CN115737930A - 一种全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法，全层多孔骨软骨组织工程支架由全层骨软骨组织材料经过脱细胞化、激光打孔以及超声消化扩孔后得到；所述全层多孔骨软骨组织工程支架包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层。本发明提供的一种全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法，在结构层次上、力学性能和成分组成上高度和天然骨软骨接近，同时可以给种子细胞提供良好的接种环境。

Description

一种全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体来说，涉及一种全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法。
背景技术
对于外伤或疾病引起的骨软骨缺损修复是临床治疗的难题，应用组织工程技术构建组织工程软骨支架被认为是解决这一问题最好的技术手段。采用人工材料制作的支架，没有达到高仿生效果，对于骨软骨损伤的修复效果仍有改进的空间。自体骨软骨移植是取出自身关节非承重部分的骨软骨块放入关节缺损区域，被认为是缺损修复的金标准方法。自体骨软骨移植术优异的修复效果是由于其力学性能、层状结构和生物活性物质组成与自身天然骨软骨组织非常接近。但缺点是对非负重区造成损害，供区来源有限。因此，使用异体骨软骨组织块移植被用于修复缺损，但由于免疫原性引起的骨吸收等并发症时常导致修复失败。众所周知，同种异体骨软骨复合组织块的免疫原性主要来自其细胞成分。以往的研究表明，脱细胞后，脱细胞组织块的免疫原性大大降低。有人提出，异种组织脱细胞后可以达到同样的低免疫原性。因此去细胞化的同种异体或异种骨软骨组织块，接种自身的干细胞，能够达到接近自体骨软骨移植的修复效果。但脱细胞后软骨层的孔隙率过低，无法满足软骨组织工程支架的要求。因此，本领域迫切需要一种在结构层次上，力学性能上，成分组成上高度和天然骨软骨单元接近的骨软骨全层修复支架，同时可以给种子细胞提供良好的接种环境的制备技术和修复方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是：一种全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法，在结构层次上、力学性能和成分组成上高度和天然骨软骨接近，同时可以给种子细胞提供良好的接种环境。
为解决上述技术问题，本发明实施例采用如下技术方案：
第一方面，本发明实施例提供一种全层多孔骨软骨组织工程支架，由全层骨软骨组织材料经过脱细胞化、激光打孔以及超声消化扩孔后得到；所述全层多孔骨软骨组织工程支架包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层。
作为本发明实施例的进一步改进，所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨层的厚度为0.2～2mm，孔隙率为50～60％，压缩模量为0.5～2Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2～1mm，孔隙率为65～80％，压缩模量为20～50Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2～4mm，孔隙率为65～85％，压缩模量为20～40Mpa。
作为本发明实施例的进一步改进，所述全层骨软骨组织材料为从同种异体或异种动物体中获取。
第二方面，本发明实施例提供一种全层多孔骨软骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤10)获取全层骨软骨组织材料，所述全层骨软骨组织材料包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层；
步骤20)将所述全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理；
步骤30)对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔；
步骤40)将激光打孔后的全层骨软骨组织材料放入氢氧化钠溶液中，并在超声波中进行超声消化，得到全层多孔骨软骨组织工程支架。
作为本发明实施例的进一步改进，激光打孔的孔径为150～200um，孔间距为150～200um，孔深度为500～1000um。
作为本发明实施例的进一步改进，所述步骤40)中，氢氧化钠溶液的浓度为0.5～1M。
作为本发明实施例的进一步改进，步骤40)中，超声消化的时间为120～240min。
作为本发明实施例的进一步改进，所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨层的厚度为0.2～2mm，孔隙率为50～60％，压缩模量为0.5～2Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2～1mm，孔隙率为65～80％，压缩模量为20～50Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2～4mm，孔隙率为65～85％，压缩模量为20～40Mpa。
作为本发明实施例的进一步改进，还包括：
步骤40)将体外分离培养的种子细胞接种到全层多孔骨软骨组织工程支架中。
作为本发明实施例的进一步改进，所述步骤10)中，从同种异体或异种动物体中获取全层骨软骨组织材料。
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明的全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法，从同种异体或异种动物体中获取骨软骨组织材料，相比于获取自体骨软骨，不会对非负重区造成损害，且供区来源广。相比于采用人造骨软骨，同种异体或异种动物体的骨软骨组织材料具有生物活性物质，可以促进干细胞的成软骨和成骨分化，不需后期添加。
(2)本发明的全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法，采用全层结构骨软骨组织材料，制备全层组织支架，和天然组织具备十分接近的层次结构、力学性能和生物活性成分，可以对缺损区域进行整体修复。
(3)本发明的全层多孔骨软骨组织工程支架及其制备方法，先在软骨层进行激光打孔，再利用超声消化对全层进行孔隙优化，在保证工程支架力学强度的同时获得较高孔隙率，给致密的软骨层引入了更有利于细胞粘附和迁移的三维空间结构，便于种子细胞或自身细胞的增殖，具有优异的修复效果。
附图说明
