CN103301508B - 一种医用软骨支架材料的制备方法 - Google Patents
一种医用软骨支架材料的制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种医用软骨支架材料的制备方法，它制备方法包括以下操作步骤：软骨组织的前置处理分离与初洗、病毒灭活、脱细胞、氯化钠处理、成型、包装灭菌。用该方法制备的医用软骨支架材料完全去除了动物源细胞成分和DNA成分，同时完整地保留了天然ECM的成分、三维结构，无内毒素、有机溶剂和有毒溶剂残留，具有适应细胞长入和软骨组织再生的孔隙率，并具有理想的力学性能。
Description
技术领域
本发明涉及医用生物材料技术领域，具体涉及一种医用软骨支架材料的制备方法。
背景技术
软骨组织由软骨细胞和软骨基质组成，软骨基质由胶原和软骨粘蛋白等大分子组成。软骨组织分布于关节面、耳、鼻、椎间盘、气管环等部位，其作用是维持关节正常功能、支撑器官形态和功能等。由于软骨内无血管分布，且软骨细胞被周围基质成分所包围，因此软骨损伤后自身修复能力极差，特别是关节软骨损伤，通常会发生不可逆的病理过程，引起关节功能改变。如何有效地修复损伤的关节软骨是众所周知的难题。自体软骨来源有限,且容易造成供区缺损,应用受到限制。异体软骨应用可引起免疫排斥反应，而导致细胞死亡及功能丧失。随着组织工程学和生物材料学的发展，已有人工软骨支架材料用于软骨修复，包括聚乳酸、聚羟基乳酸、聚乳酸-聚羟基乙酸共聚物等人工合成的高分子聚合物。但上述人工高分子材料的结构及组成均与软骨组织相差甚远，只能在短期内起到替代和支撑作用，不能促进软骨再生，实现功能修复，并且，植入后均难以降解，其稳定性、组织毒性反应及致癌性等均难以控制。
在欧美发达国家，医用软骨支架材料正进入重大产业革命时期，即从传统的不可吸收材料向可降解的、能够主动诱导组织再生的新型生物材料变革。而基于组织工程学原理的以动物组织为原料的脱细胞细胞外基质(extracellular matrix，ECM)材料是主要发展方向。ECM是由多种大分子物质如胶原、非胶原糖蛋白、氨基聚糖、蛋白聚糖、弹性蛋白等成分，按一定比例和结构建成的复杂的有机的三维整体，为各种细胞的生存及活动提供适宜的场所和微环境，能够调节各种细胞的生长、形状、代谢、迁移、增殖和分化，进而调控组织和器官功能。组织缺损的一个严重后果是“土壤”—ECM的丧失，这也是机体自身无法实现组织修复和再生的原因。天然的ECM可以作为组织再生的“土壤”，是理想的组织修复材料。去除动物组织的细胞成分可以去除大部分的免疫原性，并保留ECM成分，可以开发出理想的组织修复材料。因此，脱细胞ECM材料的研究成为软骨支架材料的重点研究方向。
但是，到目前为止，尚没有脱细胞ECM材料用于临床。现有的脱细胞ECM材料的制备过程主要是以Courtman等提出的四步法为基础，即冻干-去污剂-酶法。此类方法存在的问题包括：(1)去免疫原性不彻底：由于软骨组织是致密的硬组织，溶液无法完全渗入组织内部，脱落的细胞碎片也无法完全洗脱，导致了材料里大量的细胞和细胞碎片残留；并且，上述工艺也不能完全去除所有的动物源性DNA成分。细胞成分和DNA的残留会导致免疫反应。(2)有毒物质残留：已有的工艺均使用有机去污剂和活性酶，无法完全去除，材料中均有大量残留，上述物质均有细胞毒性，不利于细胞生长和软骨组织再生。(3)由于软骨组织致密，上述四步法工艺制备的脱细胞ECM材料不能实现理想的孔隙率，细胞无法长入材料内部；为了解决这一问题，部分改良工艺先将软骨组织粉碎后再压制成型，这种方法又不能实现软骨组织的力学性能。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种医用软骨支架材料的制备方法，用该方法制备的医用软骨支架材料完全去除了动物源细胞成分和DNA成分，同时完整地保留了天然ECM的成分、三维结构，无内毒素、有机溶剂和有毒溶剂残留，具有适应细胞长入和软骨组织再生的孔隙率，并具有理想的力学性能。
本发明所采用的技术方案为：
一种医用软骨支架材料的制备方法，包括以下操作步骤：
(1)软骨组织的前置处理分离与初洗
取新鲜动物的肋软骨组织清洗洁净，去除骨膜，切割成0.5～4cm厚的条形，使用注射用水冲洗3遍。作为优选，所述动物为猪、牛、马中的一种，进一步优选为猪。
(2)病毒灭活
