CN104208750B - 一种脱细胞肌腱材料的制备方法及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种脱细胞肌腱材料的制备方法，包括如下步骤：（1）取新鲜肌腱，清洗；（2）将肌腱沿厚度方向进行压缩，压缩率为60～90%；（3）对步骤（2）压缩后的肌腱进行反复冻融；（4）将步骤（3）处理后的肌腱用核酸酶处理，清洗，即可。本发明还公开了前述方法制备的脱细胞肌腱材料及其用途。本发明方法制备的脱细胞肌腱材料脱细胞彻底，免疫原性低，生物力学性能、生物相容性好，制备方法简单，成本低廉，具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种脱细胞肌腱材料的制备方法及其用途，属于生物材料领域。
背景技术
肌腱是一种血供少、细胞比重少的致密结缔组织，主要由高度沿轴向排列的胶原纤维组成，因而在承受载荷时可提供最大的抗应变能力，是一种良好的肌腱/韧带损伤或缺损的修复支架。但是异体或异种来源的肌腱组织，因其细胞上具有多种免疫原性物质，如细胞核内的DNA会引起所有动物发生免疫排斥反应，细胞膜上的α-半乳糖基抗原（α-gal）会引起灵长类动物发生免疫排斥反应，用于体内修复的效果不尽人意，同时存在安全隐患。因此，在制备用于体内修复的肌腱时，通常采用各种脱细胞方法，去除肌腱组织细胞中的核物质，若用于灵长类动物修复时，应同时去除肌腱组织细胞膜上的α-gal。
肌腱脱细胞处理可以采用常用的去垢剂，如Triton X-100、SDS、Trypsin，其可以有效去除免疫原性物质，降低肌腱的免疫原性，但同时也会破坏肌腱的超微结构，导致力学性能显著下降，生物活性因子也显著减少，制得的肌腱具有去垢剂残留。
采用超声、反复冻融、核酸酶和/或α-半乳糖苷酶进行脱细胞处理，不会破坏肌腱的结构，但是难以有效去掉肌腱的免疫原性物质。如，江燕林等采用反复冻融与核酸酶处理联用的方式制备脱细胞肌腱，具体是取小牛跟腱，采用液氮冷冻/37℃复温反复冻融5次，再在含有150U/ml DNase和100μg/ml RNase的核酸酶溶液中处理24h，HE染色和DAPI染色显示肌腱内膜上仍有部分细胞核残留，DNA残留量检测结果显示DNA残留量高达（0.05±0.02）μg/mg，免疫原性较高（江燕林等，“脱细胞小牛肌腱组织形态学和生物力学特性研究”，中国修复重建外科杂志,2013,27(5):71-76）。另外，江燕林等还研究发现，在反复冻融、核酸酶处理小牛跟腱的基础上，再用α-半乳糖苷酶处理24h，α-半乳糖基抗原（α-gal）的含量显著下降，但DNA残留量并无明显变化，免疫原性仍然较高（江燕林等，“异种脱细胞肌腱生物支架的生物力学特性研究”，医用生物力学，2012,27(10):370）。
因此，如何在有效脱细胞、去异种抗原的同时，保留肌腱组织的结构形态、生物力学特性和生物活性因子是目前研究脱细胞肌腱材料面临的难题。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种新的制备脱细胞肌腱材料的方法，以及该方法制备的脱细胞肌腱材料及其用途。
本发明脱细胞肌腱材料的制备方法，包括如下步骤：
（1）取新鲜肌腱，清洗；
（2）将肌腱沿厚度方向进行压缩，压缩率为60～90%；
（3）对步骤（2）压缩后的肌腱进行反复冻融；
（4）将步骤（3）处理后的肌腱用核酸酶处理，清洗，即可。
优选地，步骤（2）中，所述压缩率为70～80%。
步骤（3）中，所述反复冻融是将步骤（2）压缩后的肌腱置于液氮中1～3min，25～37℃放置3～10min，重复操作4～6次。优选地，所述反复冻融是将步骤（2）压缩后的肌腱置于液氮中1min，37℃放置5min，重复操作5次。
步骤（4）中，核酸酶处理的方法为：取步骤（3）处理后的肌腱，置于DNase浓度为120～180IU/ml、RNase浓度为80～120μg/ml的核酸酶溶液中，室温或37℃恒温处理6～24h。优选地，所述核酸酶溶液中，DNase的浓度为150IU/ml，RNase的浓度为100μg/ml；所述处理的温度为37℃，处理的时间为6h。
DNase：脱氧核糖核酸酶；RNase：核糖核酸酶。