图1是本发明实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架的照片；
图2(a)是实例1制备的工程支架的软骨层的电镜图，图2(b)是实例1制备的工程支架的软骨下骨层的电镜图，图2(c)是实例1制备的工程支架的松质骨层的电镜图；
图3(a)是将体外分离培养的干细胞接种到对比例1制备的工程支架后进行DAPI染色的电镜图；图3(b)是将体外分离培养的干细胞接种到实例1制备的工程支架后进行DAPI染色的电镜图；
图4(a)是移植实例1制备的工程支架修复后的微距照片，图4(b)是移植实例1制备的工程支架修复后的电镜图，图4(c)是移植实例1制备的工程支架修复后的CT图像；图4(d)是移植对比例2得到的支架修复后的微距照片，图4(e)是移植对比例2得到的支架修复后的电镜图，图4(f)是移植对比例2得到的支架修复后的CT图像。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的技术方案进行详细的说明。
以下的说明本质上仅仅是示例性的而并不是为了限制本公开、应用或用途。应当理解的是，在全部附图中，对应的附图标记表示相同或对应的部件和特征。
本发明实施例提供一种全层多孔骨软骨组织工程支架，由全层骨软骨组织材料经过脱细胞化、激光打孔以及超声消化扩孔后得到。其中，全层多孔骨软骨组织工程支架包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层。
优选的，全层骨软骨组织材料为从同种异体或异种动物体中获取。
全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨层的厚度为0.2～2mm，孔隙率为50～60％，压缩模量为0.5～2Mpa；全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2～1mm，孔隙率为65～80％，压缩模量为20～50Mpa；全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2～4mm，孔隙率为65～85％，压缩模量为20～40Mpa。
本实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架，从同种异体或异种动物体中获取骨软骨组织材料，相比于获取自体骨软骨，不会对非负重区造成损害，且供区来源广；相比于采用人造骨软骨，同种异体或异种动物体的骨软骨组织材料具有生物活性物质，不需后期添加。本实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架，采用全层结构骨软骨组织材料，制备全层组织支架，和天然组织具备十分接近的层次结构、力学性能和生物活性成分，可以对缺损区域进行整体修复。本实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架，先对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔，提供“细胞接种池”，增加细胞接种率，避免了细胞只粘附在表面。在激光打孔后还利用超声消化进行孔隙优化，增加整体的微孔隙率，有利于接种的细胞的迁移和增殖。本实施例通过激光打孔再进行超声消化扩孔，保证力学强度的同时获得较高孔隙率，给致密的软骨层引入了更有利于细胞粘附和迁移的三维空间结构，便于种子细胞或自身细胞的增殖，具有优异的修复效果。
本发明提供一种全层多孔骨软骨组织工程支架的制备方法，包括以下步骤：
步骤10)从同种异体或异种动物体中获取全层骨软骨组织材料，全层骨软骨组织材料包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层。
步骤20)将全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理。在尽量保留原有组织结构和组成的情况下，完整地去除组织内细胞成分，可以使异体和异种来源的骨软骨组织工程支架都具有可接受的生物相容性。
步骤30)对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔。激光打孔的孔径为150～200um，孔间距为150～200um，孔深度为500～1000um。激光打孔可以在软骨层蚀刻出微孔阵列。
步骤40)将激光打孔后的全层骨软骨组织材料放入氢氧化钠溶液中，并在超声波中进行超声消化，得到全层多孔骨软骨组织工程支架。超声消化后可以给软骨层引入瓦楞状孔隙结构，孔隙大小为10～100um，这些大小孔隙可以更好的使细胞粘附和迁移。
优选的，本发明实施例方法的步骤20)中，采用物理法和化学洗涤法相结合进行脱细胞处理，可以将完整组织块的细胞较为彻底的脱除，达到脱细胞标准(DNA含量小于50ng/mg)，并且不会对细胞外基质本身造成过多的丢失。
优选的，本发明实施例方法的步骤40)中，氢氧化钠溶液的浓度为0.5～1M，超声消化的时间为120～240min。进行超声消化选择上述优选浓度范围内的氢氧化钠溶液，以及选择上述优选时间范围的处理时间，既可以保留理想的力学性能和细胞外基质，同时也可以一定程度提高孔隙率。
采用上述制备方法得到的全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨层的厚度为0.2～2mm，孔隙率为50～60％，压缩模量为0.5～2Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2～1mm，孔隙率为65～80％，压缩模量为20～50Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2～4mm，孔隙率为65～85％，压缩模量为20～40Mpa。
优选的，所述方法还包括：
步骤40)将体外分离培养的种子细胞接种到全层多孔骨软骨组织工程支架中。
本实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架的制备方法，从同种异体或异种动物体中获取骨软骨组织材料，相比于获取自体骨软骨，不会对非负重区造成损害，且供区来源广；相比于采用人造骨软骨，同种异体或异种动物体的骨软骨组织材料具有生物活性物质，不需后期添加。本实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架，采用全层结构骨软骨组织材料，制备全层组织支架，和天然组织具备十分接近的层次结构、力学性能和生物活性成分，可以对缺损区域进行整体修复。本实施例的全层多孔骨软骨组织工程支架，先对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔，提供“细胞接种池”，增加细胞接种率，避免了细胞只粘附在表面。在激光打孔后还利用超声消化进行孔隙优化，增加整体的微孔隙率，有利于接种的细胞的迁移和增殖。本实施例通过激光打孔再进行超声消化扩孔，保证力学强度的同时获得较高孔隙率，给致密的软骨层引入了更有利于细胞粘附和迁移的三维空间结构，便于种子细胞或自身细胞的增殖，具有优异的修复效果。
