CN104774762A - 一种取向聚合物纳米纤维细胞培养板及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于取向聚合物纳米纤维的细胞培养板及其制备方法，所述细胞培养板包括作为主体的标准平底细胞培养板，以及附着于培养板孔底的聚合物纳米纤维支架。所述聚合物纳米纤维支架是以聚合物主要原材料加入生物活性成分接枝或共混，通过静电纺丝方法并依靠平行导电面板的纤维收集装置获得，所述聚合物纳米纤维支架上的纤维束具有较规整的取向排列结构。本发明的培养板具有较好的生物相容性，适用于具有取向形态特征的细胞或组织培养，特别是神经、骨、肌肉、韧带等细胞和相关组织的培养和再生。

Description

一种取向聚合物纳米纤维细胞培养板及其制备方法

技术领域

本发明属于细胞和组织培养耗材领域，尤其涉及到一种基于取向聚合物纳米纤维支架的细胞培养板及其制备方法，该细胞培养板可用于具有取向形态特征的细胞或组织的培养和再生。

背景技术

组织再生近年来一直处于生物医学领域的前沿，而细胞体外培养支架是组织再生的基础，其作为人工细胞外基质（ECM），为细胞的停泊、生长、繁殖、新陈代谢提供三维空间，支撑细胞成长为完整的组织。因此，细胞体外培养支架材料已成为组织工程研究的重点。细胞体外培养支架材料除了需具有良好的生物相容性和生物可降解性外，还需具有一定的亲水性和良好的细胞吸附性/粘附性，常见的支架材料大致可分为以下两大类：

（1）多孔材料（或海绵/泡沫状材料）

主要是指由生物相容的聚合物、或者具有生物活性的无机物、或者二者杂化制成的多孔/海绵状支架，如：L. Palamaro等人通过相转化和盐浸出技术制备的聚己内酯三维多孔支架（见文献：Human skin-derived keratinocytes and fibroblasts co-cultured on 3D polyε-caprolactone scaffold support in vitro HSC differentiation into T-lineage committed cells[J] International Immunology, 2013, 12 (25): 703–714）；A. Finoli等人使用乳液铸造法制得的高孔隙率的羟基磷灰石泡沫支架（见文献：Ceramic scaffolds for in vitro culturing of primary human cells[J] Advances in Applied Ceramics, 2012, 5&6 (111): 262-268）；以及王大平等人通过冷冻干燥法制得的“纳米羟基磷灰石-PLGA复合支架”（见文献：nHA-PLGA支架材料与兔软骨细胞体外培养的生物相容性研究[J]国际骨科杂志, 2013, 4 (34): 283-286）。

（2）聚合物纤维材料

主要是指生物相容的聚合物制成的纤维无纺布/毡、编织物、中空纤维及其他结构的纤维状支架，如：Abrahamsson等人将聚己内酯无纺织物三维支架用于人间充质干细胞的体外培养（见文献：Chondrogenesis and Mineralization During In Vitro Culture of Human Mesenchymal Stem Cells on Three-Dimensional Woven Scaffolds[J] Tissue Engineering Part A, 2010, 12 (16): 3709-3718）； Aghdam等人将聚己内酯和聚羟基乙酸的的混合物的静电纺无纺毡用于心脏祖细胞的体外培养（见文献：Fabrication of a Nano?brous Scaffold for the In Vitro Culture of Cardiac Progenitor Cells for Myocardial Regeneration[J] International Journal of Polymeric Materials and Polymeric Biomaterials, 2013, 5 (63): 229–239）；沈新元等人将干湿纺聚乳酸/ 壳聚糖纤维交织织物用于成骨细胞的体外培养（见文献：干湿纺聚乳酸/ 壳聚糖纤维交织织物作为细胞体外培养载体的实验观察[J] 上海生物医学工程, 2006, 4 (27): 205-209）；葛丽芹等人以一些水溶性聚电解质的静电纺纤维为模板，结合层层自组装技术制成多层中空纳米纤维，并以此为细胞培养的载体（见中国发明专利CN100463713C：用于细胞培养的多层中空纳米纤维及制备方法），等等。

