CN117065096B - 一种生物膜的快速制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种生物膜的快速制备方法及其应用，属于医疗器械领域；该生物膜由单层或多层多孔聚氨酯‑细胞质基质膜构成，可依据使用部位不同调节层数及细胞质基质具体成分，并裁剪、缝合/黏合成终产品使用；细胞质基质由不同种类细胞通过附着在多孔聚氨酯膜表面生长、代谢形成，最终完全包覆并嵌入在多孔聚氨酯膜的孔结构中；本申请提供的制备方法，操作过程简单，在实现快速批量化生产同时还可通过调节膜层数、基质成分种类、裁剪加工满足临床上的个性化需求，适用于人工血管、人工尿管、疝气修补片、心肌膜、食道、气管等多种场景的的修复和治疗。

Description

一种生物膜的快速制备方法及其应用
技术领域
本申请属于医疗器械技术领域，尤其涉及一种生物膜的快速制备方法及其应用。
背景技术
据临床数据表明，心血管疾病是人类的第一大杀手。该疾病往往与血管狭窄或阻塞有关，这就会导致血流量减少和组织损伤。据预测，到2030年，全世界心血管疾病相关死亡率的年发病率将上升至2330万人。
当前，心血管疾病的治疗方法往往包含两个方面:1.改善膳食和生活方式:2.药物和外科手术。如果病情发展到需要进行血管手术，则可能涉及血管内手术，如血管成形术，血管内支架植入或粥样斑块切除术，以扩大狭窄血管或清除梗阻。或者使用血管移植物来绕过或直接代替受损或阻塞的血管。因为动脉的可用性有限，而且与静脉相比，其具有更产重的并发症，此外，自体血管的可用性有限，同时质量不可控，而且会导致供体部位的发病。
鉴于上述提到的自体血管的局限性，组织工程血管移植物的出现为血管移植手术的未来提供了一个更完善的潜在解决方案。研究人员尝试使用患者的自体细胞或干细胞来源的自体细胞，并结合生物支架来构建组织工程血管移植物。组织工程化仿生血管的构建需要三个基本组件:细胞、支架和适当的信号因子。将细胞接种到可生物降解的支架上，为新发展的组织提供临时支撑和结构性指导，同时使用生物力学和生物化学条件来刺激和影响适当的细胞行为。
组织工程的细胞支架不但起着决定新生组织、器官形状大小的作用，更重要的是为细胞增殖起着提供营养、进行气体交换、去除废物，为细胞增殖、繁衍提供场所的重要作用。为了保证细胞的生长繁殖不受支架存在的影响，还要求细胞支架的降解速度能同细胞的增殖速度相匹配、并且其降解产物不会对细胞的生长和繁殖产生不利的影响。
从临床实用要求考虑，在手术操作中能保持原有的形状和结构;并且具有一定的柔韧性、能同机体组织相缝合和能同机体组织相贴合，能经受手术操作而不破碎、并不对机体组织造成机械损伤的力学性能。因此作为组织工程的细胞支架必须同时满足生物相容性、细胞亲和性、生物降解性，以及力学性能和形态结构等性能要求。
自体移植物、同种异体移植物和异种移植物已经发展到替代受损血管。由于血栓形成，小直径移植物(D < 6mm)仍存在挑战。机械性能、形貌、微观结构和降解行为都会影响细胞行为，并决定修复血管的质量。通过静电纺丝、盐析、或相分离技术制备多孔血管移植物以促进组织向内生长，定向生长被引入到结构中以诱导对齐的内皮和平滑肌细胞；然而，这些研究大多局限于模拟天然动脉的螺旋多层分级结构。因此，研究与开发组织工程血管是当前大趋势，目前最受关注的脱细胞支架材料，却因在脱细胞过程中细胞外基质成分丢失殆尽，对种子细胞黏附功能差，此外，因为脱细胞过程使支架中的胶原纤维疏松，各种生物基团暴露，而存在生物学和力学性能下降，降解过快，易于钙化等缺点；这些缺点对于组织工程细胞的构建和应用都是非常致命的。合成高分子材料：涤纶、聚四氟乙烯（PTFE）、聚氨酯（PU）、聚己内酯（PCL），聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）等先后被应用于人工血管的研发。这类材料具有来源可控、质量稳定性高、加工简单及机械性能好等优点，目前对这类材料的研究与改良是热点方向；缺点主要是制作过程复杂，细胞在管壁上的粘附和生长较慢。
目前人造血管在生物相容性、血栓、免疫排斥等方面已经取得很好的效果，但是人造血管的力学性能都依赖于材料的物理性能，与天然血管的差异仍然存在，导致二者对接处愈合延迟、错配效应、术后并发症等不良影响；人工血管与天然血管顺应性不匹配时，将引起血管移植部位血液动力学的变化，在吻合口处易导致血栓形成和血管内膜增生。血栓形成会导致血管在短期内发生阻塞；而内膜过度增生是影响移植血管远期通畅率的主要因素。