因α-gal（α-半乳糖基抗原）会引起灵长类动物的免疫排斥反应，在制备用于修复灵长类动物的脱细胞肌腱时，需要在前述处理方法基础上，进一步采用α-半乳糖苷酶去除α-gal，即将前述步骤（4）处理后的肌腱，置于α-半乳糖苷酶浓度为3～8U/ml的溶液中，15～40℃处理6～24h。优选地，所述溶液中，α-半乳糖苷酶的浓度为5U/ml；所述处理的温度为26℃，所述处理的时间为6h。
本发明还提供了前述任意一项方法制备的脱细胞肌腱材料，以及该材料在制备治疗软组织缺损修复材料中的用途，优选地，所述软组织缺损修复材料是肌腱组织或韧带组织缺损修复材料。
本发明巧妙地先对肌腱进行适当压缩，再采用反复冻融、核酸酶处理以及α-gal处理的方式进一步处理肌腱，有效地解决了现有方法难以有效降低肌腱免疫原性的问题，同时很好地保留了肌腱组织的结构特征、生物力学性能和生物活性因子，制备方法简单，成本低廉，具有较好的应用前景。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1肌腱压缩示意图(沿肌腱厚度方向压缩)；
图2不同压缩比例H&E染色观察（a，b，c，d压缩比例依次为30%，50%，70%，80%）；
图3 DNA含量检测结果（1,2,3,4依次为A组，B组，C组，D组，﹟为差异有统计学意义，A组，B组，C组，D组依次表示核酸酶处理6h，12h，18h，24h）；
图4α-Gal含量检测结果（1,2,3,4依次为A组，B组，C组，D组，△、﹟为差异有统计学意义，A组，B组，C组，D组依次表示α-半乳糖苷酶处理6h，12h，18h，24h）；
图5 H&E和DAPI染色观察（a、b、c、d：H&E染色（×400），e、f、g、h：DAPI染色（×100），a、e，b、f，c、g，d、h分别对应A组，B组，C组，D组）；
图6免疫组化观察（a、b、c、d：FN（×200），e、f、g、h：DCN（×200），i、j、k、l：α-gal（×400）；a、e、i，b、f、j，c、g、k，d、h、l分别对应A组，B组，C组，D组）；
图7天狼星红染色观察（×200，a，b，c，d分别对应A组，B组，C组，D组）；
图8阿利新蓝染色观察（×200，a，b，c，d分别对应A组，B组，C组，D组）；
图9 FT-IR图谱；
图10植入材料示意图；
图11取材大体观察图（a、d，b、e，c、f分别对应术后1W，4W，8W结果）；
图12 H&E染色观察（×100a、b、c、d、e，f、g、h、i、j，k、l、m、n、o分别为术后1W，4W，8W结果。a、f、k为A组，b、g、l为B组，c、h、m为C组，d、i、n为D组，e、j、o为PGA材料）。
具体实施方式
缩略词表：
主要材料、试剂与仪器：
出生1d的西门塔尔小牛后肢，由新希望集团养牛场（四川洪雅县）提供；新鲜家猪后肢、新鲜山羊后肢、新鲜比格犬后肢，购自市场；Quant-iTTMds DNAAssay Kit（invitrogen公司，美国）；DNase/RNase（Roche公司，德国）；α-半乳糖苷酶、Papain、天狼星红染料、阿利新蓝染料（Sigma公司，美国）；Anti-Fibronectin、Anti-FN、Anti-DCN、Anti-gal（abcam公司，香港）；DAPI（Vector公司，美国）；冰冻切片机、酶标仪（Leica公司，德国）；扫描电镜（Jeol公司，日本）；荧光生物显微镜（Nikon公司，日本）；冷冻干燥机（Christ公司，德国）；球磨仪（Retsch公司，德国）；生物力学试验机（Instron公司，美国）。偏振光显微镜（Leica公司，德国）。
统计学方法：
采用SPSS16.0软件包进行数据统计分析和处理，全部数据用均数±标准差表示，数据满足正态分布，方差齐，组间两两比较采用单因素方差分析(Sceffe法)，检验水准α=0.05，即P<0.05时差异有统计学意义。
实施例1本发明小牛肌腱脱细胞材料的制备
（1）取新生小牛（出生1d）后肢跟腱，PBS或生理盐水清洗3次；
（2）用游标卡尺测量每根肌腱的厚度，约4～6mm，于单轴压缩试验机上压缩加工，压缩率为80%（如图1所示）。压缩加工后的长带状肌腱厚度 约0.8～1.2mm，长度为8cm；
（3）将压缩后的长带状跟腱取出作反复冻融处理：-196℃液氮冷冻1min后37℃生理盐水中复温5min，此操作重复5次；