以上两类支架材料中，其中聚合物纤维材料，尤其像聚己内酯、聚乳酸、壳聚糖等常见的生物高分子制成的静电纺纳米纤维支架，目前在动物细胞体外培养的研究中应用最为广泛。这是因为这些聚合物生物相容性好，其静电纺纳米纤维在结构上比较接近动物细胞的ECM，仿生程度较高，较大的孔隙率和比表面积有利于细胞黏附生长。而在这些静电纺纳米纤维细胞支架中，尤以纤维无序排列的纳米纤维毡的研究居多，这主要是由材料静电纺丝成型时各向同性的特点（即纤维毡上的纤维沿任意方向排列的概率都相同）所决定的。另外，根据动物细胞生长的“接触诱导”理论，在杂乱无序的纳米纤维支架上，细胞的分化生长也呈现出各向同性的特点，有利于获得比较均匀的细胞组织，这就使得无序排列的纳米纤维支架适用于大部分动物细胞和组织的培养。

然而，像肌肉、韧带、神经、骨等组织中的细胞，其生长分化呈现出较高的取向性，最终长成有序排列的组织，普通的多孔材料或无序排列的纳米纤维支架都不能满足这些细胞和组织培养再生的需要。图1a和1b所示的是取向排布的人类心肌细胞组织显微图像。因此，具有取向结构的聚合物纳米纤维支架逐渐得到这一领域研究者们的青睐。如：Gao等人制备取向排列的静电纺PLLA纳米纤维支架的研究表明，该支架对角膜间质细胞在体外培养中的取向生长起到了主导作用（见文献：Aligned Fibrous Scaffold Induced Aligned Growth of Corneal Stroma Cells in vitro Culture[J] Chemical Research in Chinese Universities, 2012, 6 (28): 1022-1025）；Xie等人通过比较无规排列和取向排列的静电纺PLGA纳米纤维支架对肌腱成纤维细胞的体外培养的研究中发现，取向排列的支架上细胞生长高度有序，而无规排列的支架上细胞生长杂乱无章（见文献："Aligned-to-random" nanofiber scaffolds for mimicking the structure of the tendon-to-bone insertion site[J] Nanoscale, 2010, 6 (2): 923-926 ）；Meng等人比较了取向排列和无规排列的静电纺PLGA/明胶纳米纤维支架对成骨细胞体外培养的影响，结果表明取向排列的支架上细胞组织沿着与纤维取向的方向生长和伸长，且该支架上的细胞成活数与无规排列的支架上的细胞成活数相近（见文献：Electrospinning of PLGA/gelatin randomly-oriented and aligned nanofibers as potential scaffold in tissue engineering[J] Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications, 2010, 8 (30): 1204-1210）； Subramanian等人则将单向对齐排列和无规排列的静电纺PLGA纳米纤维支架用于神经再生研究，与无规排列的支架相比，单向对齐排列的支架上生长的雪旺细胞能定向生长且有更快的细胞增殖速率（见文献：Fabrication of uniaxially aligned 3D electrospun scaffolds for neural regeneration[J] Biomedical Materials, 2011, 2 (6): 1-10）。目前尚无同类的针对上述具有取向形态特征的细胞或组织的集成支架式细胞培养耗材产品在国内外市场上出现。

上述各类取向排列静电纺纳米纤维支架的制备都涉及到对传统静电纺丝设备的改进，本领域内技术人员所熟知的做法是使用新型的纤维收集装置来替换传统的平板式纤维收集装置，像滚筒（或称为转轴）、转盘、平行电极、图案电极、导电模板、磁场电极等，上述Xie和Subramanian的研究中就是分别使用了平行电极和转轴收集装置（各类新型的取向排列静电纺纳米纤维收集装置综合介绍可参考文献：章青. 管状仿生血管支架的制备及诱导VSMCs取向生长研究[D] 浙江工业大学, 2010.）。这些新型的纤维收集装置中，其中要数滚筒（转轴）收集装置纤维产率最高，可以大面积制备取向纳米纤维。其次，平行电极收集装置最为简单而行之有效，得到的纳米纤维排列高度有序且纤维取向排列的面积较大。而其他几种收集装置都存在装置复杂、纳米纤维产率较低或者纤维取向排列面积较小等方面的问题，限制了产业化应用。

发明内容

本发明的目的是为了解决上述高有序度纳米纤维支架的产业化制备问题，提供一种取向纳米纤维支架及其制备方法，以及将其集成到培养板载体上制成细胞和组织培养制品，该类培养制品可专门用于具有取向形态特征的细胞或组织（如肌肉、韧带、神经、骨等细胞组织）的培养和再生。

本发明的目的之一是通过下述技术方案来实现：

一种基于取向聚合物纳米纤维的细胞培养板，其中：所述细胞培养板在结构上包括作为主体的标准平底细胞培养板，以及附着于培养板孔底的聚合物纳米纤维支架。其中标准平底细胞培养板可为6孔板或12孔板，或24孔板。