采用低浓度过氧乙酸-乙醇溶液法灭活病毒，该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，其中过氧乙酸的体积百分含量为0.05～0.2％(优选为0.1％)，灭活时间为1～2h(优选为1h)，温度范围为4～40℃，然后在磷酸盐缓冲液中清洗2～5次，每次15min，检测清洗后的磷酸盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后，以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5μm/s以下时终止。该步骤中磷酸盐缓冲液的配制方法为称7.9g NaCl、0.2g KCl、0.24g KH2PO4、1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，然后加蒸馏水定容至1L。
(3)脱细胞
该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，首先将材料置入清洗槽中，在清洗槽中注入含有乙二胺四乙酸和氢氧化钠的溶液，开启清洗器，清洗时间为5～30min(优选为20min)，其中乙二胺四乙酸浓度为10～200mmol/L(优选为50～100mmol/L，进一步优选为100mmol/L)，氢氧化钠溶液浓度为5～100mmol/L(优选为5～20mmol/L，进一步优选为10mmol/L)，然后关闭清洗器，将氢氧化钠溶液倾出，注入磷酸盐缓冲液，开启清洗器，清洗时间为0.5～24min(优选为1～12min)，磷酸盐缓冲液清洗重复2～5次，检测清洗后的磷酸盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后，流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5μm/s以下时终止。该步骤中磷酸盐缓冲液的配制方法同步骤2。
(4)氯化钠处理
该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，将氯化钠溶液注入清洗槽中，开启清洗器，清洗时间为5～30min(优选为20min)，氯化钠溶液浓度为0.015mol/L或2mol/L(优选为0.015mol/L)、pH值不超过7.8，然后以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5μm/s以下时终止。
(5)成型
将材料放于冷冻干燥机中，按照预先设计的冻干流程进行冷冻干燥：预冻至-25～-50℃(优选为-25℃)，保温0.5～4小时(优选为2h)，升温15℃，保温4～12小时(优选为8h)，升温15℃，保温0.5～4小时(优选为2h)，升温至25℃，保温4小时，冻干完成后，使用激光微孔打孔机打孔，孔径范围为0.05～1mm(优选为0.2～0.5mm)，孔间隔为0.1～10mm(优选为0.5～2mm)。所述的激光微孔打孔是指利用激光技术将材料打出微米级的小孔，使用激光微孔打孔机打孔是为了使材料表面形成孔隙，以利于组织修复。
(6)包装灭菌
在无菌的状态下进行包装，一层采用特卫强纸、另一层采用聚乙烯塑料，包装完成后采用环氧乙烷进行灭菌。
作为优选，所述步骤(2)、(3)、(4)中清洗槽振荡频率为100～300rpm，进一步优选为200rpm。
作为优选，所述步骤(2)、(3)、(4)中超声波频率为20～80KHZ，进一步优选为45KHZ。
本发明中注射用水的使用标准依照国家药典中规定。
本发明中所述的清洗槽可振荡的超声波清洗机是将传统超声波清洗机的清洗槽与机械震荡器相结合，使清洗槽能够在超声波清洗的同时发生机械震荡，实现了机械振荡与超声波清洗同时联合发挥作用。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：本发明使用一种清洗槽可振荡的超声波清洗机，实现了机械振荡与超声波清洗同时性联合发挥作用，提高了医用软骨支架材料制备中病毒灭活工艺、脱细胞工艺和清除动物源DNA工艺的效率，大大降低了工艺耗时，简化了工艺流程，整个制备过程仅使用过氧乙酸-乙醇、乙二胺四乙酸、氢氧化钠和氯化钠4种溶液，浓度均远远低于现有的制备技术，上述4种溶液均为中国药店收录的药用辅料或溶剂，无细胞毒性，其残留量均符合药典规定的标准，使制备的材料完全去除了免疫原性，完整保留了天然ECM的结构和生长因子等有效成分；并且，在成型工艺中创新性地将冷冻干燥技术和激光微孔技术有效结合，在不破坏天然ECM三维结构的前提下，使材料具有与天然软骨组织相同的力学强度。
附图说明
图1所示的是本发明实施例1所制备的材料的结构示意图；
图2所示的是本发明实施例2中的光学显微镜图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
实施例1：医用软骨支架材料的制备
(1)软骨组织的前置处理分离与初洗
