CN110935067A - 一种聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架，具有核壳结构，采用聚氨酯作为核，以脱细胞纤维环基质为壳。本发明公开了上述聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架制备方法，以聚氨酯为内部溶液的溶质，以脱细胞纤维环基质为外部溶液的溶质，采用同轴静电纺丝得到聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架；同轴静电纺丝过程中，内部溶液的流速为0.4‑0.6mL/h，外部溶液的流速为0.15‑0.25mL/h；心轴电压为15‑17kV，心轴转速为180‑220rpm。本发明公开了上述聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用。

Description

一种聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架及其制备和应用
技术领域
本发明涉及生物组织工程技术领域，尤其涉及一种聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架及其制备方法和应用。
背景技术
椎间盘退行性疾病引起的腰背痛是最常见的骨科疾病之一，发病率和残障率，严重影响生活质量患者。据国外报道，由于腰背痛，每年有超过800万美国人去诊所就诊。损失的工作日数高达8900万，在美国造成的医疗费用和经济损失每年高达900亿美元。因此，椎间盘退行性疾病的治疗具有巨大的经济和社会效益。目前，该病的有效治疗主要是通过手术减轻压力，但长期随访的效果尚不清楚，甚至导致或加速相邻脊柱的变性。组织工程技术的发展为疾病提供了新的思路，即使用组织工程技术制备仿生椎间盘置换退化的椎间盘，以恢复脊柱的生物力学特性。自从Bonassar在2004年首次报道组织工程化的椎间盘以来，它已受到越来越多的关注。
椎间盘主要由软骨纤维环和髓核组成。髓核位于椎间盘的中央，由于其高水合作用和大量的水合蛋白聚糖而抵抗压缩负荷。纤维环(AF)是椎间盘的重要组成部分，由15至25层定向胶原纤维层倾斜地围绕髓核以28°至44°的角度重叠。AF的结构和功能完整性对于维持髓核的初始位置至关重要，同时对于维持椎间盘的生理压力至关重要。
目前，通过组织工程技术来再生退化或破裂的AF组织受到越来越多的关注。在AF组织工程中已经使用了大量的支架。在我们先前的研究中，聚氨酯(PECUU)被证明可用于AF组织工程。尽管PECUU可以在力学上模拟实际的AF组织，但其作为支架仍存在一些不足。一方面，PECUU本身和降解产物具有一定的免疫原性，作为外源性高分子材料引起炎症，不利于AF损伤的愈合。另一方面，由于纤维环干细胞(AFSCs)在PECUU支架上分泌的基质仍然难以与实际AF匹配，因为PECUU支架不能促进AF相关的细胞外基质的分泌。
去细胞基质是通过去除组织中的细胞成分而实现，主要通过化学、酶或机械的方法保留细胞外基质，不仅大大减少了自身免疫，而且可以维持组织的原始生物学功能。同时脱细胞基质具有良好的生物相容性和生物降解性，有利于细胞粘附，扩展和分化。它已被广泛用于骨骼、软骨、皮肤、膀胱、血管、心脏、肝脏和肺的组织工程。
同轴电纺技术是基于传统的静电纺丝技术上发展而来的一种新的方法。同轴电纺时将核层和壳层材料的溶液分别装在两个不同的注射器中，喷丝系统由两个同轴但是不同内径的毛细管组成，在高压电场作用下，外层液体流出后与核层液体汇合，固化前两种液体不会混合到一起。壳层液体经高频拉伸，高速喷射时内外层溶液交界面产生强大的剪切应力，核层溶液在剪切应力作用下，沿着壳层同轴运动，弯曲甩动变形并固化成为超细同轴复合纳米纤维。
同轴电纺可一步有效整合脱细胞的基质和聚合物分解成具有核-壳结构的杂化纳米纤维，具有核-壳结构的杂化纳米纤维不仅保持脱细胞基质的良好生物活性，而且可以利用聚合物的良好机械性能和可加工性，还为缓慢释放活性因子提供了理想的平台。同时具有以聚合物为核、以无细胞基质为壳的混合纤维大大降低植入的免疫反应。据报道，脱细胞膀胱基质和脱细胞脑基质分别与聚合物共混，制备的支架不仅保留了力学性能，而且还提高了细胞的黏附、扩增和分化能力。迄今为止，还没有关于用于AF组织工程的脱细胞纤维环基质(DAFM)和PECUU的同轴电纺丝支架的报道。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架及其制备方法和应用，所得支架不仅可以模拟机械性能，而且促进纤维环相关细胞外基质的分泌，接近实际的纤维环组织，因此适合AF组织工程，可以用于治疗椎间盘退行性疾病。
一种聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架，具有核壳结构，采用聚氨酯作为核，以脱细胞纤维环基质为壳。
其中脱细胞纤维环基质的参照文献为：Zhang J,Li B,Wang JH.The role ofengineered tendon matrix in the stemness of tendon stem cells in vitro andthe promotion of tendon-like tissue formation in vivo.Biomaterials.2011；32:6972-81.以及，王晟昊.脱细胞纤维环基质的制备及其复合材料对纤维环源干细胞分化的调控研究[D].苏州大学,2016.
