RU2808880C1 - Биорезорбируемый имплантат кровеносных сосудов на основе нановолокон - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к биорезорбируемому трубчатому имплантату кровеносных сосудов на основе нановолокон из поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона), состоящему из двух слоев, отличающемуся тем, что внутренний слой имплантата, толщиной 50–250 мкм, состоит из нановолокон поли(L-лактида), обработанных при температуре из интервала Т=70-90°C в течение 30–120 минут, наружный слой имплантата, толщиной 50-250 мкм состоит из нановолокон поли(ε-капролактона), модуль упругости Е имплантата составляет от 10 до 70 МПа, внешний диаметр имплантата составляет 1,0-10,0 мм, внутренний диаметр составляет 0,5-9,5 мм. Настоящее изобретение обеспечивает 1) биорезорбируемость; 2) эффективную адгезию и пролиферацию клеток эндотелия, соединительной и мышечной тканей, а также васкуляризацию и иннервацию стенок кровеносного сосуда; 3) скорость резорбции, которая не превышает скорость формирования нативной ткани; 4) величины прочности при разрыве σ= 1,2 МПа и относительного удлинения ε= 120–150% имплантата, которые позволяют манипулировать с ним как в сухом, так и во влажном состоянии; 5) упругие характеристики имплантата, модуль упругости Е от 10 до 70 МПа, которые позволяют в течение всего срока реконструкции выдерживать динамические циклические нагрузки, действующие на сосуд. 7 пр., 7 ил., 1 табл.

Description

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, точнее, к биорезорбируемым имплантатам кровеносных сосудов на основе полимерных нановолокон.

Изобретение предназначено для использования в медицине и ветеринарии в качестве биорезорбируемых имплантатов кровеносных сосудов. Изобретение может найти применение в тканевой инженерии в качестве матриц для клеточных технологий, а также в регенеративной медицине.

В настоящее время в качестве имплантатов для реконструкции сосудов используют аутовены и артерии, алло- и ксенососуды, а также имплантаты на основе резорбируемых и нерезорбируемых полимерных материалов. Каждый из них обладает, как достоинствами, так и очевидными недостатками. В последние годы уделяется большое внимание разработке тканеинженерных сосудистых имплантатов с применением методов тканевой инженерии.

Современные требования к материалам, используемым в тканевой инженерии, а также имплантатам кровеносных сосудов сформулированы в монографии [Полимерные матрицы для тканевой инженерии. И.П. Добровольская, В.Е. Юдин, П.В. Попрядухин, Е.М. Иванькова. СПб: Издательско-полиграфическая ассоциация университетов России. 2016. 224 с.]. Среди них:

- материал имплантата должен характеризоваться биосовместимостью;

- трубчатый имплантат должен сохранять упругие характеристики при приложении к нему циклических нагрузок в течение времени его нахождения в живом организме;

- величина модуля упругости трубчатого имплантата должна быть не меньше аналогичного значения нативного кровеносного сосуда;

- пористая структура должна обеспечивать адгезию и пролиферацию клеток эндотелия, соединительной и мышечной тканей, а также иннервацию и васкуляризацию стенок трубчатого имплантата;

- химическое строение макромолекул, а также структура внутренней поверхности трубчатого имплантата должна способствовать образованию эндотелиального слоя в течение раннего послеоперационного периода;

- скорость резорбции имплантата не должна превышать скорость формирования тканей сосуда;

- продукты резорбции материала должны быть биосовместимы.

Синтетические сосудистые имплантаты из политетрафторэтилена, полиэтилентерефталата или полиуретана активно применяются в медицинской практике с 1970 годов [US Patent 2022/0087811A1; Campbell, C. D., et al. "Expanded microporous polytetrafluoroethylene as a vascular substitute: a two year follow-up." Surgery 85.2 (1979): 177-183; McCollum C. et al. PTFE or HUV for femoro-popliteal bypass: a multi-centre trial //European Journal of Vascular Surgery. – 1991. – Т. 5. – №. 4. – С. 435-443]. Синтетические имплантаты обладают относительно хорошими эксплуатационными характеристиками, широким ассортиментом и массовостью их производства. Однако, их использование нередко сопровождается рядом осложнений. В первую очередь, ранний тромбоз синтетических имплантатов вследствие отсутствия эндотелиального слоя. У таких имплантатов часто возникает стеноз зон анастомозов, вызванный хроническим воспалением или субинтимальной гиперплазией, кроме того, есть опасность инфицирования имплантата [Esquivel, C.O. and William Blaisdell, F. (1986) “Why small caliber vascular grafts fail: A review of clinical and experimental experience and the significance of the interaction of blood at the interface,” Journal of Surgical Research, 41(1), pp. 1–15]. Существенным недостатком искусственных имплантатов является отсутствие возможности их роста и ремоделирования в организме, что особенно важно для детской кардиохирургии. Синтетические протезы не пригодны для реконструкций артерий малого калибра (например, коронарных артерий, артерий голени). В первую очередь из-за гиперплазии интимы, возникающей в зоне анастомозов после имплантации [Kannan, R.Y. et al. (2005) “Current status of Prosthetic Bypass Grafts: A Review,” Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials, 74B (1), pp. 570–581]. Главной особенностью наиболее распространенных имплантатов на основе биосовместимых синтетических полимеров из политетрафторэтилена и его производных, полипропилена, а также полиэтилентерефталата является полное отсутствие биорезорбции, сохранение свойств и структуры под действием биологически активной среды.