所述聚合物纳米纤维支架包括取向排列的聚合物纳米纤维束和用于搭载该聚合物纳米纤维束的圆环薄片。更进一步地，所述用于搭载聚合物纳米纤维束的圆环薄片厚度不超过1 mm，其外径略小于所述平底细胞培养板单个孔的孔径。

本发明中所涉及的“取向”或“取向排列”、 “有序”或“有序排列”、“对齐”或“对齐排列”概念均指代多根纤维沿着同一个主轴方向平行排列或近似地平行排列，形成较为整齐的纤维束或纤维网面结构。

本发明的聚合物纳米纤维支架，所述用于搭载该聚合物纳米纤维束的圆环薄片由生物惰性材料制成。更进一步地，所述生物惰性材料为304不锈钢、聚四氟乙烯（PTFE）、聚乙烯（PE）及生物陶瓷中的一种或几种。

本发明的聚合物纳米纤维以聚合物为原材料，通过共混或接枝的方式加入生物活性成分制成。更进一步地，所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）、聚-3-羟基丁酸、聚己内酯（PCL）、聚丁二酸丁二醇酯（PBS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚氨酯（PU）、聚胺（PA）、聚酰胺（PAN）、丝素蛋白、胶原蛋白、明胶、壳聚糖中的一种或几种；所述生物活性成分为羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃、多肽、或NGF、FGF、BMPs、TGF-β生长因子中的一种或几种。

本发明的另一目的是提供一种取向聚合物纳米纤维细胞培养板的制备方法，包括以下四个步骤：

（1）静电纺丝液的配制

将聚合物原材料和生物活性成分一起溶解在溶剂中形成聚合物溶液，或是加热制成聚合物熔融体，或是通过溶胶凝胶法制成聚合物溶胶-凝胶；

（2）静电纺丝和纳米纤维束的接收

先将步骤（1）中制得的聚合物溶液、聚合物熔体或聚合物溶胶-凝胶加入注射器中，在所述注射器的针尖电压为5 kV-50 kV和泵供量为0.001 ml/min-0.100 ml/min的条件下进行静电纺丝，再将得到的纳米纤维沉积在静电纺丝装置上的收集区域内，形成取向排列的纳米纤维束或纤维网面，纤维直径为15 nm-500 nm。

（3）纳米纤维支架的搭建

将步骤（2）中沉积的纳米纤维束或纤维网面搭载到表面预处理过的圆环薄片载体上，形成纳米纤维支架。

（4）纳米纤维支架的放置或固定

将步骤（3）中搭建好的纳米纤维支架放置或固定到标准平底细胞培养板的孔底，形成集成支架式的细胞培养板。

本发明的取向聚合物纳米纤维细胞培养板的制备方法，进一步地，在静电纺丝液的配制步骤中，所述聚合物原材料包括聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）、聚-3-羟基丁酸、聚己内酯（PCL）、聚丁二酸丁二醇酯（PBS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚氨酯（PU）、聚胺（PA）、聚酰胺（PAN）等合成聚合物、或者丝素蛋白、胶原蛋白、明胶、壳聚糖等天然聚合物中的一种或几种的组合，所述生物活性成分包括羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃、多肽、或NGF、FGF、BMPs、TGF-β等生长因子中的一种或多种。

本发明取向聚合物纳米纤维细胞培养板的制备方法，进一步地，在静电纺丝液的配制步骤中，所述溶剂为下述的一种体系或多种体系的混合：水、水/氯化钠、水/氯化钙、水/溴化锂、乙醇、甲酸、乙酸、乙腈、甲酚、四氢呋喃、三氟乙醇、三氟乙酸、二氯甲烷、三氯甲烷、N, N-二甲基甲酰胺或六氟异丙醇。

本发明取向聚合物纳米纤维细胞培养板的制备方法，进一步地，在静电纺丝和纳米纤维束的接收步骤中，所述的静电纺丝的收集区域是由两块平行的导电面板之间形成的空气间隙。

本发明取向聚合物纳米纤维细胞培养板的制备方法，优选地，在静电纺丝和纳米纤维束的接收步骤中，所述的静电纺丝的收集区域是由两块平行的履带式（传送带式）的导电面板之间形成的空气间隙。与静态的平行导电面板收集装置相比，履带式平行导电面板收集装置的纤维产率大大提高，可以大面积制备取向纳米纤维。换句话说，该装置将上文所述的平行电极式和滚筒式收集装置的优点集于一身，可解决高有序度纳米纤维产业化应用的难题。

在静电纺丝和纳米纤维束的接收步骤中，沉积的纳米纤维束是较为稀疏的单层，纤维之间没有粘连，或者沉积的纳米纤维束是较为紧密的纤维网面。取向纳米纤维束的稀疏程度主要是通过履带式平行导电面板的转速来控制的。