（4）核酸酶处理：将反复冻融后的跟腱用PBS清洗3次，置于含DNase和RNase(DNase浓度为150IU/ml，RNase浓度为100μg/ml)的溶液中，密封后于37℃恒温摇床上处理6h；PBS清洗5次，每次30min。冻干，真空包装，灭菌，-40℃保存备用。
实施例2本发明小牛肌腱脱细胞材料的制备
（1）取新生小牛（出生1d）后肢跟腱，PBS或生理盐水清洗3次；
（2）用游标卡尺测量每根肌腱的厚度，约4～6mm，于单轴压缩试验机上压缩加工，压缩率为80%（如图1所示）。压缩加工后的长带状肌腱厚度约0.8～1.2mm，长度为8cm；
（3）将压缩后的长带状跟腱作反复冻融处理：-196℃液氮冷冻1min后37℃生理盐水复温5min，此操作重复5次；
（4）核酸酶处理：将反复冻融后的跟腱PBS清洗3次，置于含DNase和RNase(DNase浓度为150IU/ml，RNase浓度为100μg/ml)的容器内，密封后于37℃恒温摇床上处理6h；
（5）半乳糖苷酶处理：将核酸酶处理后的跟腱，PBS清洗5次，每次30min。置于含α-半乳糖苷酶（浓度为5U/ml）的容器内密封后26℃摇床上处理6h；PBS清洗5次，每次30min。冻干，真空包装，灭菌，-80℃保存备用。
实施例3本发明小牛肌腱脱细胞材料的制备
（1）取小牛（出生30d）后肢跟腱，PBS或生理盐水清洗2次；
（2）用游标卡尺测量每根肌腱的厚度，约4～6mm，于单轴压缩试验机上压缩加工，压缩率为70%（如图1所示）。
（3）取压缩后的长带状跟腱作反复冻融处理：-196℃液氮冷冻3min后25℃生理盐水复温10min，此操作重复4次；
（4）核酸酶处理：将反复冻融后的跟腱PBS清洗2次，置于含DNase和RNase(DNase浓度为120IU/ml，RNase浓度为80μg/ml)的容器内，密封后于37℃恒温摇床上处理24h；
（5）生理盐水清洗3次，每次60min。冻干，真空包装，灭菌，-20℃保存备用。
实施例4本发明小牛肌腱脱细胞材料的制备
（1）取小牛（出生30d）后肢跟腱，PBS或生理盐水清洗2次；
（2）用游标卡尺测量每根肌腱的厚度，约4～6mm，于单轴压缩试验机 上压缩加工，压缩率为70%（如图1所示）；
（3）将压缩后的跟腱作反复冻融处理：-196℃液氮冷冻3min后25℃生理盐水复温10min，此操作重复4次；
（4）核酸酶处理：将反复冻融后的跟腱PBS清洗2次，置于含DNase和RNase(DNase浓度为120IU/ml，RNase浓度为80μg/ml)的容器内，密封后于37℃恒温摇床上处理24h；
（5）半乳糖苷酶处理：取核酸酶处理后的跟腱，PBS清洗5次，每次30min。置于含α-半乳糖苷酶（浓度为3U/ml）的容器内密封后26℃摇床上处理24h；PBS清洗5次，每次30min。冻干，真空包装，灭菌，-15℃保存备用。
实施例5本发明小牛肌腱脱细胞材料的制备
（1）取新生小牛（出生7d）后肢跟腱，PBS或生理盐水清洗2次；
（2）用游标卡尺测量每根肌腱的厚度，约4～6mm，于单轴压缩试验机上压缩加工，压缩率为60%（如图1所示）；
（3）取压缩后的长带状跟腱作反复冻融处理：-196℃液氮冷冻1min后37℃PBS中复温3min，此操作重复6次；
（4）核酸酶处理：将反复冻融后的跟腱用PBS清洗2次，置于含DNase和RNase(DNase浓度为180IU/ml，RNase浓度为120μg/ml)的容器内，密封后于37℃恒温摇床上处理12h；生理盐水清洗8次，每次20min。冻干，真空包装，灭菌，4℃保存备用。
实施例6本发明小牛肌腱脱细胞材料的制备
（1）取新生小牛（出生7d）后肢跟腱，PBS或生理盐水清洗2次；
（2）用游标卡尺测量每根肌腱的厚度D，约4～6mm，于单轴压缩试验机上压缩加工，压缩率为60%（如图1所示）；
（3）将长带状跟腱取出，待恢复至室温后作反复冻融处理：-196℃液氮冷冻1min后37℃PBS中复温3min，此操作重复6次；
（4）核酸酶处理：将反复冻融后的跟腱PBS清洗2次，置于含DNase和RNase(DNase浓度为180IU/ml，RNase浓度为120μg/ml)的容器内，密封后于37℃恒温摇床上处理12h；
（5）半乳糖苷酶处理：取出材料，PBS清洗5次，每次30min。置于含α-半乳糖苷酶（浓度为8U/ml）的容器内密封后室温摇床上处理12h；生理盐水清洗8次，每次20min。冻干，真空包装，灭菌，室温保存备用。