При использовании аутологичного материала, как правило, происходит полная интеграция имплантата в организм, а наличие слоя эндотелия и минимально выраженная воспалительная реакция делает возможным протезирование сосудов малого диаметра. Однако количество аутоматериала ограничено, особенно в случаях повторных операций или шунтирования нескольких артерий. Особенно остро стоит вопрос протезирования с помощью аутоартерий, так как забор материала приводит к существенным функциональным нарушениям в тканях, находящихся в области забираемой артерии. Поэтому для протезирования чаще используют аутовены, эксплантация которых легче компенсируется и не приводит к существенным нарушениям. Но, так как стенка вены значительно тоньше, чем у артерии, при их использовании на отдаленных сроках наблюдаются дегенеративные процессы стенки и развитие аневризм. Кроме того, забор материала является дополнительной травмой для пациента и усложняет оперативное вмешательство. Тем не менее, использование аутовены в клинической практике остается до сих пор «золотым стандартом» при выполнении реконструкций сосудов малого диаметра, однако этот материал крайне дефицитный и не лишен недостатков в долгосрочной перспективе (тромбоз, образование аневризм, стеноз в зоне анастомозов [Ernst, C.B. (1972) “Autogenous saphenous vein aortorenal grafts,” Archives of Surgery, 105(6), p. 855; O'Neill, J.A. (1998) “Long-term outcome with surgical treatment of renovascular hypertension,” Journal of Pediatric Surgery, 33(1), pp. 106–111 Fry, W.J. (1973) “Renovascular hypertension in the pediatric patient,” Archives of Surgery, 107(5), p. 692].

В настоящее время в клинической практике для сосудистых реконструкций также используют гомо- или ксено-имплантаты преимущественно для реконструкции сосудов большого диаметра. Такие трансплантаты могут быть использованы только после соответствующей обработки, неоднократной проверки на стерильность и безопасность. В настоящее время трансплантаты из артерий и мочеточников крупного рогатого скота коммерчески доступны: Artegraft®, Solcograft®, ProCol® (LeMaitre Vascular, Inc., Burligton, MA, USA), Synergraft® (CryoLife, Inc., Kennesaw, GA, USA). Однако присутствие в их составе фиксирующих агентов, таких как глутаральдегид и других, обуславливает цитотоксичность, что часто приводит к последующей дегенерации стенки имплантата с развитием осложнений. Другим существенным недостатком трубчатых материалов крупного рогатого скота является невозможность ремоделирования in vivo, что делает их недоступными для применения в педиатрии [Pennel, T. et al. (2014) “The performance of cross-linked acellular arterial scaffolds as vascular grafts; pre-clinical testing in direct and isolation loop circulatory models,” Biomaterials, 35(24), pp. 6311–6322]. После их имплантации в организм реципиента происходит перестройка стенки с полным замещением на соединительную ткань. Поэтому проходимость таких трансплантатов при реконструкции вен сопряжена с образованием стенозов и аневризм. Еще одним материалом для сосудистой трансплантологии является вена пупочного канатика, которая применяется с 1974 г. под коммерческим названием Biograft® [Oblath, R.O. et al. (1978) “Human umbilical veins and autogenous veins as canine arterial bypass grafts,” Annals of Surgery, 188(2), pp. 158–161; Dardik, A. and Dardik, H. (2010) “Umbilical vein grafts for lower limb revascularization,” Regenerative Medicine Using Pregnancy-Specific Biological Substances, pp. 189–198]. Анализ использования вен пупочного канатика в качестве трансплантата в сосудистой хирургии показал приемлемую степень проходимости, но частота образования аневризмы была очень высокой [Sato, O. et al. (1995) “Biodegradation of glutaraldehyde-tanned human umbilical vein grafts,” Surgery Today, 25(10), pp. 901–905]. Успешное применении децеллюляризированной подвздошной вены в качестве трансплантата приведено в работе [Olausson, M. et al. (2012) “Transplantation of an allogeneic vein bioengineered with autologous stem cells: A proof-of-concept study,” The Lancet, 380(9838), pp. 230–237]. Трупная подвздошная вена была децеллюляризирована в течение 3 недель. Для ее рецелюляризации были получены аутологичные эндотелиальные и гладкомышечные клетки из стволовых клеток костного мозга. Через 1 год после трансплантации, выявлено значимое снижение скорости кровотока по шунту за счет его сдавления.

