JP5763790B2 - 哺乳類の軟骨組織由来の生体移植材 - Google Patents

Description

本発明は、哺乳類の軟骨組織由来の生体移植材に関する。

損傷した軟骨の治療または美容外科分野における軟骨の移植は、広く用いられている。特に、鼻の美容整形がますます活性化されることにつれ、隆鼻術も増加している。ここには、数十年の間に自家軟骨を始めとした多種の移植物が用いられてきた。その中、ゴアテックス（Ｇｏｒｅ−ｔｅｘ）やシリコンのような異物の移植片は扱いやすく、手術時間が低減され、また供与部の罹患率をなくす利点がある。異種の物質を用いた関連分野の先行文献としては、特許文献１（人工軟骨代替物）及び特許文献２（関節軟骨再生用支持体及びその製造方法）がある。

しかし、長期間の追跡観察によれば、異物感、感染、痛症、移植物の脱出及び可動性などの副作用が報告されている。また、自家移植物は完璧な生体適合性により副作用が発生しにくくなり、良好な手術結果が得られるにもかかわらず、供与部の罹患率の増加、患者選択の制限性、手術時間の延長、多量の採取などが制限事項として指摘されつつある。

上記のような自家軟骨の問題点を解決する代案として、不足時に同種（ａｌｌｏｇｒａｆｔ）や異種の動物（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）から軟骨組織を供給する方法がある。この場合、移植材とともにウイルスなどが転移する危険性があるとのことが最も大きい制約であるが、現在、全世界の組織銀行（Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋ）では、供与者に対するウイルス感染可否の選別検査後に、感染されていない選択された組織のみを加工処理する工程により、それを解決している。このような同種の軟骨移植材は、１９７２年から整形外科、美容外科、眼科、婦人科及び泌尿器科の手術に使用されており、異物の移植片と異なって鼻尖手術のための別途の自家軟骨の採取が不要であるということが最大の利点である。

しかし、人体の軟骨組織を用いるので多量の供給が困難であり、同種間の移植であるため病原体の転移による危険性が常に存在すること、そして移植のために製造された最終製品の価格が非常に高価であることが短所として指摘されている。

韓国公開特許２０１１−００１２８０７号公報 韓国公開特許２０１１−００９７６６２号公報

このような技術的背景から本発明者らは、移植時に副作用の発生が極めて低くかつ収得が容易であり、費用が安価である生体移植材を開発するために鋭意研究を重ねた結果、本発明を完成するに至った。

本発明の目的は、哺乳類由来の生体移植材の製造方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、上記方法により製造された生体移植材を提供することにある。

本発明の一側面によれば、哺乳類の軟骨組織を用意する工程と、上記用意した軟骨組織を塩化ナトリウム高張液で処理する工程と、上記高張液で処理した軟骨組織をウイルス不活化溶液で処理する工程と、上記ウイルス不活化溶液で処理した軟骨組織をアルカリ溶液で処理する工程と、上記アルカリ溶液で処理した軟骨組織を脱水処理または冷凍処理する工程と、上記脱水処理または冷凍処理した軟骨組織にガンマ線を照射する工程と、を含む軟骨移植材の製造方法が提供される。

一実施例によれば、上記哺乳類は、豚、人、馬、牛、犬、鼠からなる群より選択される１種以上であることができる。

一実施例によれば、上記軟骨組織は、硝子軟骨、弾性軟骨及び繊維軟骨からなる群より選択される１種以上であることができる。

一実施例によれば、上記哺乳類の軟骨組織を用意する工程は、採取した軟骨組織を、［アセトンまたはメタノール］：クロロホルム＝１：１（ｖ／ｖ）の割合で混合した溶液に４８時間浸漬して脱脂する工程をさらに含むことができる。

一実施例によれば、上記哺乳類の軟骨組織は、豚の軟骨組織であってもよい。

一実施例によれば、上記豚の軟骨組織は、耳介軟骨組織または肋軟骨組織であってもよい。

一実施例によれば、上記高張液で処理する工程は、軟骨組織に超音波を印加しながら６〜１２％の塩化ナトリウム溶液に４〜６時間浸漬することであってもよい。

一実施例によれば、上記ウイルス不活化溶液で処理する工程は、０．５〜１．５％の過酸化水素、０．１〜１．０％の過酢酸系、７０〜９９％のアルコール、及び０．００１〜３％の次亜塩素酸ナトリウムを含むウイルス不活化溶液に、３０分〜１時間浸漬することであってもよい。

