CN103491988B - 源自哺乳动物软骨的移植材料 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及源自哺乳动物软骨的移植材料。本发明的移植材料通过在不影响生物力学及组织重建性能下经由多步骤加工处理消除抗原性、病原体及细胞毒性并且灭活所有种类的病原体而具有显著降低的风险。由于使用哺乳动物软骨而不是人类软骨，所以容许平稳地接受及供应以及低成本制造。

Description

源自哺乳动物软骨的移植材料
技术领域
本发明涉及源自哺乳动物软骨的移植材料。
背景技术
在整形外科领域中已经广泛地用于治疗受损伤的软骨或移植软骨。响应尤其对于隆鼻的较大需求，鼻成形术一直增加。几十年来已经使用多种移植物来进行此项工作，包括自体软骨移植物。其中，异体移植物，例如戈尔特斯(gore-tex)或硅具有容易处理、节省手术时间及消除供体部位发病的优点。使用异质材料的相关现有技术是韩国专利申请公开第2011-0012807号，它揭示使用球囊及形状记忆合金的人工软骨；及韩国专利申请公开第2011-0097662号，它揭示用于关节软骨再生的支架及其制备方法。
然而，已经在长期随访中报告了诸如异物感、感染、疼痛以及移植物脱离及迁移等副作用。即使自体移植物由于出色的生物相容性可提供具有极少副作用的令人满意的手术报告，它也由于增加的供体部位发病、有限的选择、延迟的手术时间、大量采集等而使用受到限制。
作为克服与自体软骨移植物有关的问题的可选方案，提供从同种异体移植物或异种移植物供应软骨的方法。在这种情况下，病毒可经移植物转移，并且此类问题可通过在测定供体是否患有世界组织库(world tissue bank)中的病毒感染之后对选择的未受感染组织进行处理来解决。自1972年以来，这些种类的同种软骨移植物已经在矫形外科、整形外科、眼科、妇科及泌尿外科中使用，且与异体移植物不同，对于鼻尖成形术，不需要额外采集自体软骨。
然而，由于它使用人类软骨，所以它具有一些缺点，例如难以大量处理、由于为同种异体移植物而始终具有病原体扩散的风险以及制造用于移植的最终产物的高成本。
发明内容
本发明的发明者通过研发不仅在移植期间具有显著较低的副作用而且容易以低成本制备的移植材料来完成本发明。
本发明的一个方面是提供制备源自哺乳动物的移植材料的方法。
本发明的另一个方面是提供通过本发明方法制备的移植材料。
根据本发明的一个方面，提供制备软骨移植物的方法，所述方法包括：制备哺乳动物软骨；用氯化钠高渗溶液处理所制备的软骨；用病毒灭活溶液处理高渗溶液处理的软骨；用碱性溶液处理病毒灭活溶液处理的软骨；脱水处理或冷冻处理碱性溶液处理的软骨；及γ辐照脱水处理或冷冻处理的软骨。
根据实施方式，哺乳动物可为至少一种选自由下列组成的组的哺乳动物：猪、人类、马、牛、狗及小鼠。
根据实施方式，软骨可为至少一种选自由下列组成的组的软骨：透明软骨、弹性软骨及纤维软骨。
根据实施方式，制备哺乳动物软骨的步骤可进一步包括将软骨在以1:1(v/v)的比率混合的(丙酮或甲醇):氯仿溶液中浸泡24小时至72小时并使所得物脱脂。
根据实施方式，哺乳动物软骨可为猪软骨。
根据实施方式，猪软骨可为弹性耳软骨或肋软骨。
根据实施方式，用高渗溶液处理的步骤可为将软骨在6%至12%氯化钠溶液中浸泡4小时至6小时，同时向软骨施加超声波。
根据实施方式，用病毒灭活溶液处理的步骤可为在包含0.5%至1.5%过氧化氢、0.1%至1.0%过乙酸、70%至99%酒精及0.001%至3%次氯酸钠(NaOCl)的病毒灭活溶液中浸泡1/2至1小时。