Авторами настоящего изобретения ранее получен патент РФ № 2568848 на трубчатый имплантат органов человека и животных и способ его получения из нановолокон сополимера ε-капролактама, соли гексаметилендиаминадипината или соли гексаметилендиаминсебацината, или их смеси. Эксперименты in vivo на крысах показали, что на внутренней поверхности имплантата через неделю после имплантации формируется слой эндотелия, предотвращающий образование тромбов. Длительное наблюдение, до 24 месяцев, за оперированными животными показало проходимость сосудов, отсутствие стенозов и аневризм. Положительный эффект использования трубок на основе этого сополимера в качестве имплантатов кровеносных сосудов в многочисленных экспериментах in vivo на крысах обеспечен комплексом прочностных и упругих характеристик материала, его пористой структурой. Оптимальные размеры пор для эффективной адгезии и пролиферации стволовых и соматических клеток составляет 100 – 500 мкм. Именно такая пористая структура соответствует большинству тканей животных и человека, основой которых является каркас из коллагеновых волокон диаметром десятки-сотни нанометров. Только структура, максимально приближенная к нативной, обеспечивает протекание клеточных процессов, паро- и газообмен, изолирует поверхность имплантата от патогенной внешней среды. Вместе с тем, сополимер ε-капролактама, соли гексаметилендиаминадипината не является резорбируемым полимером, что делает невозможным его использование в качестве матриц тканеинженерных препаратов для регенерации тканей или реконструкции органов, в частности, кровеносных сосудов.

Известен патент US 20210077284A1, в котором описан биорезорбируемый имплантат сосуда и способ его получения. Матрица имплантата кровеносного сосуда состоит из трубки и окружающей ее сетки. Трубка изготовлена методом окунания в раствор эластомеров - сополимера лактида и капролактона, или сополимера капролактона и гликолида, или поликапролактона, или полилактида, или полиуретана. Наружная сетка изготовлена из более жесткого материала, чем внутренняя трубка. Наружный сеточный слой включает складки, расположенные параллельно друг другу и ориентированные вдоль оси трубки, соединенные между собой по меньшей мере одной нитью. Наружный волнообразный слой, структура которого подобна структуре стента, изготовлен методом 3D-печати.

В патенте US 20200246126 A1 описаны биорезорбируемые матрицы для тканевой инженерии и способы их получения. Сосудистый имплантат состоит из трубчатой сердцевины из биорезорбируемого полиэфира, наружной оболочки из биорезорбируемого полиэфира, полученной методом электроформования, а также тромборезистентного агента в частности, гепарина. Биорезорбируемый имплантат на основе внутренней трубки из поли(глицеролсебацина) и наружного слоя из поли(капролактона) использовали для формирования кровеносного сосуда диаметром менее 6 мм.

Из уровня техники известны патенты, ранее полученные авторами изобретения, в которых описан способ получения нановолокон из алифатического сополиамида (патент RU № 2447207), а также композиционного полимерного раневого покрытия на основе нановолокон (патент RU № 2647609). В этих патентах описаны способы получения пленочных материалов на основе нановолокон из нерезорбируемого сополимера ε-капролактама и гексаметилендиаминадипината с соотношением мономерных звеньев от 60:40 до 40:60 мас. %, а также композиционных нановолокон на основе хитозана и нанофибрилл хитина.

В патенте-прототипе US 20200179096 конструкция состоит из нановолокон поли(лактида) или поли(глицеролсебацита), содержащих поливиниловый спирт, и оболочки, представляющей собой эластичную композицию из нановолокон поли(капролактона). Трубка содержит тромборизистентный агент, гепарин. Внешняя эластичная оболочка характеризуются модулем упругости от 100 кПа до 10 МПа. Эти значения меньше нижнего предела аналогичного параметра заявленного имплантата. Данная конструкция, в отличие от заявленной, содержит нерезорбируемый, гидрофильный полимер – поливиниловый спирт, что несомненно оказывает негативное влияние на биологические процессы, которые происходят при реконструкции кровеносного сосуда.