一実施例によれば、上記アルカリ溶液での処理は、０．２５〜０．７５Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液に１５〜４５分間浸漬することであってもよい。

一実施例によれば、上記脱水処理は、５０％、８０％及び１００％濃度のアセトンに順次浸漬する方法、無水アルコールに浸漬する方法、５０％、８０％濃度のアセトンに順次浸漬した後に、無水アルコールに浸漬する方法、または０．１〜１％の抗生剤及び９０〜９９．９％のグリセロールを含む溶液に軟骨移植材を１次浸漬した後、１００％のグリセロール溶液に移して２次浸漬する方法からなる群より選択される１つ以上であってもよい。

一実施例によれば、上記冷凍処理は、上記アルカリ溶液で処理した軟骨組織を−７０℃で１〜２時間冷凍した後、４８〜７２時間凍結乾燥させることであってもよい。

本発明の他の側面によれば、上記方法により製造された軟骨移植材が提供される。

本発明に係る生体移植材は、多段階の処理工程を経ることにより抗原性、病原体及び細胞毒性が除去され、生物力学（ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ）及び組織の再構成能力に影響せず、すべての種類の病原性が非活性化された状態に製造される。ヒト以外の動物（哺乳類）の軟骨組織を用いるので、その収得や供給が円滑であり、生体移植材として適用する場合、費用が安価であるとの利点がある。

本発明に係る工程処理前の豚の耳介軟骨組織を様々な染料で染色し、顕微鏡でその切断面を観察した写真である。 本発明に係る工程処理前の豚の肋軟骨組織を様々な染料で染色し、顕微鏡でその切断面を観察した写真である。 本発明に係る工程処理後、最終的に製造された豚の耳介軟骨組織を様々な染料で染色し、顕微鏡でその切断面を観察した写真である。 本発明に係る工程処理後、最終的に製造された豚の肋軟骨組織を様々な染料で染色し、顕微鏡でその切断面を観察した写真である。 本発明に係る工程処理前後における豚の耳介軟骨組織内に存在するコラーゲン、ケラタン硫酸を示す写真である。 本発明に係る工程処理前後における豚の耳介軟骨組織内に存在するフィブロネクチン、コンドロイチン硫酸を示す写真である。 本発明に係る工程処理前後における豚の耳介軟骨組織を走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した写真である。 本発明に係る工程処理前後における豚の耳介軟骨組織の化学的構成を示すＨＰＬＣ結果グラフである。 本発明によりアセトンまたはグリセロール処理時の熱的特性を比較したデータである。 本発明の脱水方法であるアセトンまたはグリセロールの脱水方法の差による細胞毒性の有無及び最終軟骨移植材における細胞毒性の有無を確認したグラフである。 本発明により製造された軟骨移植材の生物学的安定性を評価するために、動物実験を通じて移植実験する過程を示す写真である。 本発明により製造された軟骨移植材の生物学的安定性を評価するために、動物実験を通じて移植実験を行った後、組織を摘出して組織検査した結果である。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明の一側面によれば、哺乳類の軟骨組織を用意する工程と、上記用意した軟骨組織を塩化ナトリウム高張液で処理する工程と、上記高張液で処理した軟骨組織をウイルス不活化溶液で処理する工程と、上記ウイルス不活化溶液で処理した軟骨組織をアルカリ溶液で処理する工程と、上記アルカリ溶液で処理した軟骨組織を脱水処理または冷凍処理する工程と、上記脱水処理または冷凍処理した軟骨組織にガンマ線を照射する工程と、を含む軟骨移植材の製造方法が提供される。

ここで、上記哺乳類の軟骨組織は、豚、人、馬、牛、犬、鼠などをすべて含む哺乳類の硝子軟骨、弾性軟骨、繊維軟骨を示す軟骨組織であってもよく、好ましくは、豚の軟骨組織であってもよい。より好ましくは、豚の耳介軟骨組織または肋軟骨組織であってもよい。