实施例7本发明犬跟腱脱细胞材料的制备
（1）取成年比格犬后肢跟腱，生理盐水清洗3次；
（2）用游标卡尺测量每根肌腱的厚度D，约4～5mm，于单轴压缩试验 机上压缩加载，压缩率为60%（如图1所示）。压缩加载后的长带状肌腱厚度约0.8～1.0mm，长度为4cm。加工后-40℃保存以备用；
（3）将长带状跟腱取出，待恢复至室温后作反复冻融处理：-196℃液氮冷冻1min后37℃生理盐水复温5min，此操作重复5次；
（4）核酸酶处理：将反复冻融后的跟腱PBS清洗2～3次，置于含DNase和RNase(DNase浓度为150IU/ml，RNase浓度为100μg/ml)的容器内，密封后于37℃恒温摇床上处理6h；
（5）PBS清洗5次，每次30min。冻干，真空包装，灭菌，4℃保存备用。
实施例8本发明猪跟腱脱细胞材料的制备
（1）取成年猪（出生6个月）后肢跟腱，PBS或生理盐水清洗2-3次；
（2）用游标卡尺测量每根肌腱的厚度D，约5～6mm，于单轴压缩试验机上压缩加工，压缩率为70%（如图1所示）。压缩加工后的长带状肌腱厚度约1.0～1.2mm，长度为6cm。加工后-40℃保存以备用；
（3）将长带状跟腱取出，待恢复至室温后作反复冻融处理：-196℃液氮冷冻1min后37℃生理盐水复温5min，此操作重复5次；
（4）核酸酶处理：将反复冻融后的跟腱PBS清洗2～3次，置于含DNase和RNase(DNase浓度为150IU/ml，RNase浓度为100μg/ml)的容器内，密封后于37℃恒温摇床上处理6h；
（5）半乳糖苷酶处理：取出材料，PBS清洗5次，每次30min。置于含α-半乳糖苷酶（浓度为5U/ml）的容器内密封后室温摇床上处理6h;
（6）PBS清洗5次，每次30min。冻干，真空包装，灭菌，-15℃保存备用。
实施例9本发明羊跟腱脱细胞材料的制备
（1）取成年山羊（出生1年）后肢跟腱，PBS或生理盐水清洗2-3次；
（2）用游标卡尺测量每根肌腱的厚度D，约5～6mm，于单轴压缩试验机上压缩加工，压缩率为60%（如图1所示）。加工后-40℃保存以备用；
（3）将长带状跟腱取出，待恢复至室温后作反复冻融处理：-196℃液氮冷冻1min后37℃生理盐水复温5min，此操作重复5次；
（4）核酸酶处理：将反复冻融后的跟腱PBS清洗2～3次，置于含DNase和RNase(DNase浓度为150IU/ml，RNase浓度为100μg/ml)的容器内，密封后于37℃恒温摇床上处理6h；
（5）半乳糖苷酶处理：取出材料，PBS清洗5次，每次30min。置于含α-半乳糖苷酶（浓度为5U/ml）的容器内密封后室温摇床上处理6h;
（6）PBS清洗5次，每次30min。冻干，真空包装，灭菌，-70℃备用。
实施例10本发明方法的参数筛选
1、压缩比例的确定
1.1方法
（1）将12根新鲜的小牛后肢取出，小心解剖出肌腱，生理盐水清洗，测量每根肌腱的厚度D；
（2）按压缩率为30%（A组）、50%（B组）、70%（C组）、80%（D组）进行压缩(如图1所示)，每组3根；
（3）将压缩后的各组肌腱，置于耐低温的橡胶盒内，注入液氮，1min后快速转移至盛有37℃生理盐水的烧杯内，并置于37℃恒温水浴锅内复温5min，反复冻融5次；
（4）将反复冻融后的各组肌腱放入含有150IU/ml的DNase和100μg/ml的RNase的PBS溶液的离心管内，封口，置于37℃恒温摇床震荡处理24h；
（5）常规H&E染色检测各组脱细胞效果。
1.2结果
H&E染色结果（图2）表明，采用本发明方法，即压缩率为70%或80%时，处理后的肌腱中均无细胞核残留，说明本发明方法可以有效去除其中的免疫原性物质，而压缩率为30%或50%时，仍有细胞核残留，难以有效去除免疫原性物质。
2、核酸酶处理时间的筛选：
2.1方法
（1）取12片按照1.1方法步骤（1）和步骤（2）制备的压缩率为80%的小牛肌腱(长4-6cm,宽1.5-3cm，厚0.8-1.2mm)，随机均分为4组（每组3片）。
（2）将肌腱片置于耐低温的橡胶盒内，注入液氮，1min后快速转移至盛有37℃生理盐水的烧杯内，并置于37℃恒温水浴锅内复温5min，反复冻融5次。