Таким образом, создание качественного биорезорбируемого полимерного имплантата кровеносных сосудов остается актуальной задачей.

Решением данной задачи является создание эффективного биорезорбируемого имплантата кровеносного сосуда для реконструктивной сосудистой хирургии.

Заявляемый биорезорбируемый трубчатый имплантат кровеносных сосудов на основе нановолокон из поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона), состоящий из двух слоев, отличающийся тем, что внутренний слой имплантата, толщиной 50–250 мкм, состоит из нановолокон поли(L-лактида), обработанных при температуре из интервала Т=70-90 °C в течение 30–120 минут, наружный слой имплантата, толщиной 50-250 мкм состоит из нановолокон поли(ε-капролактона) или сополимера поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона) с соотношением мономерных звеньев от 50:50 до 90:10, модуль упругости Е имплантата составляет от 10 до 70 МПа, внешний диаметр имплантата составляет 1,0-10,0 мм, внутренний диаметр составляет 0,5-9,5 мм.

Свойства имплантатов на основе нановолокон из поли(L-лактида), поли(ε-капролактона), их сополимера, а также нативных сосудов животных приведены в таблице.

Таблица 1

Образец	Модуль упругости, Е, МПа	Прочность, σ, МПа	Относительное удлинение при разрыве, ε, %	Толщина стенки, мм
Поли (ε-капролатон) (ПКЛ)	3,70±1,32	1,18±0,74	558,48±131,84	0,51±0,08
Поли(L-лактид) (ПЛА)	3,34±0,48	1,32±0,41	114,46±12,10	0,41±0,03
Поли(L-лактид) Т= 80 °C	113,50±16,91	2,19±0,21	40,85±19,47	0,39±0,01
Поли(L-лактид) Т= 90 °C	72,11±12,55	2,86±0,15	20,49±10,58	0,37±0,01
Композиция ПЛА-ПКЛ	53,62±12,33	1,75±0,58	150,00±10,07	0,28±0,01
Композиция ПКЛ-ПЛА	10,57±6,68	1,59±0,34	319,79±123,79	0,42±0,03
Сополимер ПЛА/ПКЛ=70/30	3,09±0,33	8,87±3,42	472,22±112,96	0,14±0,01
Бедренная артерия кролика	4,67±1,94	1,63±1,05	93,71±51,68	0,3
Аорта крысы	8,12±5,36	3,1±0,46	134,08±23,66	0,124

Совокупность существенных признаков заявляемого имплантата кровеносных сосудов обеспечивает получение технического результата:

- биорезорбируемость, которая обеспечивается химическим строением поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона) и структурой трубчатых имплантатов;

- поры размером 0,2– 200 мкм, которые образуются в процессе электроформования нановолокон, обеспечивают эффективную адгезию и пролиферацию клеток эндотелия, соединительной и мышечной тканей, а также васкуляризацию и иннервацию стенок кровеносного сосуда;

- химическое строение полимеров, на основе которых выполнены трубки, наличие внутреннего слоя из поли(L-лактида) и наружного из поли(ε-капролактона), а также их толщина, обеспечивают скорость резорбции, которая не превышает скорость формирования нативной ткани;

- величины прочности при разрыве σ= 1,2 МПа и относительного удлинения ε= 120 – 150% имплантата позволяют манипулировать с ним как в сухом, так и во влажном состоянии;

- упругие характеристики имплантата, модуль упругости Е от 10 до 70 МПа позволяют в течение всего срока реконструкции выдерживать динамические циклические нагрузки, действующие на сосуд.

Анализ известного уровня техники не позволил обнаружить решение, полностью совпадающее по совокупности существенных признаков с заявляемым, что может указывать на новизну биорезорбируемого имплантата кровеносных сосудов на основе нановолокон.

Важно подчеркнуть, что существенным отличием настоящего изобретения от описанного в патенте-прототипе, является условие проведения экспериментов in vivo. В заявляемом изобретении после многочисленных экспериментов по имплантации на мелких животных, преимущественно на крысах, проведены длительные эксперименты на приматах, анатомия и физиологические процессы которых, максимально приближены к анатомии и физиологии человека. Отличием также является тот факт, что имплантация сосуда проводилась на детеныше макаки, возрастом 18 месяцев. В течение 6 месяцев наблюдения, вес животного увеличился с 4,5 до 6,0 кг, Показатель наружной морфометрии, который отражает рост животного, - расстояние мечевидный отросток-симфиз увеличилось со 170 до 220 мм, длина имплантированной матрицы увеличилась с 1,9 мм до 2,7 мм. При этом по результатам объективного наблюдения, которое включало ультразвуковую диагностику и метод мультиспиральной компьютерной томографии, полностью сохранялась проходимость сосуда, отсутствовали признаки стенозов и образования аневризм. Это позволяет рекомендовать разработанный имплантат в практике реконструкции сосудов в педиатрии.