CN 107648669 A公开了一种构建血管化组织工程骨膜的方法，具体步骤如下：步骤1 .运用静电纺丝方法制备高分子微/纳米纤维膜；步骤2 .接种种子细胞至纳米纤维膜上，在体外培养并定向诱导一段时间；步骤3 .将体外定向诱导一段时间后的种子细胞/纳米纤维膜复合体植入体内，经过一段时间的体内血管化后取出，得到组织工程骨膜；缺陷：种子细胞来源受限，必须是自体细胞，否则有免疫排斥。
CN 112156229 A公开了一种新型小直径可降解人工血管及其构建方法，包括内表面纤维层、外表面纤维层和缠绕于内表面纤维层的纤维上的螺旋支撑结构，该人工血管制备方法简便，能一步制备出双层取向性静电纺丝纤维构成的小直径人工血管，通过几何图案信号作用，使人工血管内能快速形成取向排列且稳定黏附的单层内皮细胞，诱导平滑肌细胞呈圆周取向排列生长的同时具有更佳的力学性能，帮助人工血管内组织再生及功能的稳定再建；缺陷：人工材料无法像细胞质基质一样完全模拟细胞周围微环境，营养、支撑、酸碱度等方面不如原始的细胞质基质。
CN 107648669 A公开了一种构建血管化组织工程骨膜的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）静电纺丝制备高分子微/纳米纤维膜；（2）接种种子细胞至纳米纤维膜上，在体外培养并定向诱导一段时间；（3）将体外定向诱导一段时间后的种子细胞/纳米纤维膜复合体植入体内，经过一段时间的体内血管化后取出，得到组织工程骨膜。虽然本方法能有效减少自体组织的排斥反应并大大增加组织工程骨膜的血管化程度，但是该方法使用范围单一，生产周期长，临床实用性差，不能在短时间内减少病人痛苦。
CN 105816915 A公开了一种间充质干细胞组织工程支架及其制备方法和在制备皮肤替代品中应用。本发明的制备方法包括：制备明胶-壳聚糖多孔支架，然后将间充质干细胞接种至明胶-壳聚糖多孔支架，并进行孵育培养。虽然本发明的间充质干细胞组织工程支架能够明显有效地促进糖尿病等皮肤难愈合创面的再生、重构、修复与愈合。但是还存在以下缺陷，细胞未经过脱细胞处理，存在排斥反应；制备过程复杂，制备过程所受的影响因素太多，如：温度、PH值等，不能批量生产。
CN1386478A 公开了一种组织工程用复合结构细胞支架及其制法和用途，提供了一种适用于多种细胞组织工程细胞支架的复合结构细胞支架，虽然力学性能、降解速度、三维形态结构有所改善，但是仍存在异体免疫排斥反应，同时支架降解的产物会导致毛细血管堵塞。
制备过程复杂，成本高昂，不能批量生产，也无法满足临床个性化、多样化的实际需求。
发明内容
本申请公开一种生物膜的快速制备方法及其应用，有效解决人工血管治疗效果差，血栓形成、异体排斥反应、生产效率低、适用范围窄等问题，为了实现上述目的，本申请的技术方案是：提供了一种生物膜的快速制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）将聚氨酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中，获得聚氨酯溶液；采用溶液流延法，真空条件下烘干获得聚氨酯膜；通过物理冲孔方式，制备多孔聚氨酯膜，经胶原蛋白修饰，获得胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜；在无菌条件下，配制人体细胞培养液；将胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜平铺在人体细胞培养液中，培养条件37 ℃, 5% CO2 ，1-3小时贴壁，经过2-5天培养获得生物膜；
（2）对生物膜进行脱细胞处理，处理后对其进行附着生长因子处理；
（3）生物膜裁剪；
（4）生物膜缝制：缝制成单层或多层生物膜。
为更好地实现本发明，进一步的，所述生物膜为可降解生物膜或不可降解生物膜。
为更好地实现本发明，进一步的，所述多层生物膜为降解生物膜、不可降解生物膜中的一种或多种。
为更好地实现本发明，进一步的，所述多层生物膜附着的生长因子为内皮生长因子、平滑肌细胞生长因子、成纤维生长因子中的一种或多种。