参照《脱细胞纤维环基质的制备及其复合材料对纤维环源干细胞分化的调控研究》的第一部分的2.1DAFM制备，进行兔源性脱细胞纤维环基质制备。
优选地，脱细胞纤维环基质采用如下工艺制备：选取周龄为6-8周的新西兰白兔，去除上述兔脊柱纤维环周围的髓核和外侧筋膜、脂肪组织，采用缓冲溶液冲洗，切块后研磨，然后加入胰蛋白酶进行孵育，完成后再采用缓冲溶液冲洗，接着加入核酶溶液进行消化，漂洗，接着采用缓冲溶液洗涤，将沉淀物溶于乙酸溶液中，4℃存储得到脱细胞纤维环基质。
优选地，脱细胞纤维环基质的制备工艺中，缓冲溶液为磷酸盐缓冲盐水。
优选地，脱细胞纤维环基质制备工艺的孵育过程中，孵育温度为37℃，胰蛋白酶溶液的浓度为0.2-0.3％，孵育时间为23-25h，每4h更换一次胰蛋白酶溶液。
优选地，脱细胞纤维环基质的制备工艺中，核酶溶液的pH值为7.5，其包括：10mmol/L Tris-HCl，50U/mL DNase，1U/mL RNase。
优选地，脱细胞纤维环基质制备工艺的消化过程中，消化温度为37℃，消化时间为11-13h。
优选地，脱细胞纤维环基质制备工艺中，漂洗的具体操作如下：采用质量分数为1％的Triton X-100处理23-25h。
优选地，脱细胞纤维环基质制备工艺中，将沉淀物溶于质量分数为2.5-3.5％的乙酸溶液中。
上述聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架制备方法，以聚氨酯为内部溶液的溶质，以脱细胞纤维环基质为外部溶液的溶质，采用同轴静电纺丝得到聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架；同轴静电纺丝过程中，内部溶液的流速为0.4-0.6mL/h，外部溶液的流速为0.15-0.25mL/h；心轴电压为15-17kV，心轴转速为180-220rpm。
优选地，内部溶液由聚氨酯和溶剂按质量比为1-2：5-7混合得到，优选为1.5：6。
优选地，溶剂为六氟异丙醇。
优选地，外部溶液的浓度为4-6mg/mL。
上述聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用。
本发明采用脱细胞纤维环基质与聚氨酯通过同轴静电纺丝制备具有高亲水性和多孔结构的聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架；采用所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架培养AFSC时，不仅I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和聚蛋白多糖的基因表达水平高，而且其培养上清液会产生更多的I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和聚蛋白多糖；再利用所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架进行活体测试，其周围组织的炎症反应较轻。本发明所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架是AF组织工程有希望的候选者。
附图说明
图1为实施例3所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架和对比例所得聚氨酯纤维支架的SEM图，其中A-C为对比例所得聚氨酯纤维支架，D-F为实施例3所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架。
图2为实施例3所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架TEM图。
图3为实施例3所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架和对比例所得聚氨酯纤维支架的接触角对比图，其中A为实施例3所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架的接触角图片，B为对比例所得聚氨酯纤维支架的接触角图片，C为实施例3所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架和对比例所得聚氨酯纤维支架的接触角对比分析图。
图4为实验组和对比组的AFSCs染色图片，其中A为对比组的DAPI染色图片，D为实验组的DAPI染色图片，B为对比组的Cy3-Phalloidin染色图片，E为实验组的Cy3-Phalloidin染色图片，C为对比组的DAPI染色和Cy3-Phalloidin染色的合并图片，F为实验组的DAPI染色和Cy3-Phalloidin染色的合并图片。
图5为接种3天后实验组AFSC和对比组AFSC的SEM图，其中A为对比组AFSC的SEM图，B为实验组AFSC的SEM图。