Только совокупность существенных признаков заявляемого имплантата кровеносных сосудов – двухслойность, полимерный состав слоев, их структура, прочностные и деформационные характеристики, позволяет достичь указанного технического результата.

Неочевидным из уровня техники является факт, что в процессе получения имплантата сосуда формируется нановолоконная структура, состоящая из двух слоев биорезорбируемых полимеров, внутреннего - из нановолокон поли(L-лактида), обработанных при температуре из интервала Т= 70-90°С в течение 30 – 120 мин, и наружного слоя из нановолокон поли(ε-капролактона). При этом имплантат не содержит тромборезистивных и нерезорбируемых добавок, обладает комплексом прочностных, упругих и деформационных характеристик, обеспечивающих их стабильность в течение всего времени протекания биохимических процессов, сопровождающих ремоделирование кровеносного сосуда. Конструкция позволяет выполнять все манипуляции, связанные с его стерилизацией, а также выполнением анастомозов при имплантации.

Ни в одном из аналогов не удалось при комбинации полимерных слоев получить результат заявляемого изобретения. Это позволяет утверждать о соответствии заявляемого имплантата сосуда условию патентоспособности «изобретательский уровень».

Графические материалы:

Фиг. 1 - микрофотографии поверхности имплантата сосуда на основе нановолокон из поли(L-лактида).

Фиг. 2 - микрофотографии поверхности имплантата сосуда на основе нановолокон из поли(ε-капролактона).

Фиг. 3 - микрофотографии имплантата сосуда на основе нановолокон из поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона).

Фиг. 4 - результаты гистологического анализа фрагмента стенки имплантата через 1 месяц после имплантации в брюшную аорту крысы.

а) окраска гематоксилином и эозином . Ув. 40х;

б) окраска гематоксилином и эозином по методу Маллори. Ув. 100х

Фиг. 5 - результаты гистологического анализа фрагмента стенки сосуда через 6 мес. после имплантации в брюшную аорту крысы.

а-в) окраска гематоксилином и эозином;

г) окраска гематоксилином и эозином по методу Маллори. Ув. 40х.

Фиг. 6 - результаты гистологического анализа фрагмента стенки сосуда через 24 мес. после имплантации в брюшную аорту крысы.

а) окраска гематоксилином и эозином;

б) окраска гематоксилином и эозином по методу Маллори (б). Ув. 100х (а, б).

Фиг. 7

а) фотография мобилизованной задней полой вены примата;

б) фотография имплантированной композиционной трубки в заднюю полую вену примата;

в) фотография внешнего вида имплантата после пуска кровотока;

г) фотография контрольного УЗ-исследования сосуда после 6 месяцев имплантации.

Сущность изобретения и подтверждение возможности его осуществления наиболее полно раскрываются в примерах получения биорезорбируемого имплантата кровеносного сосуда.

Пример 1

Для получения биорезорбируемого имплантата на основе нановолокон из поли(L-лактида) использовали полилактид фирмы Corbion PURAC с молекулярной массой 20 кДа, в качестве растворителя использовали хлороформ, марки ч.д.а., производства фирмы Экос-1, Россия. Полимер растворяли при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 60-90 минут. Концентрация полимера в растворе составляла 16 мас.%.

Трубки из нановолокон получали методом электроформования при скорости вращения приемного цилиндрического электрода диаметром 1,0 мм, 2500 оборотов в минуту, напряжении 27-29 кВ, скорости подачи раствора 0,5-0,7 мл/ч, расстоянии между подающим и приемным электродом 150 мм.

Прочностные, деформационные и упругие свойства трубки приведены в таблице1. Свойства полученной трубки, низкий модуль упругости и высокая эластическая деформация не позволили ее использовать в качестве имплантата, выполнять манипуляции, необходимые при имплантации сосудов малого диаметра.

Пример 2. Трубку на основе нановолокон из поли(L-лактида), полученную по способу, описанному в примере 1, подвергали термической обработке при Т=80°C в течение 1 часа в фиксированном состоянии. Микрофотографии имплантата приведены на фиг. 1. Прочностные, деформационные и упругие свойства трубки приведены в таблице1. Трубку использовали в качестве имплантата аорты крысы.