取新鲜屠宰的猪的肋软骨组织清洗洁净，去除骨膜，切割成0.5～4cm厚的条形，使用注射用水冲洗3遍。
(2)病毒灭活
采用低浓度过氧乙酸-乙醇溶液法灭活病毒，该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，其中过氧乙酸的体积百分含量为0.05～0.2％(优选为0.1％)，灭活时间为1～2h(优选为1h)，温度范围为4～40℃，然后在磷酸盐缓冲液中清洗2～5次，每次15min，检测清洗后的磷酸盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后，以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5μm/s以下时终止。该步骤中磷酸盐缓冲液的配制方法为称7.9g NaCl、0.2g KCl、0.24g KH2PO4、1.8g K2HPO4，溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，然后加蒸馏水定容至1L。清洗槽振荡频率为100～300rpm，进一步优选为200rpm。超声波频率为20～80KHZ，进一步优选为45KHZ。
(3)脱细胞
该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，首先将材料置入清洗槽中，在清洗槽中注入含有乙二胺四乙酸和氢氧化钠的溶液，开启清洗器，清洗时间为5～30min(优选为20min)，其中乙二胺四乙酸浓度为10～200mmol/L(优选为50～100mmol/L，进一步优选为100mmol/L)，氢氧化钠溶液浓度为5～100mmol/L(优选为5～20mmol/L，进一步优选为10mmol/L)，然后关闭清洗器，将氢氧化钠溶液倾出，注入磷酸盐缓冲液，开启清洗器，清洗时间为0.5～24min(优选为1～12min)，磷酸盐缓冲液清洗重复2～5次，检测清洗后的磷酸盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后，流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5μm/s以下时终止。该步骤中磷酸盐缓冲液的配制方法同步骤2。清洗槽振荡频率为100～300rpm，进一步优选为200rpm。超声波频率为20～80KHZ，进一步优选为45KHZ。
(4)氯化钠处理
该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，将氯化钠溶液注入清洗槽中，开启清洗器，清洗时间为5～30min(优选为20min)，氯化钠溶液浓度为0.015mol/L或2mol/L(优选为0.015mol/L)、pH值不超过7.8，然后以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5μm/s以下时终止。清洗槽振荡频率为100～300rpm，进一步优选为200rpm。超声波频率为20～80KHZ，进一步优选为45KHZ。
(5)成型
将材料放于冷冻干燥机中，按照预先设计的冻干流程进行冷冻干燥：预冻至-25～-50℃(优选为-25℃)，保温0.5～4小时(优选为2h)，升温15℃，保温4～12小时(优选为8h)，升温15℃，保温0.5～4小时(优选为2h)，升温至25℃，保温4小时，冻干完成后，使用激光微孔打孔机打孔，孔径范围为0.05～1mm(优选为0.2～0.5mm)，孔间隔为0.1～10mm(优选为0.5～2mm)。
(6)包装灭菌
在无菌的状态下进行包装，一层采用特卫强纸、另一层采用聚乙烯塑料，包装完成后采用环氧乙烷进行灭菌，成品如图1所示。
实施例2：实施例1所制备的医用软骨支架材料的物理性能、化学性能、组织学和生物学性能检测
1.物理性能检测
1)力学性能检测
制备实施例1所提供的材料、Courtman的四步法所制备的材料和未经脱细胞处理的天然猪肋软骨组织，每组材料各取3个样本，磷酸盐缓冲液浸泡30分钟后，采用多功能力学测定仪进行压缩模量检测，按照公式计算压缩模量。压缩模量＝ΔP/A×L/ΔL(ΔP代表压力-位移曲线线性段的两点间压差，A代表接受测试材料的面积，L代表材料的厚度，ΔL代表上述两点间的位移)。结果显示：实施例1提供的材料的压缩模量为(24.83±0.78)MPa，Courtman的四步法所制备的材料的压缩模量为(14.35±2.46)MPa，差异有统计学意义；而未经处理的天然猪肋软骨组织的压缩模量为(25.47±1.21)MPa，与实施例1提供的材料差异无统计学意义。
2)孔隙率测定