为更好地实现本发明，进一步的，所述人体细胞培养液包括DMEM、维生素、无机离子、促生长因子、胶原蛋白、0.25%胰蛋白酶-EDTA 、10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素双抗。
为更好地实现本发明，进一步的，所述聚氨酯溶液质量百分比为20%~40%。
为更好地实现本发明，进一步的，所述真空条件为-1 ~ -0.5kPa。
为更好地实现本发明，进一步的，所述多孔聚氨酯膜，孔为均匀孔、非均匀孔中的一种或多种组合，孔形状为规则形状、不规则形状中的一种或多种组合，规则形状为方形、圆形、椭圆形、多边形、心形、花瓣形中的一种或多种组合，孔尺寸为17~200μm，孔间距30~400μm。
为更好地实现本发明，进一步的，所述胶原蛋白修饰是将聚氨酯膜浸入浓度为3mgmL-1的胶原蛋白溶液中，用UV灯照射，该灯的发射光谱在256 ~ 365nm之间。
为更好地实现本发明，进一步的，所述脱细胞处理是将生物膜放在浓度为0.25%~0.5%的十二烷基硫酸钠溶液中，经6-12小时取出，磷酸盐缓冲液中震荡清洗1-2h，在去离子水中清洗3次以上，获得脱细胞生物膜；脱细胞处理后，再对其进行附着内皮生长因子处理。
为更好地实现本发明，进一步的，所述生物膜的厚度为0.3-1mm。
为更好地实现本发明，进一步的，其特征在于作为人工血管、人工尿管、疝气修补片、心肌膜、食道、盆底膜、气管、伤口敷料中的应用。
与现有技术相比，本申请实施例的有益效果至少包括：
1）本申请提供的制备方法，利用微米级多孔的结构，可以为细胞提供附着点，具有促进细胞的粘附与增殖的作用，可以促进细胞迁移和组织向内生长；还可以使细胞生成的组织与聚氨酯膜牢固结合，使组织全方位包裹聚氨酯，不会发生副反应。
2）本申请提供的制备方法，操作过程简单，能快速大规模培养并量产，实现产业化，生产周期短，降低生产成本。
3）本申请提供的生物膜，应用性强，可操作性强，随用随取，医生可以根据病人病情，可以调整生物膜的层数，生物膜的形状、结构，及随意裁切生物膜的尺寸，通过蛋白线进行缝合。
4）通过调控网孔的大小，调控细胞质基质与聚氨酯膜的贴壁性及细胞与聚氨酯膜的嵌入性，进而调控生物膜的强度及力学性能；生物膜不仅保留其生物力学性能，同时避免同种免疫排斥反应。
5）多层使用时，可以根据病人情况进行结构调控，如三层膜：内层可使用内皮生长因子溶液浸泡，中间层使用平滑肌细胞生长因子溶液浸泡，外层使用成纤维生长因子浸泡。
6）将多孔结构的生物膜制备成血管，在承受压力变化时由于其多孔结构，血管内径、长度与体积的都会发生变化，其径向顺应性、纵向顺应性和体积顺应性也会相应增加，人工血管与天然血管顺应性相匹配，减少血管移植部位血液动力学的变化，在吻合口处降低血栓形成和血管内膜增生。
7）添加胶原蛋白，能刺激细胞增殖和迁移，促进胶原纤维的生成，胶原蛋白修饰后，水接触角由50°左右降低到10-20°，有助于良好的细胞粘附、诱导和增殖。
8）可降解生物膜与不可降解生物膜交替使用时，可降解生物膜当做临时填充物，不可降解生物膜可当做骨架，持续提供支撑性能。
附图说明
图1为十二边形孔与四边形孔交替组合生物膜结构示意图。
图2为十二边形孔生物膜结构示意图。
图3为大小不同的不规则形状孔生物膜结构示意图。
图4为大小相同的不规则形状孔生物膜结构示意图。
图5为椭圆形孔生物膜结构示意图。
图6为椭圆形孔与星形孔交替组合生物膜结构示意图。
图7为十边形孔与不规则形孔交替组合生物膜结构示意图。
图8为十边形孔生物膜结构示意图。
图9十四边形孔与不规则图形孔组合生物膜结构示意图。
图10十四边形孔生物膜结构示意图。
图11四边形孔生物膜结构示意图。
图12圆形孔和星形孔交替组合生物膜结构示意图。
图13圆形孔生物膜结构示意图。
图14心形孔与箭形孔交替组合生物膜结构示意图。
图15心形孔生物膜结构示意图。
图16大小不同菱形孔生物膜结构示意图。
图17菱形孔生物膜结构示意图。
具体实施方式
实施例1
（1）将聚氨酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中，获得质量百分比为20%聚氨酯溶液；采用溶液流延法，将聚氨酯溶液涂敷在石英板上，经抽真空-0.8kPa，80℃烘干，获得聚氨酯膜；通过物理冲孔方式，制备出图1所示的多孔聚氨酯膜，十二边形孔尺寸为100μm，四边形孔尺寸为50μm，孔间距200μm；将多孔聚氨酯膜浸入浓度为3mg mL-1的胶原蛋白溶液中，用UV灯照射，该灯的发射光谱在365nm，获得胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜。