（3反复冻融后用核酸酶处理6h、12h、18h、24h（A组、B组、C组、D组）：将反复冻融后的肌腱放入含有150IU/ml的DNase和100μg/ml的RNase的PBS溶液的离心管内，封口，置于37℃恒温摇床震荡后6h、12h、18h、24h；处理完毕后将各组材料PBS清洗5次，每次30min；
（4）DNA含量的检测：各组均取3根肌腱，冻干，剪碎，称重，球磨；0.5mg/ml的Papain60℃消化24h，90℃水浴终止消化；10000g4℃离心5min，取上清液；采用Quant-iTTMds DNA Assay Kit说明书中方 法进行检测。
2.2结果
DNA含量检测结果如表1和图3所示：
表1本发明不同处理时间的DNA残留量
| 组别 | DNA残留量（ng/mg） |
| A（6h核酸酶处理） | 4.64±2.69 |
| B（12h核酸酶处理） | 1.65±0.72 |
| C（18h核酸酶处理） | 1.24±0.34 |
| D（24h核酸酶处理） | 0.99±0.34 |
统计结果显示，各组组间比较差异均无统计学差异（P>0.05）（如图3所示）。
如表1和图3所示，本发明方法中，核酸酶处理6～24h时，DNA残留量均非常少，随着核酸酶处理时间延长，DNA残留量下降，但下降幅度不明显，兼顾时间成本，选择处理6h作为最优处理时间。
3、α-半乳糖苷酶处理时间的筛选：
为进一步降低本发明制备的肌腱的免疫原性，将依照2.1方法A组处理条件制备的肌腱用α-半乳糖苷酶作进一步处理。
3.1方法
（1）取16片按照1.1步骤（1）和步骤（2）制备的压缩率为80%的小牛肌腱(长4-6cm,宽1.5-3cm，厚0.8-1.2mm)，随机分为4组（每组4片）；
（2）作反复冻融处理；
（3）按2.1节A组方法处理；
（4）用α-半乳糖苷酶处理6h、12h、18h、24h（A组、B组、C组、D组）：将核酸酶处理后的片状肌腱放入含有5U/mlα-半乳糖苷酶的离心管内，封口，置于26℃恒温摇床震荡后6h、12h、18h、24h；处理完毕后将各组材料PBS清洗5次，每次30min；
（5）α-gal含量的检测：将各组α-半乳糖苷酶处理后的肌腱材料冻干，球磨，称重，置于10ml的手动匀浆器内（约50mg干粉）；PBS作溶剂稀释（约1ml,分5次，每次加入200μl），4℃匀浆（每管约3h）；取出匀浆，6000g4℃离心5min，取上清液-20℃保存以备用；按Humanα-galactoyl,Gal ELISA Kit试剂说明书中方法进行检测。
3.2结果
α-gal含量检测结果如表2和图4所示：
表2本发明不同处理时间的α-gal残留量
| 组别 | α-gal残留量（pg/mg） |
| A（6hα-半乳糖苷酶处理） | 7.30±2.24 |
| B（12hα-半乳糖苷酶处理） | 9.07±3.58 |
| C（18hα-半乳糖苷酶处理） | 9.80±3.67 |
| D（24hα-半乳糖苷酶处理） | 5.84±0.49 |
统计结果显示，各组组间比较差异无统计学意义（P>0.05）（如图4所示）。
如表2和图4所示，本发明方法中，α-半乳糖苷酶处理6～24h时，α-gal的残留量均非常少，随着核酸酶处理时间延长，α-gal残留量下降，但下降幅度不明显，兼顾时间成本，选择处理6h作为最优处理时间。
实施例11本发明方法制备的脱细胞肌腱材料理化性能的检测
1、材料处理及分组
60片以80%压缩率压缩后的小牛肌腱片状材料随机分为4组（每组15片）。参照实施例10中的处理条件：
一组不作任何处理（A组）；
一组进行反复冻融（B组）：将肌腱片置于耐低温的橡胶盒内，注入液氮，1min后快速转移至盛有37℃生理盐水的烧杯内，并置于37℃恒温水浴锅内复温5min，反复冻融5次。
一组进行反复冻融+核酸酶（C组，本发明方法）：将肌腱片置于耐低温的橡胶盒内，注入液氮，1min后快速转移至盛有37℃生理盐水的烧杯内，并置于37℃恒温水浴锅内复温5min，反复冻融5次；将反复冻融后的肌腱放入含有150IU/ml的DNase和100μg/ml的RNase的PBS溶液的离心管内，封口，置于37℃恒温摇床震荡后6h；处理完毕后将各组材料PBS清洗5次，每次30min。