また、上記哺乳類の軟骨組織を用意する工程は、採取した軟骨組織を［アセトンまたはメタノール］：クロロホルム＝１：１（ｖ／ｖ）の割合で混合した溶液に２４〜７２時間、より好ましくは、４８時間浸漬して脱脂させる工程をさらに含むことができる。

上記脱脂工程をさらに含む場合、クロロホルム−メタノール抽出法により粗脂肪の含量を測定すると、豚の肋軟骨組織の粗脂肪含有量は、次のようであった。

一実施例によれば、上記塩化ナトリウム高張液で処理する工程では、超音波を印加しながら、６〜１２％の塩化ナトリウム溶液に軟骨組織を４〜６時間浸漬することができる。塩化ナトリウムの濃度が６％未満であると、軟骨組織内の細胞に滲透圧の作用が微弱であって細胞に対する滲透的破壊効果が弱くなる可能性があり、１２％を超過すると、まだ溶解してない塩が軟骨組織や容器に沈澱する可能性があって、好ましくない。このとき、超音波処理は、軟骨組織内部への溶液の浸透を助けることができ、細胞の滲透破壊を促進することができる。

一実施例によれば、上記ウイルス不活化溶液を処理する工程では、０．５〜１．５％の過酸化水素、０．１〜１．０％の過酢酸系、７０〜９９％のアルコール、及び０．００１〜３％の次亜塩素酸ナトリウムを含むウイルス不活化溶液で、３０分〜１時間浸漬させることができる。上記ウイルス不活化溶液で処理することにより、各種ウイルス粒子、プリオン粒子などの病原体を不活化させることができる。より好ましくは、上記過酢酸系は、０．１〜０．５％、最も好ましくは、０．１５〜０．２５％であってもよい。上記ウイルス不活化溶液の過酸化水素が０．５％未満であると病原体の不活化の効果が微弱であって好ましくなく、１．５％を超過すると軟骨組織が損傷することがあるので好ましくない。ここで、アルコールを上記範囲の９５．５％を超過し１００％近い組成比で使用する場合は、軟骨の変性を引き起こす可能性及び軟骨の脱水のような副作用が生じ得るので、好ましくない。

一実施例によれば、上記アルカリ溶液で処理することは、０．２５〜０．７５Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液に１５〜４５分間浸漬することであってもよい。このようなアルカリ溶液で処理することにより、軟骨組織内に存在したり、工程中に投入される可能性があったりするウイルスを不活化することができ、軟骨組織内の軟骨細胞を除去できるようになる。０．２５Ｍ未満の水酸化ナトリウム溶液で処理する場合、このようなウイルスの不活化及び細胞の除去に十分な化学反応が起こらないので好ましくなく、０．７５Ｍを超過すると軟骨組織が損傷する可能性があるため、好ましくない。

一実施例によれば、アルカリ溶液で処理した軟骨組織は、脱水処理工程を経ることになるが、上記脱水処理は、５０％、８０％及び１００％濃度のアセトンに順次浸漬する方法、無水アルコールに浸漬する方法、５０％、８０％濃度のアセトンに順次浸漬した後に無水アルコールに浸漬する方法、または０．１〜１％の抗生剤及び９０〜９９．９％のグリセロールを含む溶液に軟骨移植材を１次浸漬した後に、１００％グリセロール溶液に移して２次浸漬する方法からなる群より選択される１つ以上であることができる。グリセロールで軟骨移植材の細胞内の水分を置換すると保存性が向上するので、上記方法中の２つ以上を並行して使用することもできる。