（2）以下试验环境及器械均为无菌，人体细胞培养液的配方为：DMEM、10%胎牛血清、维生素、无机离子、促生长因子、0.25%胰蛋白酶-EDTA 、胶原蛋白和1%青霉素-链霉素双抗；将密度为1×105个人体细胞均匀地悬浮于培养液中，再将胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜平铺在大的培养板中进行培养及接种，使细胞在多孔聚氨酯膜上不断延展并培养；培养条件37 ℃, 5% CO2；每隔一天更换一次培养基；最终获得生物膜。
（3）将生物膜放在浓度为0.25%的十二烷基硫酸钠溶液中，经12小时取出，磷酸盐缓冲液中震荡清洗2h，在去离子水中清洗3次以上，获得脱细胞生物膜。
（4）脱细胞处理后，再对其进行附着内皮生长因子处理。
（5）裁剪。
（6）缝制成型，单层结构。
实施例2
采用如图2所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例3
采用如图3所示的多孔聚氨酯膜，大孔尺寸为100μm，小孔尺寸为50μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例4
采用如图4所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例5
采用如图5所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例6
采用如图6所示的多孔聚氨酯膜，椭圆形孔尺寸为100μm，星形孔尺寸为50μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例7
采用如图7所示的多孔聚氨酯膜，十边形孔尺寸为100μm，不规则形孔尺寸50μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例8
采用如图8所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例9
采用如图9所示的多孔聚氨酯膜，十四边形孔尺寸为100μm，不规则图形孔尺寸为50μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例10
采用如图10所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例11
采用如图11所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例12
采用如图12所示的多孔聚氨酯膜，圆形孔尺寸为100μm，星形孔尺寸为50μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例13
采用如图13所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例14
采用如图14所示的多孔聚氨酯膜，心形孔尺寸为100μm，箭形孔尺寸50μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例15
采用如图15所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例16
采用如图16所示的多孔聚氨酯膜，大孔尺寸为100μm，小孔尺寸为50μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
实施例17
采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，单层生物膜厚1mm，其余同实施例1。
实施例18
（1）将聚氨酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中，获得质量百分比为20%聚氨酯溶液；采用溶液流延法，将聚氨酯溶液涂敷在石英板上，经抽真空-1kPa，80℃烘干，获得聚氨酯膜；通过物理冲孔方式，制备出图17所示的多孔聚氨酯膜，四边形孔尺寸为17μm，孔间距30μm；将多孔聚氨酯膜浸入浓度为3mg mL-1的胶原蛋白溶液中，用UV灯照射，该灯的发射光谱在256nm，获得胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜。