本发明还提供上述取向聚合物纳米纤维细胞培养板的用途，其专门应用于具有取向形态特征的细胞或组织培养，特别是用于神经、骨、肌肉、韧带等细胞和相关组织的培养和再生。通过本发明取向聚合物纳米纤维细胞培养板或相同技术衍生的产品（如培养皿等其他细胞培养制品），所获得的上述细胞和组织在生长形态上最接近于动物或人的原生组织。

本发明的技术效果主要体现在：

（1）   本发明所需的主要原材料均为常见的医用高分子材料，原料易得、成本较低、有较好的生物相容性、生物活性及生物可降解性，且无细胞毒性，对培养基无影响；

（2）   本发明的静电纺聚合物纳米纤维支架在结构上比较接近动物细胞的ECM，仿生程度较高，具有较大的孔隙率和比表面积，有利于细胞黏附生长，保持细胞成活率；

（3）   使用本发明的取向聚合物纳米纤维支架培养细胞，在支架上的取向排列纤维束的“接触诱导”下，细胞沿纤维束的主轴方向定向地分化、生长，最终得到所需的具有取向形态的组织；

（4）   本发明包含的技术专门用于具有取向形态特征的细胞或组织的培养，如神经、骨、肌肉、韧带等细胞和相关组织，通过本发明技术制得的细胞培养板或其他的衍生产品（如细胞培养皿）可以批量再生上述细胞组织。

附图说明

图1a是取向排布的人类心肌细胞组织显微图像；

图1b是取向排布的人类心肌细胞组织显微图像局部放大图；

图2是本发明用于静电纺丝的基础型平行导电面板收集装置示意图；

图3a是本发明用于静电纺丝的履带式平行导电面板收集装置示意图；

图3b是本发明履带式平行导电面板收集装置的纤维收集原理图；

图3c是本发明通过履带式平行导电面板收集装置得到的取向纤维阵列空间示意图；

图4是是本发明一体化方式搭建取向纳米聚合物纤维支架的示意图；

图5a是本发明取向聚合物纳米纤维6孔细胞培养板的示意图；

图5b是本发明取向聚合物纳米纤维6孔细胞培养板单个孔底的示意图；

图6是使用本发明技术对脊髓神经细胞的诱导取向再生培养的激光共聚焦显微图像；

图7是使用本发明技术对成骨细胞皮质骨的诱导取向再生培养的激光共聚焦显微图像。

图中，1-培养板孔底； 2-支架搭载圆环；3-聚合物纳米纤维束；4-高压电源；5-喷丝针头；6-纤维射流；7-第一导电面板；8-第二导电面板；9-空气间隙；10-取向纤维；11-第一履带式导电面板；12-第二履带式导电面板；13-接地板；14-第一介电式固定支撑架；15-第二介电式固定支撑架；16-纤维网面；17-传送带。

具体实施方式：

下面结合附图与具体实施例对本发明进行说明，所举的实施例仅是对本发明产品或方法作概括性例示，有助于更好地理解本发明，但并不会限制本发明范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

本发明取向聚合物纳米纤维细胞培养板，在结构上包括作为主体的标准平底细胞培养板，如6孔板或12孔板，或24孔板，以及附着于培养板孔底的聚合物纳米纤维支架。聚合物纳米纤维支架包括取向排列的聚合物纳米纤维束和用于搭载该聚合物纳米纤维束的圆环薄片。用于搭载该聚合物纳米纤维束的圆环薄片由生物惰性材料制成，如304不锈钢、聚四氟乙烯（PTFE）、聚乙烯（PE）及生物陶瓷等。其中用于搭载聚合物纳米纤维束的圆环薄片厚度不超过1 mm，其外径略小于所述平底细胞培养板单个孔的孔径。聚合物纳米纤维的主要聚合物原材料包括聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）、聚-3-羟基丁酸、聚己内酯（PCL）、聚丁二酸丁二醇酯（PBS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚氨酯（PU）、聚胺（PA）、聚酰胺（PAN）等合成聚合物、或者丝素蛋白、胶原蛋白、明胶、壳聚糖等天然聚合物中的一种或几种的组合。优选地，所述主要聚合物原材料由PLGA、PCL和胶原蛋白组成，质量比为7: 2.5: 0.5。所述聚合物纳米纤维中还包括一种或多种其他的生物活性成分，如：羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃、多肽、或NGF、FGF、BMPs、TGF-β等生长因子，其通过与聚合物成分共混或接枝的方式加入。