一组进行反复冻融+核酸酶+α-半乳糖苷酶（D组，本发明方法）：将肌腱片置于耐低温的橡胶盒内，注入液氮，1min后快速转移至盛有37℃生理盐水的烧杯内，并置于37℃恒温水浴锅内复温5min，反复冻融5次；将反复冻融后的肌腱放入含有150IU/ml的DNase和100μg/ml的RNase的PBS溶液的离心管内，封口，置于37℃恒温摇床震荡后6h；处理完毕后将各组材料PBS清洗5次，每次30min；将核酸酶处理后的片状肌腱放入含有5U/mlα-半乳糖苷酶的离心管内，封口，置于26℃恒温摇床震荡后6h；处理完毕后将各组材料PBS清洗5次，每次30min。
2、实验方法
2.1脱细胞效果检测及肌腱结构、组分的检测
2.1.1H&E和DAPI染色观察
参照常规方法染色、采图。
2.12免疫组化观察
常规方法作免疫组织化学染色处理，检测FN、DCN、α-gal含量。
2.1.3天狼星红、阿利新蓝染色检测胶原结构及不同胶原比例
取肌腱石蜡切片，按常规天狼星红、阿利新蓝染色法进行染色处理，观察，采图。
2.1.4FT-IR分析
将A、B、C、D四组材料分别冻干、球磨；每组各称取1g用称量纸包好，并作好标记；待分析样品送往四川大学望江校区分析测试中心分析。
2.1.5TGF-β1、bFGF、DCN和GAGs含量检测
2.1.5.1Elisa法检测TGF-β1、bFGF、DCN的含量
参照说明书中的检测方法进行。
2.1.5.2DMMB法检测GAGs含量
常规方法检测，简述为：取各组材料冻干、称重、球磨；木瓜蛋白酶65℃消化24h；加入0.1mol/l的硫酸钠，以硫酸软骨素作为标准，使用DMMB法，加入2.5mlDMMB混匀，525nm波长条件下比色，测定吸光度（OD值）；作出GAGs含量标准曲线。据标准曲线计算样本中GAGs的浓度。
2.3力学性能检测方法
（1）各组随机取8根肌腱，修成长为4cm的肌腱节段；PBS清洗3次，每次5min，游标卡尺测量各肌腱的宽度、厚度。
（2）用砂纸包住肌腱切片两端，固定到生物力学试验机的夹具上，游标卡尺测量拉伸前样本的初始长度（两夹具之间的长度）。
（3）以5mm/min的加载速度进行单轴拉伸实验，直到载荷值下降至最大值的50%时终止。
（4）根据系统采集的拉伸载荷和位移数值，结合样本的初始长度、宽度和厚度，计算各样本的拉伸强度、刚度、断裂应变和弹性模量。
3、结果
3.1本发明方法制备的材料的免疫原性物质检测
H&E和DAPI染色观察显示（如图5所示），C组和D组（本发明方法制备的材料）中，核物质几乎消失不见，而A组和B组则可见明显核物质，说明本发明方法可以有效去除核物质，降低免疫原性。
3.2本发明方法制备的材料的结构分析
如图6所示，FN（纤维连接蛋白）和DCN（核心蛋白聚糖）均沿胶原纤维弥散分布，处理前后无明显变化。
天狼星红染色观察显示，经核酸酶和α-半乳糖苷酶处理后，胶原略疏松，ColⅠ（I型胶原）（红色）无明显变化，而ColⅢ（Ⅲ型胶原）（黄绿色）略微减少(如图7所示)；阿利新蓝染色观察显示，GAGs（糖胺聚糖）（浅蓝色）也无明显变化（如图8所示）。
实验结果说明，采用本发明方法处理肌腱，肌腱的核心成分纤维连接蛋白、核心蛋白聚糖、I型胶原、Ⅲ型胶原和粘多糖均可以有效保留。
3.3本发明方法制备的材料的内部官能团分析
从FT-IR分析图谱可看出，肌腱组织中两个特殊的官能团羰基（吸收峰1676cm-1）和亚氨基（吸收峰3437cm-1）在处理前后没有消失或破坏(如图9所示)。
实验结果说明，采用本发明方法处理肌腱，肌腱组织中的官能团不会被破坏，其亲水性能不会发生变化。
3.4生长因子TGF-β1、bFGF、DCN和GAGs含量检测结果
生长因子TGF-β1、bFGF、DCN和GAGs含量检测结果如表3所示：
表3TGF-β1、bFGF、DCN和GAGs含量检测结果（n=8，均值±标准差﹟表示差异有统计学意义）
经统计学比较，仅DCN含量D组明显低于A组，其它各组之间无差异（P>0.05）。GAGs、b-FGF、TGF-β1的含量值四组之间有差异，但差异无统计学意义（P>0.05）（如表3所示）。
实验结果说明，本发明方法（不包括α-半乳糖苷酶处理步骤，C组）不会影响肌腱中生长因子的含量，本发明方法（包括α-半乳糖苷酶处理步骤，D组）对生长因子含量有影响，但影响不大。
3.5力学性能
力学性能检测结果如表4所示：
表4力学性能检测结果（各组样本量n=8，均值±标准差﹟表示差异有统计学意义）