（2）以下试验环境及器械均为无菌，人体细胞培养液的配方为：DMEM、10%胎牛血清、维生素、无机离子、促生长因子、0.25%胰蛋白酶-EDTA 、胶原蛋白和1%青霉素-链霉素双抗；将密度为1×105个人体细胞均匀地悬浮于培养液中，再将胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜平铺在大的培养板中进行培养及接种，使细胞在多孔聚氨酯膜上不断延展并培养；培养条件37 ℃, 5% CO2；每隔一天更换一次培养基；最终获得生物膜。
（3）将生物膜放在浓度为0.25%的十二烷基硫酸钠溶液中，经12小时取出，磷酸盐缓冲液中震荡清洗1h，在去离子水中清洗3次以上，获得脱细胞生物膜。
（4）脱细胞处理后，再对其进行附着内皮生长因子处理。
（5）裁剪。
（6）缝制成型，单层结构。
实施例19
（1）将聚氨酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中，获得质量百分比为30%聚氨酯溶液；采用溶液流延法，将聚氨酯溶液涂敷在石英板上，经抽真空-0.8kPa，80℃烘干，获得聚氨酯膜；通过物理冲孔方式，制备出图17所示的多孔聚氨酯膜，四边形孔尺寸为25μm，孔间距50μm；将多孔聚氨酯膜浸入浓度为3mg mL-1的胶原蛋白溶液中，用UV灯照射，该灯的发射光谱在365 nm，获得胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜。
（2）以下试验环境及器械均为无菌，人体细胞培养液的配方为：DMEM、10%胎牛血清、维生素、无机离子、促生长因子、0.25%胰蛋白酶-EDTA 、胶原蛋白和1%青霉素-链霉素双抗；将密度为1×105个人体细胞均匀地悬浮于培养液中，再将胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜平铺在大的培养板中进行培养及接种，使细胞在多孔聚氨酯膜上不断延展并培养；培养条件37 ℃, 5% CO2；每隔一天更换一次培养基；最终获得生物膜。
（3）将生物膜放在浓度为0.5%的十二烷基硫酸钠溶液中，经6小时取出，磷酸盐缓冲液中震荡清洗2h，在去离子水中清洗3次以上，获得脱细胞生物膜。
（4）脱细胞处理后，再对其进行附着内皮生长因子处理。
（5）裁剪。
（6）缝制成型，单层结构。
实施例20
（1）将聚氨酯溶于N,N-二甲基甲酰胺中，获得质量百分比为40%聚氨酯溶液；采用溶液流延法，将聚氨酯溶液涂敷在石英板上，经抽真空-1kPa，80℃烘干，获得聚氨酯膜；通过物理冲孔方式，制备出图17所示的多孔聚氨酯膜，四边形孔尺寸为50μm，孔间距100μm；将多孔聚氨酯膜浸入浓度为3mg mL-1的胶原蛋白溶液中，用UV灯照射，该灯的发射光谱在365nm，获得胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜。
（2）以下试验环境及器械均为无菌，人体细胞培养液的配方为：DMEM、10%胎牛血清、维生素、无机离子、促生长因子、0.25%胰蛋白酶-EDTA 、胶原蛋白和1%青霉素-链霉素双抗；将密度为1×105个人体细胞均匀地悬浮于培养液中，再将胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜平铺在大的培养板中进行培养及接种，使细胞在多孔聚氨酯膜上不断延展并培养；培养条件37 ℃, 5% CO2；每隔一天更换一次培养基；最终获得生物膜。
（3）将生物膜放在浓度为0.5%的十二烷基硫酸钠溶液中，经6小时取出，磷酸盐缓冲液中震荡清洗2h，在去离子水中清洗3次以上，获得脱细胞生物膜。
（4）脱细胞处理后，再对其进行附着内皮生长因子处理。
（5）裁剪。
（6）缝制成型，单层结构。
实施例21
采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为75μm，孔间距150μm，其余同实施例18。
实施例22
采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为125μm，孔间距250μm，其余同实施例18。
