‧去細胞組織層
102‧‧‧奈米級細胞間質纖維
103‧‧‧膠原蛋白人工層
1‧‧‧為曲線1表去細胞組織層膜結構之拉伸強度應力分析測試結果
2‧‧‧為曲線2表純化後膠原蛋白製成之膜之拉伸強度應力分析測試結果
第一圖為一複合有一膠原蛋白人工層之去細胞組織層之膜結構。
第二圖為去細胞組織層之膜結構其拉伸強度之應力
分析的測試結果。
第三圖為去細胞組織層之膜結構其SEM電顯圖及奈米纖維結構。
102‧‧‧細胞間質纖維
Claims (20)
- 一種包含有一去細胞組織層之膜結構,其中該去細胞組織層係以酵素分解及烷基聚葡萄糖苷水溶液處理後製得而含有奈米級之細胞間質纖維結構,該奈米級細胞間質纖維其寬度於冷凍乾燥後係界於50nm~500nm,且該膜結構之最大應力係大於或等於350克。
- 如申請專利範圍第1項所述之膜結構,其中該去細胞組織層進一步受一人工層所覆蓋,且該人工層係包含重量百分比15%~100%之膠原蛋白或膠原蛋白衍生物。
- 如申請專利範圍第1項所述之膜結構,其中該烷基聚葡萄糖苷水溶液係活性物重量百分比為1~53%之月桂基葡萄糖苷水溶液。
- 如申請專利範圍第2項所述之膜結構,其中該烷基聚葡萄糖苷水溶液係活性物重量百分比為1~53%之月桂基葡萄糖苷水溶液。
- 如申請專利範圍第1項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指去細胞化之哺乳類小腸黏膜下 層。
- 如申請專利範圍第5項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指係以數片該去細胞化後之哺乳類小腸黏膜下層經加壓及熱交聯法拼接而得。
- 如申請專利範圍第1項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指去細胞化之哺乳類小腸黏膜外層。
- 如申請專利範圍第7項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指係以數片該去細胞化後之哺乳類小腸黏膜外層經加壓及熱交聯法拼接而得。
- 如申請專利範圍第2項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指去細胞化之哺乳類小腸黏膜下層。
- 如申請專利範圍第9項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指係以數片該去細胞化後之哺乳類小腸黏膜下層經加壓及熱交聯法拼接而得。
- 如申請專利範圍第2項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指去細胞化之哺乳類小腸黏膜 外層。
- 如申請專利範圍第11項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指係以數片該去細胞化後之哺乳類小腸黏膜外層經加壓及熱交聯法拼接而得。
- 如申請專利範圍第3項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指去細胞化之哺乳類小腸黏膜下層。
- 如申請專利範圍第13項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指係以數片該去細胞化後之哺乳類小腸黏膜下層經加壓及熱交聯法拼接而得。
- 如申請專利範圍第3項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指去細胞化之哺乳類小腸黏膜外層。
- 如申請專利範圍第15項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指係以數片該去細胞化後之哺乳類小腸黏膜外層經加壓及熱交聯法拼接而得。
- 如申請專利範圍第4項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指去細胞化之哺乳類小腸黏膜下層。
- 如申請專利範圍第17項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指係以數片該去細胞化後之哺乳類小腸黏膜下層經加壓及熱交聯法拼接而得。
- 如申請專利範圍第4項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指去細胞化之哺乳類小腸黏膜外層。
- 如申請專利範圍第19項所述之膜結構,其中該去細胞組織層係指係以數片該去細胞化後之哺乳類小腸黏膜外層經加壓及熱交聯法拼接而得。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TW101150482A TWI533860B (zh) | 2012-12-27 | 2012-12-27 | 細胞移除後生物結構 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
TW101150482A TWI533860B (zh) | 2012-12-27 | 2012-12-27 | 細胞移除後生物結構 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
TW201424707A TW201424707A (zh) | 2014-07-01 |
TWI533860B true TWI533860B (zh) | 2016-05-21 |
Family
ID=51725039
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
TW101150482A TWI533860B (zh) | 2012-12-27 | 2012-12-27 | 細胞移除後生物結構 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
TW (1) | TWI533860B (zh) |
-
2012
- 2012-12-27 TW TW101150482A patent/TWI533860B/zh active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
TW201424707A (zh) | 2014-07-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP2229191B1 (en) | Decellularized omentum matrix and uses thereof | |
US9636435B2 (en) | Method for shaping tissue matrices | |
EP3040088B1 (en) | Method for preparing an animal decellularized tissue matrix material and a decellularized tissue matrix material prepared thereby | |
AU2012262311B2 (en) | Adipose tissue matrices | |
US6734018B2 (en) | Process for decellularizing soft-tissue engineered medical implants, and decellularized soft-tissue medical implants produced | |
US10736990B2 (en) | Collagen and micronized placental tissue compositions and methods of making and using the same | |
US8518436B2 (en) | Engineered extracellular matrices | |
CN103536967A (zh) | 一种制备细胞外基质支架材料的脱细胞方法 | |
Inci et al. | Decellularized inner body membranes for tissue engineering: A review | |
KR20170128385A (ko) | 탈세포화 조직을 사용한 유착 방지재 및 대용 생체막 | |
CN113301928B (zh) | 生物支架和用于制备其的方法 | |
Patnaik et al. | Chapter 3: Decellularized scaffolds: concepts, methodologies, and applications in cardiac tissue engineering and whole-organ regeneration | |
WO2006137546A1 (ja) | 生体由来移植用組織の石灰化を抑制するための処理方法および処理された組織 | |
Qi et al. | A novel crosslinking method for improving the anti-calcification ability and extracellular matrix stability in transcatheter heart valves | |
CN115154668A (zh) | 用于组织产物的酶处理的方法 | |
Kumar et al. | Extraction techniques for the decellularization of rat dermal constructs | |
TWI533860B (zh) | 細胞移除後生物結構 | |
Kumaresan et al. | Development of Human Umbilical cord based scaffold for tissue engineering application | |
JP3686068B2 (ja) | 皮膚の分離無細胞化方法、無細胞化真皮マトリックス及びその製造方法並びに無細胞化真皮マトリックスを用いた複合培養皮膚 | |
Muthusamy et al. | Collagen-based strategies in wound healing and skin tissue engineering | |
Freytes et al. | Biomaterial scaffolds for cardiac regeneration and repair derived from native heart matrix | |
Ahearne | Production of Decellularized Tissue-Derived Materials | |
Macagonova et al. | The effectiveness of the tissue engineering in the obtaining of the biological materials from the extracellular matrix | |
Wu et al. | Biological-Derived Biomaterials for Stem Cell Culture and Differentiation | |
Chen | Study of decellularization methods and characterization of porcine esophagus |