本发明用于制备上述任意一种取向聚合物纳米纤维细胞培养板的方法，包括静电纺丝液的配制、静电纺丝和纳米纤维束的接收、纳米纤维支架的搭建、纳米纤维支架的固定四个步骤，详述如下：

静电纺丝液的配制步骤：

将聚合物原材料和生物活性成分一起溶解在溶剂中形成聚合物溶液，或是加热制成聚合物熔融体，或是通过溶胶凝胶法制成聚合物溶胶-凝胶。

所述聚合物原材料包括聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）、聚-3-羟基丁酸、聚己内酯（PCL）、聚丁二酸丁二醇酯（PBS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚氨酯（PU）、聚胺（PA）、聚酰胺（PAN）等合成聚合物、或者丝素蛋白、胶原蛋白、明胶、壳聚糖等天然聚合物中的一种或几种的组合。所述溶剂为水、水/氯化钠、水/氯化钙、水/溴化锂、乙醇、甲酸、乙酸、乙腈、甲酚、四氢呋喃、三氟乙醇、三氟乙酸、二氯甲烷、三氯甲烷、N, N-二甲基甲酰胺或六氟异丙醇中的一种体系或多种体系的混合。优选地，所述聚合物原材料由PLGA、PCL和胶原蛋白组成，质量比为7: 2.5: 0.5。所述生物活性成分包括羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃、多肽、或NGF、FGF、BMPs、TGF-β等生长因子。进一步地，所述聚合物原材料和生物活性成分的质量比范围为1000:1-10:1。其中，根据所述聚合物原材料和生物活性成分的种类不同，二者质量比可能是100:1，也或者是50:1，或者其他合适的比值。

静电纺丝和纳米纤维束的接收步骤：

先将上一步制得的聚合物溶液、聚合物熔体或聚合物溶胶-凝胶加入注射器中，在所述注射器的针尖电压为5 kV-50 kV和泵供量为0.001 ml/min-0.100 ml/min的条件下进行静电纺丝，再将得到的纳米纤维沉积在静电纺丝装置上的收集区域内，形成取向排列的纳米纤维束或纤维网面，纤维直径在15 nm-500 nm范围内。

所述静电纺丝的收集区域是由两块平行的导电面板之间形成的空气间隙。图2所示是一种基础型的平行导电面板收集装置，在高压电场力作用下，带正电的聚合物纺丝液射流从喷丝针头喷向带负电的收集板，纤维落在两块平行的导电面板之间的空气间隙处，其两端由于同时受到受库仑引力的作用，最终当纤维趋近于和两块平行面板相垂直地排列时达到受力平衡状态，所以收集区域（空气间隙）内的纤维束是高度取向排列的。

优选地，所述静电纺丝的收集区域是由两块平行的履带式（传送带式）的导电面板之间形成的空气间隙。图3a、3b、3c所示的是履带式平行导电面板收集装置及其工作原理。该装置中两块导电面板设置成沿着喷丝针头的方向呈轴对称地平行转动（即两块导电面板上的面对面部分的线速度方向为图3c所示的z轴负方向），两块导电面板间的空气间隙9由此升级成了一个三维的纤维收集隔间，而在收集隔间底部有一个连有接地板13的介电式固定支撑架14和15。当高度取向的纤维束落在两块履带式平行导电面板11和12之间，纤维两端由于受到面板运动的剪切力而被切断，随着履带式面板的运动，纤维被逐渐带入收集隔间底部的固定支撑架上，形成高度有序的纳米纤维束或纤维网面16。如图3c所示，通过该履带式平行导电面板收集装置，可以最终得到一定长、宽和深幅（分别以L、W和D表示）的取向纳米纤维阵列，L即为导电面板的宽度，W为两块导电面板的间距，D则是固定支撑架到导电面板顶部的距离。接地板13不但可以防止纤维上聚集正电荷，以免受纤维之间库伦斥力影响而导致纤维断裂，而且有利于形成更大深幅的纤维阵列。当然，介电式固定支撑架上可能还包括能将纤维束从导电面板上分离下来的组件，该组件可以是具备剪切或切割作用的任何合适的器具，如刀片、楔形物，碟形物等，本发明中不另作详述。

本步骤中所沉积的纳米纤维束是较为稀疏的单层，纤维之间没有粘连，或者是较为紧密的纤维网面。采用图3所示收集装置得到的取向纳米纤维束，其稀疏程度主要取决于履带式平行导电面板的转速。当转速较慢，比如1 cm/min或者0.5 cm/min时，初生的取向纳米纤维束比较密集，以至于近似网面；而当转速较快，比如40 cm/min或者100 cm/min时，初生的取向纳米纤维束比较稀疏，单根纤维之间几乎没有粘连。因此，图3所示的收集装置还可以根据需要定制不同稀疏程度的取向纳米纤维束。当然，根据不同聚合物的性质，导电面板还必须有一个最小转速，以便提供带动两端黏附在导电面板上的聚合物取向纳米纤维束运动的最小剪切力。