上記脱水処理を経ずに、上記アルカリ溶液で処理した軟骨組織を、洗浄工程を経て直ちに−２０℃以下の冷凍状態に保管することもできる。

一実施例によれば、上記冷凍処理は、上記アルカリ溶液で処理した軟骨組織を−７０℃で１〜２時間冷凍した後、４８〜７２時間凍結乾燥させることであってもよい。

工程処理が完了した軟骨に対して、個別包装後にエチレンオキサイド（ＥＯ）ガス消毒を実施することができる。または、工程処理が完了した軟骨に対して、１０〜６０ｋＧｙ、より好ましくは、１０〜３０ｋＧｙのガンマ滅菌照射により軟骨移植材の滅菌を実施することができる。特に、３０ｋＧｙ以上の高準位ガンマ滅菌を実施する場合には、滅菌生理食塩水に軟骨移植材を浸漬し、ガンマ滅菌による単独処理工程のみを実施して軟骨移植材を製造することもできる。

以下では、実施例により本発明をさらに詳細に説明する。但し、これらの実施例は、ただ本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例により限定されるものではない。

（工程別の最適条件の確立）
（実施例１．最適ガンマ線量の決定）
豚の耳から抽出した新鮮な軟骨を９％のＮａＣｌ溶液に５時間浸漬し、超音波を照射した。これにより、軟骨細胞が除去されるようにした。その後、ウイルス不活化溶液として１％の過酸化水素溶液に上記組織を浸漬し、４５分間撹拌した。この過程を経りながらウイルス及びその他の病原体が不活化されるようにした。また、アルカリ溶液として０．５Ｍの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液に３０分間浸漬した。各工程別の溶液で処理する前に、洗浄溶液を用いて前の工程の処理溶液が残留しないように完全に洗浄した。その後、組織の損傷を最小化するために、５０％、８０％及び１００％のアセトンに順次浸漬し、脱水した後、包装容器に密封してガンマ線を照射した。最適のガンマ線量を決めるために、上記の工程により製造された軟骨移植材に対し、５〜３０ｋＧｙ範囲で、５ｋＧｙ単位でガンマ線を照射した。ガンマ線照射による活性軟骨細胞の程度及びその他の軟骨を構成する物質の量を数値化して最適のガンマ線量を選択し、その結果を下記の表２に示す。

ガンマ線照射後に、Ｈ＆Ｅ染色により活性化された状態で残っている軟骨細胞を相対的に比較及び観察した。生きている軟骨細胞は、体内移植後には抗原として作用することがあるので、これを不活化させることが何よりも重要である。そこで、各放射線量によるサンプルごとに軟骨細胞の形態が維持される程度を測定し、軟骨細胞の形態が最も多く維持された場合を５点満点に配点し、軟骨細胞の形態維持程度を点数で記録した。その結果、２５ｋＧｙと３０ｋＧｙの条件では、元の形態を維持する軟骨細胞がほとんど観察されなかった。

また、ＭＴ（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色とＶＶＧ（Ｖｅｒｈｏｅｆｆ−Ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ）染色の結果を見ると、コラーゲン繊維と弾性繊維が相当部分維持されることに示された。Ｓａｆｒａｎｉｎｅ Ｏの染色結果によりプロテオグリカン存在可否を確認し、Ａｌｃｉａｎ ｂｌｕｅ 染色により粘質多糖類（ＧＡＧｓ）が存在することが分かった。

ガンマ線量が高くなるほど基質内の軟骨細胞の除去及び不活化程度が増加することに示された。表２を参照すると、ガンマ線量が２５ｋＧｙである場合に軟骨細胞の除去率が最も高いながらもコラーゲン、プロテオグリカンＧＡＧｓ及び弾性繊維に対する保存率も最も高く示されて、最適の線量であることが分かった。図５及び図６は、ガンマ線量が２５ｋＧｙである場合の上記染料による結果を示している。

（実施例２．脱水方法の比較）
製造された軟骨組織は、アセトン処理またはグリセロールを用いて脱水することができる。グリセロールを用いた処理方法は、抗生剤を約０．１１％含むグリセロールに組織を浸漬した後、これを再び９９．９％以上のグリセロールに移して浸漬することにより、組織内の水分をグリセロールで置換する方法である。