根据实施方式，用碱性溶液处理的步骤可为在0.25M至0.75M氢氧化钠(NaOH)中浸泡15分钟至45分钟。
根据实施方式，可通过至少一种选自由下列组成的组的方法来实施脱水处理：顺序地浸泡在50%、80%及100%丙酮中；浸泡在无水酒精中；顺序地浸泡在50%及80%丙酮以及随后无水酒精中；及首先浸泡在包含0.1%至1%抗生素及90%至99.9%甘油的溶液中且随后浸泡在100%甘油溶液中。
根据实施方式，可通过将碱性溶液处理的软骨在-70℃下冷冻1小时至2小时且冷冻干燥48小时至72小时来实施冷冻处理。
根据本发明的另一个方面，提供通过上述方法制备的软骨移植物。
有益效果
本发明的移植材料可经由多个步骤通过在不影响生物力学及组织重建能力下消除抗原性、病原体和细胞毒性来制备，其中所有种类的病原体均被灭活。由于它不使用人类软骨而是使用哺乳动物软骨，所以具有移植材料平稳地接受和供应以及低成本的优点。
附图说明
图1是根据本发明处理之前透过显微镜观察的用各种染色剂染色的新鲜猪耳软骨的切片的照片。
(H&E、MT、番红O(Safranine O)、阿辛蓝(Alcian blue)、VVG)
图2是根据本发明处理之前透过显微镜观察的用各种染色剂染色的新鲜猪肋软骨的切片的照片。
箭头标明能存活的软骨细胞。
图3是根据本发明处理之后透过显微镜观察的用各种染色剂染色的最终猪耳软骨的切片的照片。
图4是根据本发明处理之后透过显微镜观察的用各种染色剂染色的最终猪肋软骨的切片的照片。
图5是分别图示存在于根据本发明处理之前及之后的新鲜(A、B)及最终(C、D)猪耳软骨中的胶原(A、C)、硫酸角质素(B、D)的照片。
图6是分别图示存在于根据本发明处理之前及之后的新鲜(A、B)及最终(C、D)猪耳软骨中的纤连蛋白(A、C)、硫酸软骨素(B、D)的照片。
图7分别是根据本发明处理之前及之后的新鲜及最终猪耳软骨的SEM。(A：新鲜软骨，B：最终产物(EEC))。
图8是HPLC结果的图，它分别图示根据本发明处理之前及之后的新鲜及最终猪耳软骨的化学结构。(A：处理之前，B：处理期间，C：处理之后)
图9图示根据本发明用丙酮及甘油处理的热性质的比较。
-丙酮：通过在处理之后相继浸泡在丙酮处理剂(50%→80%→100%)中脱水的试样。
-甘油：通过在处理之后浸泡在100%甘油(包括抗生素)中脱水的试样。
图10图示丙酮脱水与甘油脱水相比细胞毒性的差异以及最终软骨移植物的细胞毒性的差异。
(OD570nm，A：DMSO，B：PBS，C：对照，D：丙酮，E：甘油)
图11图示经由动物实验的移植过程，以便评估根据本发明方法制备的软骨移植物的生物稳定性。
图12图示在经由动物实验实施移植测试之后获得的组织的结果，以便测定通过本发明方法制备的软骨移植物的生物稳定性。
具体实施方式
在下文中将更详细地描述本发明。
根据本发明的一个方面，提供制备软骨移植物的方法，所述方法包括：制备哺乳动物软骨；用氯化钠高渗溶液处理所制备的软骨；用病毒灭活溶液处理经高渗溶液处理的软骨；用碱性溶液处理经病毒灭活溶液处理的软骨；脱水处理或冷冻处理经碱性溶液处理的软骨；及γ辐照经脱水处理或冷冻处理的软骨。
这里，哺乳动物软骨可为包括猪、人类、马、牛、狗及小鼠在内的哺乳动物的透明软骨、弹性软骨或纤维软骨，优选为猪软骨。更优选地，它可为猪的弹性耳软骨或肋软骨。
此外，制备哺乳动物软骨的步骤可进一步包括将软骨在以1:1(v/v)的比率混合的(丙酮或甲醇):氯仿溶液中浸泡24小时至72小时，优选为48小时，并使所得物脱脂。