统计比较后：强度、断裂应变、和弹性模量值组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；刚度值比较时，C、D组明显低于A组(P<0.05)，其余各组之间差异无统计学意义（P>0.05）。
本发明方法处理后，肌腱的强度、断裂应变和弹性模量无明显变化，说明本发明方法不会明显影响肌腱的力学性能。
实验结果说明，采用本发明方法制备脱细胞肌腱材料，细胞核等免疫原性物质残留较少，肌腱的核心成分纤维连接蛋白、核心蛋白聚糖、I型胶原、Ⅲ型胶原以及粘多糖均未明显减少，DCN、GAGs、bFGF、TGF-β1等生长因子的损失较少，肌腱内部的化学官能团未受影响，力学性能也未明显下降，说明本发明方法既可以有效去除肌腱组织中的免疫原性物质，又可以有效保留肌腱的超微结构、生物力学性能和生物活性因子。
实施例12本发明制备的小牛脱细胞肌腱体内植入炎性反应的评价
1.材料与方法
1.1主要材料、试剂及仪器
SPF清洁级雄性SD大鼠（体重300～350g）（成都达硕生物科技公司）；可吸收性聚乙醇酸修补材料PGA（50×50×0.3mm3）（北京鼎永恒晟科技有限公司）；水合氯醛（四川大学华西科技园动物实验中心提供）；带线缝合针（成都溶海生物科技公司）；手术器械（国产）；高压蒸锅（Leica公司，德国）。
1.2方法和检测指标
1.2.1材料的预处理
将依据实施例11同样的方法制备的四组材料分别冻干，修剪成0.3×10mm2大小，另将聚乙醇酸PGA修剪成相同大小，密封包装，环氧乙烷消毒后备用。
1.2.2皮下植入实验
SPF清洁级雄性SD大鼠（体重300～350g）共60只。随机分为4组，每组15只，每只动物同时植入一片肌腱材料和一片PGA材料（左右两侧，如图10所示）。实验动物术前称重，麻醉，备皮，消毒；用手术刀在动物背部靠近脊柱处皮肤上划一道小口；用止血钳钝性分别向左右两侧分离皮下的筋膜；用镊子将预润湿的材料放入皮下，尽量使材料平铺，如图12所示，左侧为肌腱材料，右侧为PGA材料，且材料离划口的距离应大于1cm；依次缝合筋膜、皮肤。缝合伤口消毒，放入笼中，作好标记和记录。
1.2.3动物取材
分1W、4W、8W三个时间点取材，共4个组，保证每个组每个时间点 至少有三只动物。具体操作如下：动物安乐处死，备皮，将动物背部的皮肤全部打开；找到材料所在的位置，将材料连带皮肤取下来，4%多聚甲醛固定。
1.2.4H&E染色观察
常规染色方法。
2.结果
2.1动物取材大体观察
从图11中（箭头所示为材料的位置）可以看出，1W时肌腱材料和PGA材料很明显，无降解；4W时出现部分降解；8W时降解十分明显。
2.2H&E染色观察
H&E染色观察发现，术后1W、4W时，各组材料内部均存在炎性细胞，阴性对照PGA材料组的炎性细胞最少，C、D组（本发明方法制备的材料）的炎性细胞稍多，但明显少于A、B组，C、D之间无明显差别；8W时各组材料内部炎性细胞几乎消失不见，材料亦大部分降解（如图12所示）。
实验结果说明，本发明方法制备的脱细胞肌腱材料，用于大鼠体内修复，引起的炎性反应均小，免疫原性低，体内生物相容较好。
实施例13本发明方法与现有方法制备的肌腱的免疫原性比较实验
1、实验方法
取新鲜新生小牛跟腱80根，随机分为5组（n=16），分别作如下处理：
A组：新鲜正常肌腱为正常对照组；
B组：反复冻融（液氮/37℃复温）结合核酸酶处理24h，作为对照组1，方法同江燕林等，“脱细胞小牛肌腱组织形态学和生物力学特性研究”，中国修复重建外科杂志,2013,27(5):71-76公开的方法；
C组：反复冻融结合核酸酶处理后，再用α-半乳糖甘酶处理24h，作为对照组2，方法同江燕林等，“异种脱细胞肌腱生物支架的生物力学特性研究”，医用生物力学，2012,27(10):370公开的方法；
D组：采用本发明实施例10第2节D组方法（压缩+冻融+24h核酸酶处理），作为本发明实验组1；
E组：采用压缩+冻融+24h核酸酶处理+α半乳糖苷酶处理24h的方法，作为本发明实验组2。
B组、C组、D组和E组中，涉及的压缩、冻融、核酸酶处理和α半乳糖苷酶处理的操作步骤同实施例10。
其中4根用于形态学和组织学观察,其余12根用于生物力学、DNA含量和α-半乳糖基抗原含量检测。
2、实验结果
1、DNA残留量
采用不同方法处理后，肌腱的DNA残留量比较如下表5：
表5不同处理方法的DNA残留量
| 组别 | DNA残留量（ng/mg） |