图6为接种后第1、3、5、7天时实验组、对比组、对照组的吸光度对比图。
图7为实验组和对比组中I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、聚蛋白多糖的基因表达量对比图，其中A为I型胶原蛋白的基因表达量对比图，B为II型胶原蛋白的基因表达量对比图，C为聚蛋白多糖的基因表达量对比图。
图8为实验组培养液和对比组培养液的上清液中I型胶原蛋白、II型胶原蛋白、聚蛋白多糖的含量对比图，其中A为I型胶原蛋白的含量对比图，B为II型胶原蛋白的含量对比图，C为聚蛋白多糖的含量对比图。
图9为实验组植入物和对比组植入物的石蜡切片显微镜图，其中A为对比组植入物的石蜡切片显微镜图，B为实验组植入物的石蜡切片显微镜图。
各图中，以PECUU代表对比例所得聚氨酯纤维支架，以DAFM/PCEUU代表实施例3所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架，以CTRL代表对照组。
具体实施方式
下面，通过具体实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
下述实施例和对比例中，所有动物程序符合皖南医学院院校审查委员会(芜湖，中国)标准。
实施例1
一种聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架制备方法，包括如下步骤：
选取周龄为6周的新西兰白兔，去除上述兔脊柱纤维环周围的髓核和外侧筋膜、脂肪组织，采用磷酸盐缓冲盐水冲洗，切块后研磨，然后加入浓度为0.3％的胰蛋白酶溶液进行孵育23h，孵育温度为37℃，每4h更换一次胰蛋白酶溶液，完成后再采用磷酸盐缓冲盐水冲洗，接着加入核酶溶液(10mmol/L Tris-HCl、50U/mL DNase和1U/mL RNase，pH＝7.5)进行消化13h，消化温度为37℃，采用质量分数为1％的Triton X-100处理23h，接着采用磷酸盐缓冲盐水洗涤，将沉淀物溶于质量分数为3.5％的乙酸溶液中，4℃存储得到脱细胞纤维环基质；
内部溶液由聚氨酯和六氟异丙醇按质量比为1：7混合得到；外部溶液以脱细胞纤维环基质为溶质，其浓度为4mg/mL；采用同轴静电纺丝得到聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架；
同轴静电纺丝过程中，内部溶液的流速为0.6mL/h，外部溶液的流速为0.15mL/h；心轴电压为17kV，心轴转速为180rpm。
实施例2
一种聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架制备方法，包括如下步骤：
选取周龄为8周的新西兰白兔，去除上述兔脊柱纤维环周围的髓核和外侧筋膜、脂肪组织，采用磷酸盐缓冲盐水冲洗，切块后研磨，然后加入浓度为0.2％的胰蛋白酶溶液进行孵育25h，孵育温度为37℃，每4h更换一次胰蛋白酶溶液，完成后再采用磷酸盐缓冲盐水冲洗，接着加入核酶溶液(10mmol/L Tris-HCl、50U/mL DNase和1U/mL RNase，pH＝7.5)进行消化11h，消化温度为37℃，采用质量分数为1％的Triton X-100处理25h，接着采用磷酸盐缓冲盐水洗涤，将沉淀物溶于质量分数为2.5％的乙酸溶液中，4℃存储得到脱细胞纤维环基质；
内部溶液由聚氨酯和六氟异丙醇按质量比为2：5混合得到；外部溶液以脱细胞纤维环基质为溶质，其浓度为6mg/mL；采用同轴静电纺丝得到聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架；
同轴静电纺丝过程中，内部溶液的流速为0.4mL/h，外部溶液的流速为0.25mL/h；心轴电压为15kV，心轴转速为220rpm。
实施例3
一种聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架制备方法，包括如下步骤：
选取周龄为7周的新西兰白兔，去除上述兔脊柱纤维环周围的髓核和外侧筋膜、脂肪组织，采用磷酸盐缓冲盐水清洗3次，切成1mm×1mm×1mm的小块，置于研钵中研磨，移至37℃的恒温振荡器中，然后加入浓度为0.25％的胰蛋白酶溶液进行孵育24h，开始脱细胞，每4h更换一次胰蛋白酶溶液；
孵育完成后再采用磷酸盐缓冲盐水洗涤3次，接着加入核酶溶液(10mmol/L Tris-HCl、50U/mL DNase和1U/mL RNase，pH＝7.5)，在恒温振荡器中于37℃将组织进一步消化12h，采用质量分数为1％的Triton X-100处理24h，接着采用磷酸盐缓冲盐水洗涤6次，每次8h；将沉淀物溶于质量分数为2.5-3.5％的乙酸溶液中，4℃存储得到脱细胞纤维环基质溶液；