在实施脱脂步骤并通过使用氯仿-甲醇提取测定粗脂肪的量时，猪肋软骨的粗脂肪的量测定如下。
【表1】
根据实施方式，用氯化钠高渗溶液处理的步骤可通过将软骨在6%至12%氯化钠溶液中浸泡4小时至6小时，同时向软骨施加超声波来实施。当氯化钠的浓度小于6%时，渗透破坏效应可能较弱，因为软骨细胞中的渗透作用变得很小，而当其大于12%时，不溶解的盐可能进入软骨或容器中。这里，超声波处理有助于溶液渗入软骨内部并增强对细胞的渗透破坏。
根据实施方式，用病毒灭活溶液处理的步骤可通过在包含0.5%至1.5%过氧化氢、0.1%至1.0%过乙酸、70%至99%酒精及0.001%至3%次氯酸钠(NaOCl)的病毒灭活溶液中浸泡1/2至1小时来实施。病毒颗粒及朊病毒颗粒等的所有病原体均可经由病毒灭活溶液处理来灭活。优选为0.1-0.5%过乙酸，且最优选为0.15-0.25%过乙酸。当病毒灭活溶液中的过氧化氢的浓度小于0.5%时，病原体的灭活可能不能充分地实施，而当其大于1.5%时，可能损伤软骨。这里，当酒精的浓度是从大于95.5%到接近100%时，可导致不合意的副作用，例如软骨的变性及脱水。
根据实施方式，碱性溶液处理可通过在0.25M至0.75M氢氧化钠(NaOH)中浸泡15分钟至45分钟来实施。存在于软骨中或可能在过程期间加入的病毒可通过碱性溶液处理来灭活。这也容许消除软骨组织中的软骨细胞。当用小于0.25M的氢氧化钠实施处理时，用以灭活此类病毒并且消除细胞的化学反应可能不能充分地进行，而当用大于0.75M的氢氧化钠处理时，可能损伤软骨。
根据实施方式，实施碱性溶液处理之后的脱水处理可通过至少一种选自以下的方法来实施：将软骨顺序地浸泡在50%、80%及100%丙酮中；浸泡在无水酒精中；顺序地浸泡在50%及80%丙酮以及随后无水酒精中；及首先浸泡在包含0.1%至1%抗生素及90%至99.9%甘油的溶液中且随后浸泡在100%甘油溶液中。当软骨移植物的细胞内的水经甘油替代时，由于它改进保存性(conservativeproperty)，因此可将两种或两种以上的上述方法组合。
此外，经碱性溶液处理的软骨可在洗涤步骤之后在-20℃或低于-20℃下储存而不进行脱水处理。
根据实施方式，通过将经碱性溶液处理的软骨在-70℃下冷冻1小时至2小时来实施冷冻处理，且随后可实施48小时至72小时的冷冻干燥。
处理之后的最终软骨可个别地包装并且用环氧乙烷(EO)气体消毒。或者，处理之后的最终软骨可用10-60kGy、优选10-30kGy进行γ辐照以将软骨移植物灭菌。具体来说，当用30kGy或高于30kGy实施γ灭菌时，可通过将软骨移植物浸泡在无菌等渗溶液中通过仅实施γ灭菌过程来制备软骨移植物。
在下文中，尽管利用实施例给出更详细描述，但这些实施例仅用于解释且不打算限制本发明。
确定工艺的最佳条件
实施例1.γ射线的最佳剂量的确定
将从猪耳提取的新鲜软骨在9%NaCl溶液中浸泡5小时并用超声波辐射。通过这种处理移除软骨细胞。随后，将其在作为病毒灭活溶液的1%过氧化氢中浸泡45分钟并搅拌。通过这种处理灭活病毒及其它病原体。然后，将其在作为碱性溶液的0.5M氢氧化钠(NaOH)中浸泡30分钟。在每次处理之前，将处理前的溶液用洗涤溶液彻底洗出。通过顺序地浸泡在50%、80%及100%丙酮中来实施脱水处理，以便使对软骨组织的损伤降到最低，随后密封到容器中并进行γ-辐照。在5kGy至30kGy的范围内以5kGy为单位γ-辐照通过上述方法制备的软骨移植物，以便确定γ射线的最佳剂量。通过将活性软骨细胞随γ辐照及形成软骨的其它材料的量的变化程度数字化，以确定γ射线的最佳剂量，并且结果显示在表2。