Через 64 недели после имплантации в аорту крысы, формировались неоинтима и неоадвентиция, идентичные натуральным. Вместе с тем, наблюдалось значительное количество аневризм различного размера.

Пример 3

Трубку на основе нановолокон из поли(L-лактида), полученную по способу, описанному в примере 1, подвергали термической обработке при Т=90°C в течение 1 часа в фиксированном состоянии. Прочностные, деформационные и упругие свойства трубки приведены в таблице1. Трубка обладала повышенной жесткостью, что осложняло ее использование при хирургических манипуляциях по имплантации сосудов малого диаметра.

Пример 4

Трубку на основе нановолокон из поли(L-лактида), полученную по способу, описанному в примере 1, подвергали термической обработке при Т=120°C в течение 1 часа в фиксированном состоянии. Трубка обладала повышенной жесткостью, что делало невозможным ее использование при хирургических манипуляциях по имплантации сосудов малого диаметра.

Пример 5

Для получения биорезорбируемого имплантата на основе нановолокон из поли(ε-капролактона) использовали капролактон фирмы Corbion PURAC с молекулярной массой 115кДа, в качестве растворителя использовали хлороформ, марки ч.д.а., производства фирмы Экос-1, Россия. Полимер растворяли при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 60-90 минут. Концентрация полимера в растворе составляла 12 мас.%

Трубки из нановолокон получали методом электроформования при скорости вращения приемного цилиндрического электрода диаметром 1,0 мм 2500 оборотов в минуту, напряжении 27-29 кВ, скорости подачи раствора 0,5-1,0 мл/ч, расстоянии между подающим и приемным электродом 150 мм.

Микрофотографии имплантата приведены на фиг. 2. Прочностные, деформационные и упругие свойства трубки приведены в таблице 1. Свойства полученной трубки, в частности, низкий модуль упругости и высокая эластическая деформация не позволили выполнять манипуляции, необходимые при имплантации сосудов малого диаметра.

Пример 6

Композиционную трубку на основе микро- и нановолокон получали методом электроформования при скорости вращения приемного электрода 2500 оборотов в минуту, при напряжении 25-29 кВ, скорости подачи раствора 0,5-1,0 мл/ч, расстояние между подающим и приемным электродом 150 мм. Диаметр приемного электрода составлял 1,0 мм. Формовали внутренний слой трубки из нановолокон поли(L-лактида, который подвергали термообработке при Т=80°C. Затем поверх слоя из поли(L-лактида) формировали внешний слой из поли(ε-капролактона). Толщина слоев из поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона) была примерно одинаковая, 150-200 мкм. Микрофотографии имплантата, полученные методом сканирующей электронной микроскопии, приведены на фиг. 3. Прочностные, деформационные и упругие свойства трубки приведены в таблице 1.

Разработанную двухслойную трубку длиной 2 мм, наружным диаметром 1 мм имплантировали в брюшную аорту крысы породы Wistar (питомник «Рапполово» РАМН, г. Санкт-Петербург), массой тела 200±27 гр. В процессе исследования, животных выводили из эксперимента и проводили гистологический анализ имплантата. Срок наблюдения составлял до 24 месяцев.

Процесс имплантации включал: Y-образную лапаротомию, перемещение органокомплекса в правую половину брюшной полости, мобилизацию инфраренального отдела аорты до бифуркации, лигирование поясничных артерий, наложение микрохирургических клипс, резекцию брюшной аорты 2±0,5 мм, протезирование матрицей, восстановление кровотока, визуальный контроль проходимости имплантата. Проходимость имплантированного сосуда оценивали классической методикой сразу вслед за вшиванием протеза и через 30 минут после этого. Ушивание лапаротомной раны послойно рассасывающейся нитью с антибактериальным покрытием (Vicryl Plus, 4-0, VCP496H, Ethicon, США). Антикоагулянты и дезагреганты во время операции не использовали. Анастезию осуществляли внутрибрюшинным введением препаратов «Рометар» и «Золетил-100», с предварительной премедекацией подкожным введением атропина сульфата. Содержание и работу с животными проводили в соответствии с приказом МЗ РФ № 708 н «Об утверждении Правил лабораторной практики».