采用压汞法检测，并与Courtman的四步法所制备的材料进行对比。实施例1所提供的材料的平均孔隙率为91.45％，平均孔径为210μm，而Courtman的四步法所制备的材料的平均孔隙率为67.25％，平均孔径为58μm。
2.化学性能检测
1)检验液制备：检验液制备：取样品的厚度均匀部分，切成1cm2的碎片，用水洗净后晾干，然后加入玻璃容器中，按样品内外总表面积(cm2)与水(mL)的比为5：1的比例加水，加盖后置于压力蒸汽灭菌器中，在121℃±1℃加热30min，加热结束后将样品与液体分离，冷至室温作为检验液。取同体积水置于玻璃容器中，同法制备空白对照液。
2)病毒检测：方法：选择伪狂犬病毒为指示病毒，采用实时定量PCR法检测病毒DNA拷贝数，检测3批样品。结果：病毒DNA拷贝数0。
3)酸碱度检测：按GB/T14233.1(《医用输液、输血、注射器具检验方法第1部分：化学分析方法》)中5.4.1中规定的方法试验，结果：检验液与空白对照液的PH值之差不超过1.5。
4)内毒素：按6cm2样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质：生理盐水。按GB/T 14233.2-2005(《医用输液、输血、注射器具检验方法第2部分:生物学试验方法》)规定的方法进行，检测3批样品。结果：内毒素含量小于5EU/g。5)DNA残留量检测：依据生物制剂残留DNA检测方法(《中国药典》2010，附录IX－B外源性DNA残留量测定法)，采用荧光染色法检测实施例1所提供的样品的DNA残留量，并与Courtman的四步法所制备的材料进行对比。结果：实施例1所提供的样品的DNA残留量为113±4.5pg/g，Courtman的四步法所制备的材料的DNA残留量为325±35pg/g，差异具有显著性。
3.组织学检测
1)光学显微镜观察：方法：石蜡包膜后的材料行苏木精—伊红染色，倒置相差显微镜观察。结果：无细胞和细胞碎片残留，胶原显微连续无断裂，如图2所示。
2)超微结构观察。结果：材料呈多孔结构，纤维无断裂，孔径均匀，平均孔径大小为200um，孔隙率大于85％。
4.生物学性能检测
1)细胞毒性：方法：按6cm2样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，24±2hr制备试验液，浸提介质:含血清的MEM培养基。取试验液按照GB/T16886.5-2003(《医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验》)中规定的试验方法进行试验。结果：细胞毒性反应小于或等于1级。
2)迟发型超敏反应：方法：按6cm2样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质为生理盐水和棉籽油。按照GB/T 16886.10-2005(《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》)试验方法规定进行试验。结果：无迟发型超敏反应。
3)皮内反应：按6cm2样品加1ml浸提介质的比例，37±1℃，72±2hr制备试验液，浸提介质为生理盐水和棉籽油。按照GB/T 16886.10-2005(《医疗器械生物学评价第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验》)试验方法规定进行试验。结果：试验样品与溶剂对照平均记分之差小于1.0。
本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
Claims (15)
1.一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于包括以下操作步骤：
(1)软骨组织的前置处理分离与初洗
取新鲜动物的肋软骨组织清洗洁净，去除骨膜，切割成0.5～4cm厚的条形，使用注射用水冲洗3遍；
(2)病毒灭活
采用低浓度过氧乙酸-乙醇溶液法灭活病毒，该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，其中过氧乙酸的体积百分含量为0.05～0.2％，灭活时间为1h，温度范围为4～40℃；然后在磷酸盐缓冲液中清洗2～5次，每次15min，检测清洗后的磷酸盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后，以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5μm/s以下时终止；
(3)脱细胞