将1.5g聚氨酯溶解在6g六氟异丙醇中得到核溶液，将浓度为5mg/mL的上述脱细胞纤维环基质溶液作为壳溶液，进行同轴静电纺丝得到聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架；
同轴静电纺丝过程中，内部溶液的流速为0.5mL/h，外部溶液的流速为0.2mL/h；心轴电压为16kV，心轴转速为200rpm。
对比例
一种聚氨酯纤维支架制备方法，包括如下步骤：
将1.5g聚氨酯溶解在6g六氟异丙醇得到聚氨酯-六氟异丙醇溶液；然后将聚氨酯-六氟异丙醇溶液装入带有18G针头的2mL塑料注射器中，使用注射器泵(Longer Pump)以0.5mL/h的恒定速率喂入针头；使用高压电源(天津高压电源有限公司)向针头施加16kV正电压，收集器和针尖之间的距离为15cm，得到聚氨酯纤维支架。
将实施例3所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架和对比例所得聚氨酯纤维支架进行对比试验，采用实施例3所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架作为实验组，采用对比例所得聚氨酯纤维支架为对比组，具体如下：
1、纤维支架的特征
将实验组和对比组的纤维支架采用扫描电子显微镜观察(SEM；S-4800，HitachiCo.Ltd.，Japan)，其结果如图1所示。由图1可知：实验组和对比组的纤维支架的直径范围均为1-2μm。
再采用透射电子显微镜(TEM，Mic JEM-1200EX)对实验组纤维支架进行观察，其结果如图2所示。图2证实：聚氨酯位于纤维支架内部，而脱细胞纤维环基质位于外部，呈现连续的“核-壳”结构，而且脱细胞纤维环基质外壳和聚氨酯核心之间有清晰的接口。
采用
Figure BDA0002308261000000091
接触角测试仪(
Figure BDA0002308261000000092
company,Germany)，通过去离子水泡法测量实验组和对比组的接触角，取五个样品进行测试，并且取平均值作为样品的接触角；其结果如图3所示。由图3可知：实验组纤维支架的接触角为29.2°±7.4°，对比组纤维支架的接触角为107°±6.9°；实验组纤维支架的接触角小于对比组纤维支架的接触角，差异有统计学意义(P＜0.05)。
图3证实本发明所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架的亲水性优于聚氨酯纤维支架，进一步推断外侧脱细胞纤维环基质的主要成分是胶原。
2、细胞形态
对新西兰兔的衍生纤维环干细胞(AFSCs)的分离和培养(参照Liu C,Guo Q,Li J,et al.Identification of Rabbit Annulus Fibrosus-Derived Stem Cells.Kletsas D,ed.PLoS ONE.2014；9(9):e108239.doi:10.1371/journal.pone.0108239.)，将第二代兔源性AFSCs置于含10％FBS的低DMEM培养基中培养。
将第二代兔源性AFSCs分别接种在实验组纤维支架和对比组纤维支架上，将其以每孔5×103个细胞的密度放入24孔板中。
接种后第3天，采用Cy3-Phalloidin和DAPI进行染色以观察细胞的形态，具体操作如下：
每个样品用PBS洗涤两次，并用4％冷的聚甲醛固定15min；除去聚甲醛，再用PBS溶液洗涤2次，每次洗涤5min；
向每个孔中加入200μL-20℃甲醇，并在-20℃冰箱中放置5min；除去甲醇，再用PBS溶液洗涤2次，每次洗涤5min，每个孔的浓度为5μg/mL；
采用200μL Cy3-Phalloidin溶液对细胞骨架进行染色，并将其遮光保存5min，再用PBS溶液洗涤3次，每次洗涤5min；
向每个孔中加入200μL浓度为5μg/mL的DAPI溶液进行细胞核染色，并将其遮光保存5min，PBS溶液洗涤3次，每次洗涤5min；
采用倒置免疫荧光显微镜(Zeiss Axiovert 200，Carl Zeiss Inc.，Thornwood，NY，USA)观察各细胞形态，其结果如图4所示。
接种3天后，将细胞-支架复合物用PBS溶液洗涤2次，然后用2.5％戊二醛固定30min。接着将固定后细胞-支架复合物分别用50％、60％、70％、80％、90％和95％乙醇水溶液和无水乙醇脱水10min。最后对支架进行溅射镀金，采用扫描电镜观察实验组和对比组的AFSC形态，其结果如图5所示。
由图4和图5可知：AFSCs在两组纤维支架上均扩散、生长良好。
3、细胞增殖
将第二代兔源性AFSCs分别接种到实验组纤维支架和对比组纤维支架中，并以每孔2×103个细胞的密度放入96孔板中；以在聚苯乙烯(TCPS)上培养的AFSCs为对照组。