図９を参照すると、アセトン及びグリセロールを用いて脱水した後の最終製品の熱的特性を比較したデータが示されている。図９の脱水方法による熱的特性変化の確認結果、アセトン及びグリセロールの熱的特性を比較すると、アセトンのガラス転移温度は約９９℃、グリセロールは約９６℃であって、有意差がないことが分かり、上記の結果に基づいて、アセトン及びグリセロールの熱的特性は、サンプルの状態に影響を及ぼさないことを確認した。また、図１０には、上記脱水方法による細胞毒性を観察した結果が示されているが、アセトンやグリセロールによる脱水方法のいずれも細胞に毒性がないことが確認された。

したがって、本発明に係る軟骨移植材は、アセトンにより脱水する方法以外にもグリセロールで処理して脱水及び保存する方法も可能であるが分かった。

（選択された工程の検証）
（実施例３．工程別のＥＣＭ因子の確認）
図５及び図６に示すように、新鮮な豚の耳介軟骨と最終的に製造された軟骨移植材に対して、ケラタン硫酸、コラーゲンＩＩ、フィブロネクチン、コンドロイチン硫酸の含量を調査した。その結果、ケラタン硫酸は、基質全般にわたって観察され、コンドロイチン硫酸は、軟骨膜の周辺で主に観察された。特に、コンドロイチン硫酸は、軟骨膜の一部の周辺に偏重して現われる傾向にあることが観察された。ケラタン硫酸、コラーゲンＩＩ、フィブロネクチン、コンドロイチン硫酸は、最終的に製造された軟骨移植材においては残留量が多少低減する傾向にあったが、依然として維持及び保存されていることが確認された。

（実施例４．最終製品の組織検査−軟骨細胞の不活化及び細胞外基質（ＥＣＭ）因子の維持確認）
上記の処理を通じて処理された最終軟骨移植材に、抗原性を誘発する軟骨細胞が存在するか、その他の細胞外基質はどのくらい維持されるのかを検証するために、それぞれの要素に特異的な染料で組織検査を実施した。

図３及び図４を参照すると、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色により観察した結果、最終軟骨移植材に生きている軟骨細胞は観察されず、基質内のすべての軟骨細胞が不活化されていることが確認できた。これは、図１及び図２では、生きている軟骨細胞が観察されたことと対照的である。図３及び図４に示されたように、ＭＴ（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ Ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）とＶＶＧ（Ｖｅｒｈｏｅｆｆ−Ｖａｎ Ｇｉｅｓｏｎ）染色の結果を見ると、コラーケン繊維と弾性繊維が相当部分維持されることに示された。サフラニンＯ染色結果により、プロテオグリカン存在可否及びアルシアンブル染色により粘多糖質（ＧＡＧｓ、Ｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ）の存在を確認することができた。

（実施例７．３次元の多孔性構造の確認）
最終産物の３次元的構造を電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察した。その結果は、図８に示すように、元の軟骨組織の構造と比べて、多孔性構造及び３次元的構造が損傷されずに保存されていることが分かる。

（実施例８．化学的特性の確認）
工程に投入されていない軟骨組織（赤い線）、及び工程処理中の軟骨組織（青い線）及び最終産物（紫線）の化学的含量を調査した。図９に示すように、それぞれのサンプルから同一のピークが現われており、加工工程及び滅菌により原料の特性が変わらないことを示している。

（実施例９．生物学的安定性の確認）
７週齢のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ ｒａｔ（ＳＤ−ｒａｔ、ｍａｌｅ）を入手して実験個体に、動物の一般健康状態の観察及び順化のために実験前の１週間の期間を飼育した。その後、平均体重に到逹する個体を選別して実験を実施した。Ｚｏｌｅｔｉｌｅ（２０ｍｇ／ｋｇ）とＸｙｌａｚｉｎｅ（５ｍｇ／ｋｇ）を筋肉注射して麻酔を誘導し、その後、脊椎を基準にして左／右に、それぞれ長さ方向に２ｃｍを切開した。試験物質を移植するために、筋膜と真皮を分離してポケットを作り、予め用意した０．５ｃｍの大きさの軟骨移植材を筋肉内に移植した。移植材の移植後には、４−０ナイロンを用いて単純結節縫合で欠損部位を縫合した。移植実験３ヶ月及び４ヶ月後に実験個体を犠牲させ、正常組織を含む移植部位を摘出して組織検査を実施した。