实施例23
采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为150μm，孔间距300μm，其余同实施例18。
实施例24
采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为200μm，孔间距400μm，其余同实施例18。
实施例25
采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，单层生物膜厚0.3mm，其余同实施例1。
实施例26
采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，单层生物膜厚0.3mm，缝制成双层膜结构，一层使用内皮生长因子溶液浸泡，另一层使用成纤维生长因子浸泡，其余同实施例1。
实施例27
采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，单层生物膜厚0.3mm，缝制成三层膜结构，内层可使用内皮生长因子溶液浸泡，中间层使用平滑肌细胞生长因子溶液浸泡，外层使用成纤维生长因子浸泡，其余同实施例1。
比较例1
无胶原蛋白处理：采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
比较例2
无脱细胞：采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
比较例3
无孔膜：采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
比较例4
无生长因子处理：采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为100μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
比较例5
采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为250μm，孔间距200μm，其余同实施例1。
比较例6
采用如图17所示的多孔聚氨酯膜，孔尺寸为10μm，孔间距20μm，其余同实施例1。
以上实施例采用以下方法检测：
（1）轴向拉伸强度：试验中将样品的两端分别固定在万能材料试验机的夹具上，夹具间距为50 mm。小心确保样本没有被拉伸、扭曲或被夹具损坏，应尽量保持自然状态。然后以150 mm·min-1的速率匀速拉伸样本，直至样本断裂，记录断裂时的载荷值即为其轴向拉伸强度。
（2）周向拉伸强度：从样品上截取长度为40mm的供试样本，记为样本的长度（L），单位为mm。将样本放置在万能材料试验机夹具的两个销上，确保样本无拉伸或扭曲，保持自然状态。以150mm·min-1的速率拉伸样本，直至达到断裂点。记录最大负载（Tmax）。将每个样品的最大负载（Tmax）除以其原始样品长度来计算周向拉伸强度。
（3）渗透压：将样品连接到软管水压综合测试台上，然后用生理盐水充盈血管，逐渐增加压力至100 kPa，观察样品的外表面是否出现水珠。
（4）缝线牵拉强度：测定将缝线拉出管状血管移植物管壁的力；沿轴向截取一段长度约为20 mm的样本，使用6-0尼龙缝线（直径0.16 mm）在距伸直样本一端2 mm处插入并穿过一层血管壁，缝合成一个半环。以150 mm·min-1的速率拉伸缝线，记录将缝线从血管假体中拉出，或导致血管假体壁损坏的拉力大小。
（5） 薄膜加压破裂强度：试验截取长度为100 mm的样本，再沿纵轴方向切开，抚平，形成厚度均匀的平片。将平片的样品放置在数字式胀破强度测试仪底座的开口上，使样品完全覆盖加压薄膜，固定夹具环。以200 mL·min-1的速率均匀增加薄膜下面的压力，直到样品破裂，记录破裂强度。
对以上实施例进行以下动物实验：
大鼠皮下试验：大鼠腹腔注射2%戊巴比妥钠麻醉；然后在大鼠的背部区域制造六个尺寸为20 mm的切口；将不同的生物膜植入皮下，植入后7和28天对动物实施安乐死，收集标本进行评估。