接种后1、3、5和7天通过MTS测定法(Promiga Co.ltd)检查细胞增殖，具体操作如下：每个时间点在每组挑选5个孔，采用PBS溶液洗涤细胞2次，然后加入200μL PBS和20μLMTS溶液；接着温育4h后，通过酶标仪(Bio Tek Instruments，USA)测量490nm处的吸光度，其结果如图6所示。
而根据图6可知：与对照组相比，实验组和对比组的AFSC增殖都很快，这是由于通过静电纺丝技术制得的纤维支架具有高孔隙率和表面积，而这对体外细胞粘附和组织生长是有益的。
根据图6还可知：实验组的AFSC增殖快于对比组的AFSC增殖(P＞0.05)，这可能是由于实验组的纤维支架以脱细胞纤维环基质为壳，更有利于细胞的黏附和增殖。
4、基因表达分析
将实验组和对比组的纤维支架切成适合24孔板大小的碎片。AFSCs在37℃、湿润的5％CO2培养箱中以每孔5×103个细胞置于上述两种支架上进行培养。采用逆转录酶介导的定量聚合酶链反应(RT-qPCR)对I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和聚蛋白多糖的基因表达进行分析。
一周后，采用TRIZOL(Invitrogen)提取上述两种支架上所培养细胞的总RNA。采用Revert-AidTM的第一链cDNA合成试剂盒(Fermentas，K1622)在反转录PCR系统(EastwinLife Science，Beijing)进行合成cDNA，合成温度为42℃，合成时间为60min；采用荧光定量PCR试剂盒(SsoFastTM EvaGreen Supermix，Bio-Rad)在Bio-Rad CFX96TM实时系统进行RT-qPCR检测；其结果如图7所示。
注：上述基因的相对表达水平通过2-ΔΔCt法来进行分析。采用看家基因GAPDH作为内参来校正上述基因的表达量。
由图7A可知：实验组所培养的AFSC中I型胶原蛋白的表达量比对比组所培养的AFSC中I型胶原蛋白的表达量高约3倍；由图7B可知：实验组所培养的AFSC中II型胶原蛋白的表达量比对比组所培养的AFSC中II型胶原蛋白的表达量高约1.4倍；由图7C可知：实验组所培养的AFSC中聚蛋白多糖的表达量比对比组所培养的AFSC中聚蛋白多糖的表达量高约2倍。
5、生化分析
培养两周后，对实验组和对比组的纤维支架培养液收集其上清液，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(Jianglai Bio，China)测定上清液中I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和聚蛋白多糖的含量。采用结合DNA的荧光染料Hoechst33258染料以测定其中DNA含量。将上述两种纤维支架培养液中的I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和聚蛋白多糖转化为相应DNA含量。其结果如图8所示。
由图8A可知：实验组上清液中I型胶原蛋白的一周含量为5.37±0.17ng/μg DNA，而对比组上清液中I型胶原蛋白的一周含量为3.83±0.17ng/μg DNA；由图8B可知：实验组上清液中II型胶原蛋白的一周含量为6.19±0.31ng/μg DNA，而对比组上清液中II型胶原蛋白的一周含量为3.95±0.45ng/μg DNA；由图8C可知：实验组上清液中聚蛋白多糖的一周含量为574.3±62.1pg/μg DNA，而对比组上清液中聚蛋白多糖的一周含量为413.63±7.7pg/μg DNA；同时，实验组和对比组之间的I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和聚蛋白多糖的含量存在显著差异(P<0.05)。
当其他细胞用于AF组织工程时，由于其表型的快速变化和单层扩张中II型胶原蛋白的基因表达下降，导致其在AF组织工程中的应用受到了限制。据报道，源自某种组织的间充质干细胞会优先分化为存在于该组织中的细胞类型。在本申请人先前的研究中，本申请人已经分离并培养了AFSC，发现AFSCs具有分化为AF样细胞的强烈趋势(Guo Q,Liu C,LiJ,et al.Gene expression modulation in TGF-β3-mediated rabbit bone marrow stemcells using electrospun scaffolds of various stiffness[J].Journal ofCellular&Molecular Medicine,2015,19(7):1582-1592.)。
本申请人在本发明中以兔源性AFSC为种子细胞以产生更多与AF相关的细胞外基质。由图7和图8表明：采用本发明所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架进行细胞培养，其中AF相关基因(I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和聚蛋白多糖)的表达水平较高，而且相应的蛋白(I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和聚蛋白多糖)分泌量较大，故证实：脱细胞纤维环基质可明显促进AF相关的细胞外基质的合成。