纳米纤维支架的搭建步骤：

将上一步骤中沉积的纳米纤维束或纤维网面搭载到表面预处理过的圆环薄片载体上，形成纳米纤维支架。

本步骤可以采取静电纺丝线下作业，即在完成上一步骤后，从纤维收集装置上分离收纳已裁剪好的取向纳米纤维束，分批独立地搭载到所述圆环薄片上。进一步地，本步骤还可以采取与静电纺丝过程一体化的作业，即当取向纳米纤维束被介电式固定支撑架上的剪切或切割器具（如刀片、楔形物，碟形物等）裁剪后，其不需要从纤维收集装置上分离就可以自动搭载到所述圆环薄片或圆环薄片组上。如图4所示，圆环薄片组直接由一个可沿y轴正反方向运动的传送带加载在介电式固定支撑架上方，取向纳米纤维束经裁剪后直接通过重力下落至圆环薄片上进行搭载。每一组圆环薄片都可以有一定的搭载时间，搭载时间与所需的纳米纤维束稀疏程度也有关系，通过传送带的运动可以结束对每一个圆环薄片组上纳米纤维束的搭载。同一时间可加载在支撑架正上方的圆环薄片个数是由平行导电面板的间距W和宽度L，以及圆环尺寸共同决定的。所述圆环薄片或圆环薄片组在进行纳米纤维支架的搭建步骤之前可能经过表面预处理，以改善圆环薄片对聚合物纳米纤维的亲和性（或黏附性），可能的表面预处理包括等离子体处理、表面镀膜、表面喷涂等，本发明对此不另作详述。

纳米纤维支架的放置或固定步骤：

将上一步骤中搭建好的纳米纤维支架放置或固定到如上所述的标准平底细胞培养板的孔底，形成集成支架式的细胞培养板。所述的纳米纤维支架的放置或固定，通过支架本身的重力、培养板孔底卡槽或培养板孔底与支架间的粘结等方式来达到，本发明对此不另作详述。

本发明还提供上述取向聚合物纳米纤维细胞培养板的用途，其专门应用于具有取向形态特征的细胞或组织的培养，特别是用于神经、骨、肌肉、韧带等细胞和相关组织的培养和再生。通过本发明取向聚合物纳米纤维细胞培养板或相同技术衍生的产品（如培养皿等其他细胞培养制品），所获得的上述细胞和组织在生长形态上最接近于动物或人的原生组织。

实施例1：

取向聚合物纳米纤维6孔细胞培养板的制备：

普通聚苯乙烯材质的标准6孔平底细胞培养板，灭菌后作为取向聚合物纳米纤维支架固定的对象。首先将聚合物原料PLGA、PCL和胶原蛋白按7: 2.5: 0.5的质量比混合，以微量NGF（神经生长因子）为生物活性成分加入聚合物原料，混合比为100:1，加入1:1的二氯甲烷/三氯甲烷混合溶剂中使溶质质量分数约为10 wt%，充分溶解制得静电纺丝液。然后，将静电纺丝液吸入静电纺丝的注射器中，在注射器的针尖电压为30 kV和泵供量为0.030 ml/min～0.050 ml/min的条件下进行静电纺丝，得到的纤维直径在50 nm~300 nm之间。所得到的取向PLGA/PCL/胶原蛋白纳米纤维束经裁剪收纳到如图3所示的履带式平行导电面板收集装置的固定支撑架上，形成较为密集的取向纤维网，本过程中履带式平行导电面板的转速为20 cm/min。对适用于标准6孔平底细胞培养板的304不锈钢圆环薄片（内径2.4 cm，外径3.0 cm，外径略小于6孔培养板的孔径）先后进行灭菌和N2/O2/Ar气氛的等离子体处理，紧接着将取向PLGA/PCL/胶原蛋白纳米纤维束从纤维收集装置上分离下来，再通过纤维与圆环薄片之间的静电力及黏附力使其搭载到圆环薄片上。最后，将搭建好的取向PLGA/PCL/胶原蛋白纳米纤维支架粘结到已灭菌的6孔细胞培养板的孔底，形成固定。图5a和5b所示的是取向聚合物纳米纤维6孔细胞培养板及其单个孔底的示意图。