兔子体内血管再生试验：采用体重约3 kg的雄性新西兰白兔随机分成2组生物膜和天然血管组。每只兔子用戊巴比妥钠(2%，30mg·kg-1)麻醉，小心地分离颈动脉。先将生物膜缝制成血管状，浸泡在促生长因子溶液中，用两个止血钳交叉夹住颈动脉的近端和远端。然后切除长10mm的动脉，用蛋白缝线端吻合法移植不同的血管，管状的移植前将移植物浸泡在肝素溶液(0.2%)中5分钟，以防止体内凝固；对于天然血管组，切除动脉，然后通过相同的端对端吻合过程用蛋白缝线缝合；吻合后，慢慢松开夹子以恢复血流；使用4-0 prolene缝线逐层缝合皮肤；植入后，肌肉注射青霉素(400万IU)3天以防止感染。
以上实施例及比较例测得的组织再生、有无血栓、有无内膜增生、弹性模量、抗撕裂强度、周向拉伸强度、轴向拉伸强度、渗透性、缝线牵拉强度、薄膜加压破裂强度数据如下表示：
表1：
表2：
表3：
表4：
研究分析：小鼠皮下植入后，第7天实施例1-24在生物膜上发现一些内皮细胞，28后实施例1、3、6、7、9、12、14、16发现内皮细胞层，实施例2、4、5、8、10、11、13、15、17、18、19、20、21、22、23、24发现断断续续内皮细胞层；对比例1由于发现较少内皮细胞及细胞层，对比例2由于排斥反应，值检测到微量内皮细胞，对比例3、4、5、6发现微量内皮细胞层。
比较例5孔尺寸过大，细胞生长不全，抗撕裂强度下降。
比较例6孔尺寸过小，细胞生长效果不好，仅有断断续续的单层细胞层，不能全面的包裹聚氨酯膜，虽然有凹凸不平的结构，但是细胞层的抗撕裂强度与拉力不足，聚氨酯膜的抗撕裂强度与拉力强度能满足需求。
以上所述，仅是本发明的具体实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何熟悉本技术领域的技术人员对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种生物膜的快速制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将聚氨酯溶于N，N-二甲基甲酰胺中，获得聚氨酯溶液；采用溶液流延法，真空条件下烘干获得聚氨酯膜；通过物理冲孔方式，制备多孔聚氨酯膜，其孔尺寸为17～200μm，孔间距为30～400μm；经胶原蛋白修饰，获得胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜；所述胶原蛋白修饰是将聚氨酯膜浸入浓度为3mg mL-1的胶原蛋白溶液中，用UV灯照射，该灯的发射光谱在256～365nm之间；在无菌条件下，配制人体细胞培养液；将胶原蛋白修饰的多孔聚氨酯膜平铺在人体细胞培养液中，培养条件37℃，5％CO2，1-3小时贴壁，经过2-5天培养获得生物膜；所述生物膜为不可降解生物膜；
(2)对生物膜进行脱细胞处理，处理后对其进行附着生长因子处理；
(3)生物膜裁剪；
(4)生物膜缝制：缝制成单层或多层生物膜，所述多层生物膜附着的生长因子为内皮生长因子、平滑肌细胞生长因子、成纤维生长因子中的一种或多种组合。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述人体细胞培养液包括DMEM、维生素、无机离子、促生长因子、胶原蛋白、0.25％胰蛋白酶-EDTA、10％胎牛血清、1％青霉素-链霉素双抗。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述聚氨酯溶液质量百分比为20％～40％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述多孔聚氨酯膜，孔为均匀孔、非均匀孔中的一种或多种组合，孔形状为规则形状、不规则形状中的一种或多种组合，规则形状为方形、圆形、椭圆形、多边形、心形、花瓣形中的一种或多种组合。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述脱细胞处理是将生物膜放在浓度为0.25％～0.5％的十二烷基硫酸钠溶液中，经6-12小时取出，磷酸盐缓冲液中震荡清洗1-2h，在去离子水中清洗3次以上，获得脱细胞生物膜。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述生物膜的厚度为0.3-1mm。
7.根据权利要求1所述的制备方法制备的生物膜的应用，其特征在于作为人工血管、人工尿管、疝气修补片、心肌膜、食道、盆底膜、气管、伤口敷料中的应用。
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