同时大量报道也表明，脱细胞基质可以提供独特的线索来指导干细胞向特定谱系的分化，而来自不同组织或器官的脱细胞基质可能会影响某些间充质干细胞的分化。
6、组织学
将实验组纤维支架和对比组纤维支架切成1cm×1cm的正方形，然后植入新西兰兔的背部肌肉中进行体内测试。
2周后取出植入物，将其置于2.5％戊二醛溶液中保存以进行组织学评估。将样品包埋在石蜡中，切片置于玻片上，然后采用苏木精-伊红染色法(H&E)进行染色(具体操作如下：将玻片浸入苏木精6min，然后放入伊红1min)；接着采用Zeiss Axiovert 200倒置相差显微镜进行观察，其结果如图9所示。
由图9可知：植入两周后，对比组纤维支架周围出现大量炎性细胞，而实验组纤维支架周围仅发现少量炎性细胞。图9表明：对比组的合成聚合物会诱导严重的免疫反应，但实验组仅发生较轻的免疫反应，可有利于体内支架植入，使本发明适用于AF组织工程。
组织工程学的最新进展导致了椎间盘修复，置换和再生的潜在新策略。至于支架材料的选择，需要综合考虑材料的生物相容性和物理性能。而现有的合成材料具有优异的机械性能，但是其生物学性能很差。相反，天然材料如脱细胞基质具有良好的生物相容性，其机械性能非常差，不能满足AF组织工程的机械需求。因此利用天然材料的良好生物相容性和合成材料的优异机械性能的这些独特优势，将天然材料和合成材料有效地结合在一起可能是一个新的方向。众所周知，静电纺丝是一种已经广泛用于制造具有结构性的纤维支架材料，其在许多类型的器官或组织中与细胞外基质相似。同轴静电纺丝因其易于整合受体内加速清除作用高度影响的药物和蛋白质的优势而被广泛用于生产纳米结构纤维。
本发明采用脱细胞纤维环基质与聚氨酯通过同轴静电纺丝制备具有高亲水性和多孔结构的聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架；采用所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架培养AFSC时，不仅I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和聚蛋白多糖的基因表达水平高，而且其培养上清液会产生更多的I型胶原蛋白、II型胶原蛋白和聚蛋白多糖；再利用所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架进行活体测试，其周围组织的炎症反应较轻。因此，表明本发明所得聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架是AF组织工程有希望的候选者。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架，其特征在于，具有核壳结构，采用聚氨酯作为核，以脱细胞纤维环基质为壳。
2.根据权利要求1所述聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架，其特征在于，脱细胞纤维环基质采用如下工艺制备：去除纤维环周围的髓核和外侧筋膜、脂肪组织，采用缓冲溶液冲洗，切块后研磨，然后加入胰蛋白酶进行孵育，完成后再采用缓冲溶液冲洗，接着加入核酶溶液进行消化，漂洗，接着采用缓冲溶液洗涤，将沉淀物溶于乙酸溶液中，4℃存储得到脱细胞纤维环基质。
3.一种如权利要求1或2所述聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架制备方法，其特征在于，以聚氨酯为内部溶液的溶质，以脱细胞纤维环基质为外部溶液的溶质，采用同轴静电纺丝得到聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架；
同轴静电纺丝过程中，内部溶液的流速为0.4-0.6mL/h，外部溶液的流速为0.15-0.25mL/h；心轴电压为15-17kV，心轴转速为180-220rpm。
4.根据权利要求3所述聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架制备方法，其特征在于，内部溶液由聚氨酯和溶剂按质量比为1-2：5-7混合得到。
5.根据权利要求3所述聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架制备方法，其特征在于，外部溶液的浓度为4-6mg/mL。
6.一种如权利要求1或2所述聚氨酯/脱细胞纤维环基质纤维支架在制备治疗椎间盘退行性疾病药物中的应用。
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