该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，首先将材料置入清洗槽中，在清洗槽中注入含有乙二胺四乙酸和氢氧化钠的溶液，开启清洗器，清洗时间为20min，其中乙二胺四乙酸浓度为10～200mmol/L，氢氧化钠溶液浓度为5～100mmol/L，然后关闭清洗器，将氢氧化钠溶液倾出，注入磷酸盐缓冲液，开启清洗器，清洗时间为1～12min，磷酸盐缓冲液清洗重复2～5次，检测清洗后的磷酸盐缓冲液的pH值，当pH达到6.5-7.5后，流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5μm/s以下时终止；
(4)氯化钠处理
该步骤在清洗槽可振荡的恒温超声波清洗器中进行，将氯化钠溶液注入清洗槽中，开启清洗器，清洗时间为20min，氯化钠溶液浓度为0.015mol/L、pH值不超过7.8，然后以流动的注射用水清洗材料，检测电导率达到1.5μm/s以下时终止；
(5)成型
将材料放于冷冻干燥机中，按照预先设计的冻干流程进行冷冻干燥：预冻至-25～-50℃，保温0.5～4小时，升温15℃，保温4～12小时，升温15℃，保温0.5～4小时，升温至25℃，保温4小时，冻干完成后，使用激光微孔打孔机打孔，孔径范围为0.05～1mm，孔间隔为0.1～10mm；
(6)包装灭菌
在无菌的状态下进行包装，一层采用特卫强纸、另一层采用聚乙烯塑料，包装完成后采用环氧乙烷进行灭菌。
2.根据权利要求1所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的动物为猪、牛、马中的一种。
3.根据权利要求2所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的动物为猪。
4.根据权利要求1所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中过氧乙酸的体积百分含量为0.1％。
5.根据权利要求1所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中乙二胺四乙酸浓度为50～100mmol/L。
6.根据权利要求5所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中乙二胺四乙酸浓度为100mmol/L。
7.根据权利要求1所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中氢氧化钠浓度为5～20mmol/L。
8.根据权利要求7所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中氢氧化钠浓度为10mmol/L。
9.根据权利要求1所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)、(4)中清洗槽振荡频率为100～300rpm。
10.根据权利要求9所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)、(4)中清洗槽振荡频率为200rpm。
11.根据权利要求1所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)、(4)中超声波频率为20～80KHZ。
12.根据权利要求11所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)、(3)、(4)中超声波频率为45KHZ。
13.根据权利要求1所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中预先设计的冻干流程为：预冻至-25℃，保温2h，升温15℃，保温8h，升温15℃，保温2h，升温至25℃，保温4小时。
14.根据权利要求1所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中激光微孔打孔机打孔的孔径范围为0.2～0.5mm。
15.根据权利要求1所述的一种医用软骨支架材料的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中激光微孔打孔机打孔的孔间隔为0.5～2mm。
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2013
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Also Published As
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