| A组（正常对照） | 240±120 |
| B组（对照组1） | 50±20 |
| C组（对照组2） | 40±20 |
| D组（实验组1） | 0.99±0.34 |
| E组（实验组2） | 1.02±0.47 |
如上表所示，正常肌腱中，DNA含量高达240ng/mg（A组），采用现有方法处理，DNA含量大幅下降，但是DNA含量仍然高达40ng/m（B组）或50ng/mg（C组）。
而采用本发明方法处理后，制得的肌腱DNA残留量仅为0.994ng/mg（D组）或1.02ng/mg（E组），是现有方法制备的肌腱DNA残留量的2.0～2.6%或，差异非常显著。其中，本发明方法中，D组和E组的DNA残留量无明显差别，说明α-半乳糖苷酶处理对DNA残留量的影响不大。
2、α-gal残留量
采用不同方法处理后，肌腱的α-gal残留量比较如下表6：
表6不同处理方法的α-gal残留量
| 组别 | α-gal残留量（pg/mg） |
| A组（正常对照） | 27.5±2.25 |
| B组（对照组1） | 26.75±2.79 |
| C组（对照组2） | 8.9±2.26 |
| D组（实验组1） | 23.30±1.12 |
| E组（实验组2） | 5.84±0.49 |
如上表所示，正常肌腱中，α-gal含量高达27.5pg/mg，若不采用α半乳糖苷酶处理，其含量仍然较高（B组和D组），而采用α半乳糖苷酶处理后，其含量显著降低（C组和E组）。
α-gal仅导致灵长类动物发生免疫排斥反应，因此制备用于修复灵长类动物的脱细胞肌腱时，应当采用压缩+冻融+核酸酶+α半乳糖苷酶处理的方式制备本发明肌腱，而制备用于修复非灵长类动物的脱细胞肌腱时，可以采用压缩+反复冻融+核酸酶处理的方式制备本发明肌腱。
综上，本发明通过压缩，结合反复冻融、核酸酶处理的方式制备脱细胞肌腱，可以在显著降低肌腱的免疫原性的同时，有效保留肌腱的天然结构和生物活性因子，成本低廉，具有较好的应用前景。
Claims (9)
1.一种制备脱细胞肌腱材料的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取新鲜肌腱，清洗；
(2)将肌腱沿厚度方向进行压缩，压缩率为60～90％；
(3)对步骤(2)压缩后的肌腱进行反复冻融；所述反复冻融是将步骤(2)压缩后的肌腱置于液氮中1～3min，25～37℃放置3～10min，重复操作4～6次。
(4)将步骤(3)处理后的肌腱用核酸酶处理，清洗，即可；
核酸酶处理的方法为：取步骤(3)处理后的肌腱，置于DNase浓度为120～180IU/ml和RNase浓度为80～120μg/ml的核酸酶溶液中，室温或37℃恒温处理6～24h。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，所述压缩率为70～80％。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述反复冻融是将步骤(2)压缩后的肌腱置于液氮中1min，37℃放置5min，重复操作5次。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述核酸酶溶液中，Dnase的浓度为150IU/ml，Rnase的浓度为100μg/ml；所述处理的温度为37℃，处理的时间为6h。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下处理步骤：取步骤(4)处理后的肌腱，置于α-半乳糖苷酶浓度为3～8U/ml的溶液中，15～40℃处理6～24h。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述溶液中，α-半乳糖苷酶的浓度为5U/ml；所述处理的温度为26℃，所述处理的时间为6h。
7.权利要求1～6任意一项所述方法制备的脱细胞肌腱材料。
8.权利要求7所述的脱细胞肌腱材料在制备治疗软组织缺损修复材料中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述软组织缺损修复材料是肌腱组织或韧带组织缺损修复材料。
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