После выведения животных из опыта, проводили морфологические исследования полученных эксплантатов. Препараты фиксировали в 10 % нейтральном забуференном формалине (pH 7.4) в течение 24 часов. Парафиновые срезы толщиной 5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, методом Маллори (Bio-Optica, Италия). Микроскопический анализ проводили на световом микроскопе Leica DM750 (Leica, Германия) при окуляре 10, объективе 4, 10, 40 и 100. Фотосъёмку выполняли с помощью фотокамеры ICC50 (Leica, Германия). Для CD-68 положительных клеток (макрофаги, моноциты, гигантские многоядерные клетки инородных тел) использовали иммуногистохимический (ИГХ) метод. Применяли моноклональные антитела к CD-68 (Anti-CD68 antibody, Abcam, Великобритания).

Через 1 месяц эксперимента в зоне сосудистого анастомоза на внутренней поверхности наблюдается переход неоинтимы нативного сосуда на матрицу. Внутренний слой комбинированной полимерной матрицы покрыт эндотелием, лежащем на тонком субэндотелиальном слое. Между волокнами полимера определяются многочисленные клетки соединительной ткани (фибробласты, фиброциты, миофибробласты) и воспалительного ряда (лимфоциты, макрофаги, гигантские многоядерные клетки инородных тел), умеренное количество коллагеновых волокон. Неоадвентиция представлена тонкой, слабо выраженной полоской соединительной ткани с единичными сосудами (фиг. 4).

Через 6 месяцев эксперимента сформированная неоинтима имплантата представлена эндотелием и субэндотелиальным слоем с отчетливыми коллагеновыми волокнами и ориентированными гладкомышечными клетками. Во внутреннем слое матрицы коллагеновых волокон мало, в наружном – умеренное количество. Клеточность во внутреннем слое матрицы выражена слабо, а в наружном – умеренно. В части препаратов по наружному краю матрицы выявляется вал из гигантских многоядерных клеток инородных тел, внутри от которого располагается достаточно толстый пучок плотно лежащих коллагеновых волокон. Неоадвентиция состоит из коллагеновых волокон, клеток воспалительного ряда, многочисленных vasa vasorum.

Через 24 месяца стенка имплантата представлена тремя четко дифференцированными слоями: на внутренней поверхности располагается сформированная неоинтима (эндотелиальные клетки, коллагеновые волокна, гладкомышечные клетки); основной средний слой представлен клетками (фибробласты, фиброциты, миофибробласты) и волокнами соединительной ткани (коллагеновые, эластиновые волокна), фрагментами остатков полимера; неоадвентиция с сетью коллагеновых волокон, множеством vasa vasorum, отдельными гигантскими многоядерными клетками инородных тел и макрофагами (фиг. 5).

Пример 7

Композиционную трубку диаметром 4 мм и толщиной стенок 0,4 мм и длиной 1,9 мм, способ получения которой описан в примере 6, имплантировали в заднюю полую вену примата, самца гамадрилы павиана анубиса, возраст животного составлял 18 мес., масса тела 4,6 кг. Выполнены лабораторные исследования: общеклинический анализ крови, коагулограмма, проведена морфометрия наружная и интраоперационная, УЗ-исследование зоны реконструкции на раннем послеоперационном периоде проводили через 1, 3, 14 суток, после чего проводился ежемесячный контроль. Через 5 месяцев проведена КТ-ангиография. Перед обследованием проводили медикаментозную седатацию комбинацией препаратов Ксилазин (1-3 мг/кг или 0.1 мл/кг) и Золетил (3-8 мг/кг или 0.1 мл/кг), постановку венозного доступа с помощью периферического венозного катетера размером 20 G, углубление анестезии гипнотиком Пропофолом (2мг/кг), оротрахеальная интубация эндотрахеальной трубкой размером 4.5, перевод на АИВЛ с поддержанием анестезии ингаляционным анестетиком Севофлюраном; дробное внутривенное введение Ксилазина+Золетила (по 0.1 мл/кг) каждые 30-40 минут и проведение ингаляционной анестезии Севофлюраном. Интраоперационная антибиотикотерапия – Цефтриаксон 50 мг/кг за 30 минут до разреза. Осмотр животного проводили через 1, 3 и 6 мес. с применением морфометрии, ультразвуковой диагностики и мультиспиральной компьютерной томографии под медикаментозной седатацией.

Имплантация включала лапаротомию, мобилизацию кишечника, доступ в забрюшинное пространство, выделение задней полой вены от конфлюенса подвздошных вен до почечных вен, (фиг. 7а), интраоперационная морфометрия (диаметр и длина инфраренального отдела задней полой вены), пережатие задней полой вены, иссечение сегмента вены, (фиг. 7б,) реконструкция удаленного участка биоразлагаемой полимерной матрицей с наложением сосудистых анастомозов с использованием операционного микроскопа, запуск кровотока, ( фиг. 7в), контроль гемостаза, ушивание раны.