３ヶ月後のものの組織検査結果、移植材の周辺に移植実験において一般的に観察される微弱な炎症反応が観察されたが、観察された炎症細胞の細胞核が活動的ではないため、過度な炎症反応や異物反応がなく、体内に初期移植状態のそのまま存在することが確認できた。４ヶ月後のものの組織検査も３ヶ月後のものと同様の態様を示し、微弱な炎症反応が軟骨移植材の周辺で観察された。これは移植材の挿入による自然な現象であり、微弱な炎症反応以外の特異的な組織病理学的現象は観察されなかった。また、移植された移植材の内部は、すべて不活化された軟骨細胞が変形することなくそのまま存在し、その他の細胞外基質も変形することなく存在していることが確認できた。結果的に、本発明で開発しようとする異種由来の軟骨移植材の安定性を動物実験により観察することができた。

結局、本発明に係る生体移植材は、多段階の処理工程により抗原性、病原体及び細胞毒性を除去し、生物力学及び組織の再構成能力に影響を及ぼさなくすべての種類の病原性が非活性化された状態に製造される。ヒトではなく動物（哺乳類）の軟骨組織を用いるのでその収得と供給が円滑であり、生体移植材として適用する場合に費用が安価であるとの利点がある。

以上では、本発明内容の特定部分を詳細に説明したが、当該技術分野で通常の知識を有する者において、このような具体的な技術は、ただ好ましい実施様態に過ぎず、これによって本発明の範囲が限定されるものではないことは明らかである。したがって本発明の実質的な範囲は、添付した請求項とその等価物により定義されると言える。

Claims (7)

1. 哺乳類の軟骨組織を［アセトンまたはメタノール］：クロロホルム＝１：１（ｖ／ｖ）の割合で混合した溶液に２４〜７２時間浸漬して脱脂させる工程と、
   前記脱脂した軟骨組織に超音波を印加しながら６〜１２％の塩化ナトリウム高張液に４〜６時間浸漬する工程と、
   前記高張液で浸漬した軟骨組織を０．５〜１．５％の過酸化水素、０．１〜１．０％の過酢酸、７０〜９９％のアルコール、及び０．００１〜３％の次亜塩素酸ナトリウムを含むウイルス不活化溶液に、３０分〜１時間浸漬する工程と、
   前記ウイルス不活化溶液で浸漬した軟骨組織を０．２５〜０．７５Ｍの水酸化ナトリウム溶液に１５〜４５分間浸漬する工程と、
   前記水酸化ナトリウム溶液に浸漬した軟骨組織を脱水処理または冷凍処理する工程と、
   前記脱水処理または冷凍処理された軟骨組織にガンマ線を照射する工程と、
   を含む軟骨移植材の製造方法。
2. 前記哺乳類は、豚、人、馬、牛、犬、鼠からなる群より選択される１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の軟骨移植材の製造方法。
3. 前記軟骨組織は、硝子軟骨、弾性軟骨及び繊維軟骨からなる群より選択される１種以上であることを特徴とする請求項１に記載の軟骨移植材の製造方法。
4. 前記哺乳類の軟骨組織は、豚の軟骨組織であることを特徴とする請求項１に記載の軟骨移植材の製造方法。
5. 前記豚の軟骨組織は、耳介軟骨組織または肋軟骨組織であることを特徴とする請求項１に記載の軟骨移植材の製造方法。
6. 前記脱水処理は、５０％、８０％、及び１００％濃度のアセトンに順次浸漬する方法、無水アルコールに浸漬する方法、５０％、８０％濃度のアセトンに順次浸漬した後に無水アルコールに浸漬する方法、または０．１〜１％の抗生剤及び９０〜９９．９％のグリセロールを含む溶液に軟骨移植材を１次浸漬した後に１００％のグリセロール溶液に移して２次浸漬する方法からなる群より選択される１つ以上であることを特徴とする請求項１に記載の軟骨移植材の製造方法。
7. 前記冷凍処理は、前記アルカリ溶液で処理した軟骨組織を−７０℃で１〜２時間冷凍させた後、４８〜７２時間凍結乾燥させることである請求項１に記載の軟骨移植材の製造方法。

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