脊髓神经细胞的诱导取向再生培养：

使用上述步骤制得的包含有取向PLGA/PCL/胶原蛋白纳米纤维支架的6孔细胞培养板进行细胞培养。

培养步骤具体如下：

①   以生长一周的第三代脊髓神经细胞为例，将培养基转移至50 ml的离心管中，离心10 min，1000 rpm/min，弃去上清液，加入200 ul的培养液吹打使细胞悬浮分散，加2 ml的培养液吹打并计数，根据计数结果求出所需取液量，在加入细胞悬液之前，向25 cm2规格的培养瓶中加入适量的培养液以及各0.6 ml 的bFGF和EGF，最后加入细胞悬液，每隔2~3天根据细胞状态添加生长因子和培养液的混合液1 ml。

②   于第六天利用荧光显微镜观察细胞，并拍摄照片，如图6所示。

实施例2：

取向聚合物纳米纤维24孔细胞培养板的制备：

普通聚苯乙烯材质24孔的标准平底细胞培养板，灭菌后作为取向聚合物纳米纤维支架固定的对象。首先将聚合物原材料丝素蛋白溶解于过饱和的LiBr水溶液中，丝素蛋白浓度为10 wt%，然后依次经过稀释、离心、过滤、透析和浓缩步骤后，得到丝素蛋白浓度约为30 wt%的浓缩水溶液。在浓缩后的丝素蛋白溶液中加入少量氯化钙（浓度约为0.3 mol/L），然后再以微量的BMPs（即骨形态发生蛋白）和纳米羟基磷灰石为生物活性成分加入聚合物原料，二者与丝素蛋白的混合比分别为1:50和1:200，充分溶解和分散制得静电纺丝液待用。然后，将静电纺丝液吸入纺丝注射器中，纺丝时注射器的针尖电压为32kV，泵供量维持在0.010 ml/min～0.020 ml/min之间，得到的丝素蛋白纤维直径在80 nm～500 nm之间。所得到的取向丝素蛋白纳米纤维束的裁剪收纳过程同实施例1。本实施例中，纳米纤维支架的搭建采用与静电纺丝一体化作业的方式。如图4所示，圆环薄片组随y轴方向传送带一起加载在介电式固定支撑架上方，取向纳米纤维束被裁剪后直接落至圆环薄片上进行搭载，每一组圆环薄片的搭载时间为5 min。在此之前，需对适用于24孔的标准平底细胞培养板的HDPE圆环薄片（高密度聚乙烯制品，内径0.7cm，外径1.3 cm，外径略小于24孔培养板的孔径）进行预处理，包括灭菌和O2/Ar气氛的等离子体处理。最后，将搭建好的取向丝素蛋白纳米纤维支架粘结到已灭菌的24孔标准细胞培养板的孔底内，形成固定。

成骨细胞形成皮质骨的诱导取向再生培养：

使用上述步骤制得的包含有丝素蛋白纳米纤维支架的24孔细胞培养板进行细胞培养。

培养步骤如下：

①   对于已经长满细胞的25 cm2规格的培养瓶，吸去培养基，加0.25%的胰蛋白酶2 ml消化，轻轻晃动培养瓶使胰蛋白酶覆盖整个瓶底，置于37 ℃培养箱中消化1 min，镜下观察细胞的形态，发现细胞皱缩间隙加大，分离为单个细胞时，加入2 ml低糖的DMEM培养基终止消化，然后吹打悬浮细胞并将其转移至15 ml的离心管，离心3 min ，800 rpm/min，弃上清，加含有10%FBS的低糖DMEM培养基使沉淀的细胞悬浮，吹打均匀后，取10 ul细胞悬液与10 ul台盼蓝混匀后利用细胞计数板计数，根据计数结果取适量悬液加入新的培养基中进行传代。

②   待第二天观察已经贴壁的细胞的生长状况，并用荧光显微镜观察细胞，并拍摄照片，如图7所示。

因此，本发明所需的主要原材料均为常见的医用高分子材料，原料易得、成本较低、有较好的生物相容性、生物活性及生物可降解性，且无细胞毒性，对培养基无影响；本发明的静电纺聚合物纳米纤维支架在结构上比较接近动物细胞的ECM，仿生程度较高，具有较大的孔隙率和比表面积，有利于细胞黏附生长，保持细胞成活率；使用本发明的取向聚合物纳米纤维支架培养细胞，在支架上的取向排列纤维束的“接触诱导”下，细胞沿纤维束的主轴方向定向地分化、生长，最终得到所需的具有取向形态的组织；本发明包含的技术可以专门用于具有取向形态特征的细胞或组织的培养，如神经、骨、肌肉、韧带等细胞和相关组织，通过本发明技术制得的细胞培养板或其他的衍生产品（如细胞培养皿）可以批量再生上述细胞组织。