Оперативное вмешательство, ранний и поздний послеоперационный периоды протекали без осложнений. Через 6 мес. у животного отсутствовали внешние признаки венозной гипертензии нижней половины туловища, задних конечностей, масса животного достигла 6 кг. Показатель наружной морфометрии, отражающий рост животного, в частности, расстояние мечевидный отросток-симфиз, увеличилось со 170 до 220 мм. При контрольном ультразвуковом исследовании, (фиг. 8г), выявлено, что внутренний диаметр имплантата не претерпевает изменений и остается на уровне 4 мм, длина имплантированной части сосуда увеличилась с 1,9 мм до 2,7 мм. Сосудистая реконструкция проходима, скоростные показатели соответствуют физиологической норме, внутренняя поверхность ровная, гладкая. При МСКТ исследовании подтверждена проходимость сосуда, (фиг. 7г), отсутствие стенозов в области анастомозов и патологического влияния имплантата на окружающие ткани.

Реализация заявляемого изобретения не исчерпывается приведенными примерами.

Выход за рамки верхних и нижних границ заявляемых интервалов приводит к невозможности его получения, либо к резкому снижению качества заявляемого имплантата, о чем свидетельствуют данные, приведенные в примерах №№ 1, 5.

Данные, приведенные в примерах №№ 2 – 4 и 6 - 7 свидетельствуют о том, что в результате реализации заявляемого изобретения получены бирезорбируемые имплантаты кровеносных сосудов, отвечающие основным требованиям, предъявляемым к изделиям такого назначения. Исследование in vivo на примере имплантации в аорту крысы и вену примата, показало высокую эффективность его использования в сосудистой хирургии при реконструкции кровеносных сосудов.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение методом электроформования резорбируемого имплантата кровеносных сосудов на основе нановолокон из поли(L-лактила) и поли(ε-капролактона). Имплантат характеризуется наличием внутреннего слоя толщиной 50–250 мкм из нановолокон поли(L-лактида), обработанных при температуре из интервала Т=70-90°C в течение 30–120 минут и наружного слоя из нановолокон поли(ε-капролактона) или сополимера поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона) с соотношением мономерных звеньев от 50:50 до 90:10 толщиной 50-250 мкм. Наружный диаметр имплантата составляет 1,0-10,0 мм, внутренний диаметр составляет 0,5-9,5 мм.

Имплантат обладает порочностью σ=1,75±0,58 МПа, относительным удлинением при разрыве ε=150±10,07%, модулем упругости Е от 10 до 70 МПа. Прочностные и деформационные характеристики позволяют проводить с имплантатом манипуляции, необходимые для сосудистой хирургии, от стерилизации до выполнения анастомозов. Многочисленные эксперименты на крысах показали образование эндотелиального слоя на внутренней поверхности имплантата через 4 недели наблюдения. Это приводит к минимальным рискам тромбоза, не требует применения тромборезистентных препаратов при послеоперационной терапии.

Результаты экспериментов in vivo, проведенные на приматах по имплантации вены нижней конечности, дают основания рекомендовать разработанный имплантат для проведения исследований по реконструкции кровеносных сосудов человека.

Важным техническим результатом заявленного изобретения является то, что эксперименты in vivo по имплантации сосуда приматам проводились на детеныше самца гамадрилы павиана анубиса. В процессе его роста и развития размер имплантата увеличился с 1,9 мм до 2,7 мм. Это делает перспективным применение биорезорбируемого имплантата на основе нановолокон в педиатрии. Увеличение размера имплантата с ростом реципиента не потребует повторных операций по замене имплантата. Минимальный размер диаметра имплантата, 1,0 мм, толщина его стенок, до 0,5 мм, как показали исследования in vivo, проведенные на крысах, позволяет его использовать при реконструкции сосудов малого диаметра.

Claims (1)

1. Биорезорбируемый трубчатый имплантат кровеносных сосудов на основе нановолокон из поли(L-лактида) и поли(ε-капролактона), состоящий из двух слоев, отличающийся тем, что внутренний слой имплантата, толщиной 50–250 мкм, состоит из нановолокон поли(L-лактида), обработанных при температуре из интервала Т=70-90°C в течение 30–120 минут, наружный слой имплантата, толщиной 50-250 мкм состоит из нановолокон поли(ε-капролактона), модуль упругости Е имплантата составляет от 10 до 70 МПа, внешний диаметр имплантата составляет 1,0-10,0 мм, внутренний диаметр составляет 0,5-9,5 мм.