下面提供一个具体实例和两个对比例，实例1、对比例1和对比例2均是用于修复兔子的左膝关节的患处。
实例1
从幼猪的膝关节取一块圆柱形的全层骨软骨组织材料，进行清洗。将全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理，具体的，将组织通过液氮1min-37℃生理盐水5min冻融循环5次，在1％的Triton溶液中震荡洗涤24h，在混合0.2％ SDS
+0.1％EDTA的10mM Tris-HCL溶液中震荡洗涤72h。对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔。激光打孔的孔径为200um，孔间距为200um，孔深度为1000um。将激光打孔后的全层骨软骨组织材料放入浓度为0.5M的氢氧化钠溶液中，并在超声波中进行超声消化120min，得到全层多孔骨软骨组织工程支架。
对比例1
从幼猪的膝关节取一块圆柱形的全层骨软骨组织材料，进行清洗。将全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理，具体的，将组织通过液氮1min-37℃生理盐水5min冻融循环5次，在1％的Triton溶液中震荡洗涤24h，在混合0.2％ SDS
+0.1％EDTA的10mM Tris-HCL溶液中震荡洗涤72h。对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔。激光打孔的孔径为200um，孔间距为200um，孔深度为1000um，得到全层多孔骨软骨组织工程支架。
对比例2
从兔子的右膝关节取一块圆柱形的全层骨软骨组织。
实例1制备得到的工程支架，如图1所示。从图2所示的实例1制备得到的工程支架的各层电镜图可以看出，软骨层经过脱细胞和空隙优化后，有较多的孔隙结构，软骨下骨层和松质骨层结构疏松，各层内的孔隙结构相互连通且均具有立体多维性。
将体外分离培养的种子细胞接种到实例1得到的工程支架中，进行DAPI染色，得到图3(b)。将体外分离培养的种子细胞接种到对比例1得到的工程支架中，进行DAPI染色，得到图3(a)。对比可以看出，实例1通过激光打孔和超声消化结合优化孔隙得到的工程支架，更有利于干细胞粘附和迁移，便于干细胞增值。
将实例1得到的工程支架移植到兔子的左膝关节的患处，修复一段时间后进行切片，得到图4(a)、图4(b)和图4(c)。将对比例2得到的全层骨软骨组织移植到兔子的左膝关节的患处，修复一段时间后进行切片，得到图4(d)、图4(e)和图4(f)。对比可以看出，移植实例1制备得到的工程支架具有优异的修复效果，其修复效果与自体骨软骨移植的修复效果一致。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本领域的技术人员应该了解，本发明不受上述具体实施例的限制，上述具体实施例和说明书中的描述只是为了进一步说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护的范围由权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种全层多孔骨软骨组织工程支架，其特征在于，由全层骨软骨组织材料经过脱细胞化、激光打孔以及超声消化扩孔后得到；所述全层多孔骨软骨组织工程支架包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层。
2.根据权利要求1所述的全层多孔骨软骨组织工程支架，其特征在于，所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨层的厚度为0.2～2mm，孔隙率为50～60％，压缩模量为0.5～2Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2～1mm，孔隙率为65～80％，压缩模量为20～50Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2～4mm，孔隙率为65～85％，压缩模量为20～40Mpa。
3.根据权利要求1所述的全层多孔骨软骨组织工程支架，其特征在于，所述全层骨软骨组织材料为从同种异体或异种动物体中获取。
4.一种全层多孔骨软骨组织工程支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤10)获取全层骨软骨组织材料，所述全层骨软骨组织材料包括从上向下依次无缝自然过渡的软骨层、软骨下骨层和松质骨层；
步骤20)将所述全层骨软骨组织材料进行脱细胞处理；
步骤30)对脱细胞化后的全层骨软骨组织材料的软骨层进行激光打孔；
步骤40)将激光打孔后的全层骨软骨组织材料放入氢氧化钠溶液中，并在超声波中进行超声消化，得到全层多孔骨软骨组织工程支架。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，激光打孔的孔径为150～200um，孔间距为150～200um，孔深度为500～1000um。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤40)中，氢氧化钠溶液的浓度为0.5～1M。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤40)中，超声消化的时间为120～240min。
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨层的厚度为0.2～2mm，孔隙率为50～60％，压缩模量为0.5～2Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的软骨下骨层的厚度为0.2～1mm，孔隙率为65～80％，压缩模量为20～50Mpa；所述全层多孔骨软骨组织工程支架的松质骨层的厚度为2～4mm，孔隙率为65～85％，压缩模量为20～40Mpa。
9.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，还包括：
步骤40)将体外分离培养的种子细胞接种到全层多孔骨软骨组织工程支架中。
10.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤10)中，从同种异体或异种动物体中获取全层骨软骨组织材料。
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