应当注意的是，上述实施例只为解释说明，而不应被看作是对本发明所包含内容范围的限制。碍于篇幅限制，这里仅仅详细描述了较典型的实施方法，本领域技术人员应当充分认识到，本发明可以针对未脱离其内容主旨的创新点及优点作相关修改，且所有这类修改都应包含在本发明所定义的和等同意义的内容范围之内。   

Claims (11)

1.一种取向聚合物纳米纤维细胞培养板，其特征在于：所述细胞培养板在结构上包括作为主体的标准平底细胞培养板，以及附着于所述培养板孔底的聚合物纳米纤维支架。

2.根据权利要求1所述的取向聚合物纳米纤维细胞培养板，其特征在于：所述聚合物纳米纤维支架包括取向排列的聚合物纳米纤维束和用于搭载该聚合物纳米纤维束的圆环薄片。

3.根据权利要求1所述的取向聚合物纳米纤维细胞培养板，其特征在于：所述圆环薄片的厚度不超过1 mm，其外径略小于所述细胞培养板单个孔的孔径。

4.根据权利要求2或3中所述的取向聚合物纳米纤维细胞培养板，其特征在于：所述圆环薄片由生物惰性材料制成。

5.根据权利要求4所述的取向聚合物纳米纤维细胞培养板，其特征在于：所述生物惰性材料为304不锈钢、聚四氟乙烯（PTFE）、聚乙烯（PE）及生物陶瓷中的一种。

6.根据权利要求1所述的取向聚合物纳米纤维细胞培养板，其特征在于：所述聚合物纳米纤维以聚合物为原材料，通过共混或接枝的方式加入生物活性成分制成。

7.根据权利要求6所述的取向聚合物纳米纤维细胞培养板，其特征在于：所述聚合物为聚乳酸-羟基乙酸（PLGA）、聚乳酸（PLA）、聚羟基乙酸（PGA）、聚-3-羟基丁酸、聚己内酯（PCL）、聚丁二酸丁二醇酯（PBS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、聚氨酯（PU）、聚胺（PA）、聚酰胺（PAN）、丝素蛋白、胶原蛋白、明胶、壳聚糖中的一种或几种，所述生物活性成分为羟基磷灰石、磷酸三钙、生物活性玻璃、多肽、或NGF、FGF、BMPs、TGF-β生长因子中的一种或几种。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的取向聚合物纳米纤维细胞培养板的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）静电纺丝液的配制

将所述聚合物和所述生物活性成分一起溶解在溶剂中形成聚合物溶液，或是加热制成聚合物熔融体，或是通过溶胶凝胶法制成聚合物溶胶-凝胶；

（2）静电纺丝和纳米纤维束的接收

先将步骤（1）中制得的所述聚合物溶液、聚合物熔体或聚合物溶胶-凝胶加入注射器中，在所述注射器的针尖电压为5 kV-50 kV和泵供量为0.001 ml/min-0.100 ml/min的条件下进行静电纺丝，将得到的纳米纤维沉积在静电纺丝装置上的收集区域内，形成取向排列的纳米纤维束或纤维网面，所述纳米纤维直径为15 nm-500 nm；

（3）纳米纤维支架的搭建

将步骤（2）中沉积的纳米纤维束或纤维网面搭载到表面预处理过的圆环薄片载体上，形成纳米纤维支架；

（4）纳米纤维支架的放置或固定

将步骤（3）中搭建好的纳米纤维支架放置或固定到的所述标准平底细胞培养板的孔底，形成集成支架式的细胞培养板。

9.根据权利要求8所述的取向聚合物纳米纤维细胞培养板的制备方法，其特征在于：步骤（1）中所述溶剂为下述的一种体系或多种体系的混合：水、水/氯化钠、水/氯化钙、水/溴化锂、乙醇、甲酸、乙酸、乙腈、甲酚、四氢呋喃、三氟乙醇、三氟乙酸、二氯甲烷、三氯甲烷、N, N-二甲基甲酰胺或六氟异丙醇。

10.根据权利要求8所述的取向聚合物纳米纤维细胞培养板的制备方法，其特征在于：步骤（2）中所述的静电纺丝的收集区域是由两块平行的履带式的导电面板之间形成的空气间隙。

11.根据权利要求1-7中任意一项所述的取向聚合物纳米纤维细胞培养板适用于具有取向形态特征的细胞或组织的培养和再生。