在γ-辐照之后，观察仍呈活性状态的软骨细胞并通过H&E染色进行比较。由于活的软骨细胞在植入之后可作为抗原，因此使其灭活最为重要。测试基于辐照量的各份试样，以便测定软骨细胞的形状保持程度。当软骨细胞的形状保持得最完整时，将其评分为5，并对软骨细胞的形状保持程度进行评分。结果，在25kGy及30kGy条件下未观察到保持原来形状的软骨细胞。
此外，根据MT(马森三色(masson’s trichrome))染色及VVG(沃-冯二氏(verhoeff-van gieson))染色，注意到，大部分胶原纤维及弹性纤维得以保持。通过番红O染色确定蛋白聚糖的存在，并且通过阿辛蓝染色确定糖胺聚糖(GAG)的存在。
γ射线的量变得越高，基质中的软骨细胞移除得越多并且灭活程度增加得越大。参考表2，当γ射线的剂量是25kGy时，软骨细胞的移除率最高，并且胶原、蛋白聚糖、GAG（糖胺聚糖）及弹性纤维的保存比率最高，因此将其标注为最佳剂量。图5和图6图示当γ射线的量是25kGy时的结果。
【表2】
评估类别 5kGy 15kGy 25kGy 30kGy
软骨细胞的形状保持程度 5 4 1 1
胶原纤维 4 4 4 3
蛋白聚糖 5 5 4 3
GAG 5 5 4 4
弹性纤维 5 5 5 4
实施例2.脱水的比较
通过使用丙酮或甘油处理使所制备的软骨脱水。通过将组织浸泡在包括约0.11%抗生素的甘油中且随后浸泡在高于99.9%的甘油中以用甘油替代组织中的水来实施甘油处理。
参考图9，在通过使用甘油脱水之后，比较最终产物的热性质。根据图示热性质随脱水的变化的图9，丙酮的玻璃化转变温度是约99°，而甘油的玻璃化转变温度是约96°。因此，注意到无显著差异，并且丙酮及甘油的热性质并未影响试样的形状。根据图示细胞毒性随脱水的变化的图10，还注意到使用丙酮或甘油脱水不存在细胞毒性。
因此，本发明的软骨移植物可通过丙酮或甘油处理来脱水并储存。
对所选工艺的研究
实施例3.工艺的ECM因子的测定
如图5和图6中所示，测定新鲜猪耳软骨及最终软骨移植物中硫酸角质素、胶原II、纤连蛋白及硫酸软骨素的量。在基质中随处观察到硫酸角质素，而硫酸软骨素主要在软骨膜附近观察到，且硫酸软骨素尤其集中在软骨膜的一侧。注意到，最终产物中硫酸角质素、胶原II、纤连蛋白及硫酸软骨素的量略微降低，但仍然保持及保持。
实施例4.最终产物的活组织检查-软骨细胞的灭活及细胞外基质(ECM)因 子的保持的测定
用对各因子具有选择性的染色剂对通过实施上述处理制备的最终软骨移植物实施活组织检查，以便确定是否存在对最终软骨移植物造成抗原性的软骨细胞以及多少其它细胞外基质被保持。
参考图3和图4，注意到，在使用苏木素及曙红(H&E)染色测定时，在最终软骨移植物中未观察到任何活的软骨细胞，并且基质中的所有软骨细胞均被灭活。这有别于图示活软骨细胞的观察结果的图1和图2中所显示的结果。根据图3和图4中的MT(马森三色)及VVG(沃-冯二氏)染色结果，注意到，大部分胶原纤维及弹性纤维得以保持。通过番红O染色测定蛋白聚糖存在，并且通过阿辛蓝染色测定糖胺聚糖(GAG)存在。
实施例7.3-D多孔结构的测定
用扫描电子显微镜观察最终产物的3-D结构。如图8中所示，初始软骨组织的多孔结构及3-D结构得以良好保持。
实施例8.化学特征的测定
测定处理之前的软骨(红色线)、处理期间的软骨(蓝色线)及最终产物(紫色线)的化学特征。如图9中所示，注意到，处理及灭菌未改变化学特征，因为各份试样显示相同的峰。
实施例9.生物稳定性的测定
接收7周龄的斯普拉格-道利大鼠(sprague dawley rat)(SD大鼠，雄性)并在测试之前喂养1周，以便观察总体健康状况及适应环境。此后，选择具有平均体重的对象实施测试。通过肌内注射舒泰（zoletile）(20mg/kg)及赛拉嗪(xylazine)(5mg/kg)诱导麻醉，并且随后沿脊柱左/右方向水平地切成2cm段。通过分离筋膜与真皮制得袋状物，以便植入测试材料，并且将预先制备的0.5cm大小的软骨移植物植入肌肉中。在植入移植物之后，通过使用4-0尼龙单纯间断缝合来缝合缺陷部位。在植入测试3个月及4个月之后，通过宰杀对象获得包括正常组织在内的移植部位并进行测试。
根据3个月时的活组织检查，在移植物周围观察到非常弱的发炎，这在植入时经常观察到，但是注意到初始植入物如原来一样存在而没有发炎反应或异物反应，因为发炎细胞的细胞核不具活性。4个月时的活组织检查结果显示在软骨移植物周围非常弱的发炎反应，这与3个月时类似。这在植入移植物中非常常见且未观察到具体的病理现象。注意到，所有灭活的软骨细胞在无应变下存在于植入的移植物内，并且其它细胞外基质也在无应变下存在。因此，在整个动物测试过程中观察到本发明的软骨移植物的稳定性。
通过在不影响生物力学及组织重建性能下经由多步骤加工处理消除抗原性、病原体及细胞毒性并且灭活所有种类的病原体制备得到本发明的软骨移植物。由于使用哺乳动物软骨而不是人类软骨，所以容许平稳地接受及供应以及低制造成本。
尽管已经参照特定实施方式描述本发明，但是所属领域的技术人员应了解，可在不背离本发明的精神和范围的情况下作出各种改变及修改，如所附权利要求书及其等效内容所限定。

Claims (7)

1.一种制备软骨移植物的方法，所述方法包括：
采用哺乳动物软骨；
将软骨在以1:1的体积比率混合的(丙酮或甲醇):氯仿溶液中浸泡24小时至72小时并使所得物脱脂；
将所述脱脂后软骨在6％至12％氯化钠溶液中浸泡4小时至6小时，同时向软骨施加超声波；
将经所述氯化钠溶液处理的软骨在包含0.5％至1.5％过氧化氢、0.1％至1.0％过乙酸、70％至99％酒精及0.001％至3％次氯酸钠(NaOCl)的病毒灭活溶液中浸泡1/2至1小时；
将所述病毒灭活溶液浸泡后的软骨在0.25M至0.75M氢氧化钠(NaOH)溶液中浸泡15分钟至45分钟；
脱水处理或冷冻处理所述氢氧化钠溶液处理的软骨；及
γ辐照所述脱水处理或冷冻处理的软骨。
2.根据权利要求1所述的制备软骨移植物的方法，其中所述哺乳动物是选自下组的至少一种：猪、人、马、牛、狗及小鼠。
3.根据权利要求1所述的制备软骨移植物的方法，其中所述软骨是选自下组的至少一种：透明软骨、弹性软骨及纤维软骨。
4.根据权利要求1所述的制备软骨移植物的方法，其中所述哺乳动物软骨是猪软骨。
5.根据权利要求4所述的制备软骨移植物的方法，其中所述猪软骨是弹性耳软骨或肋软骨。
6.根据权利要求1所述的制备软骨移植物的方法，其中通过选自下组的至少一种方法来实施所述脱水处理：顺序地浸泡在50％、80％及100％丙酮中；浸泡在无水酒精中；顺序地浸泡在50％和80％丙酮中并且随后浸泡无水酒精中；以及首先浸泡在包含0.1％至1％抗生素及90％至99.9％甘油的溶液中并且随后浸泡在100％甘油溶液中。
7.根据权利要求1所述的制备软骨移植物的方法，其中所述冷冻处理这样实施：将所述碱性溶液处理的软骨在-70℃下冷冻1小时至2小时，并且冷冻干燥48小时至72小时。
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