KR100753116B1

KR100753116B1 - 세포 배양용 나노섬유 지지체

Info

Publication number: KR100753116B1
Application number: KR1020050126652A
Authority: KR
Inventors: 배한익; 김영진; 문준용; 강인규
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2005-12-21
Publication date: 2007-08-29
Also published as: US20080009062A1; WO2006068421A1; KR20060071890A; US8071382B2

Abstract

본 발명은 폴리하이드록시알카노에이트; 또는 폴리하이드록시알카노에이트와 콜라겐, 젤라틴 또는 이들의 혼합물로 이루어진 선형 나노섬유가 교차되어 망상구조를 이루는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체에 관한 것이다. 본 발명의 세포 배양용 지지체는 구조적 특성과 첨가된 콜라겐 또는 젤라틴의 영향 때문에 세포를 부착시켜 배양하기에 용이하며, 연결된 구멍을 통하여 영양분, 산소 등이 공급되기에 용이하다. 특히, 암세포 배양에 있어 더욱 유용하다.

세포 배양, 지지체, 나노섬유, 폴리하이드록시알카노에이트, 콜라겐, 젤라틴

Description

세포 배양용 나노섬유 지지체{Nanofiber mesh for cell culture}

도 1은 본 발명 세포 배양용 나노섬유 지지체의 제조장치를 개략적으로 나타낸 도이다.

도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 폴리하이드록시알카노에이트와 콜라겐으로 제조된 세포 배양용 나노섬유 지지체를 촬영한 SEM 사진이다.

도 2b는 도 2a의 일부분을 확대하여 촬영한 SEM 사진이다. 미세한 선형 또는 판형의 콜라겐이 폴리하이드록시알카노에이트로 이루어진 나노섬유 사이사이에 존재하는 것이 관찰된다.

도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 폴리하이드록시알카노에이트와 젤라틴으로 제조된 세포 배양용 나노섬유 지지체를 1,000배로 촬영한 SEM 사진이다.

도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따라 폴리하이드록시알카노에이트와 젤라틴으로 제조된 세포 배양용 나노섬유 지지체를 5,000배로 촬영한 SEM 사진이다.

도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따른 세포 배양용 나노섬유 지지체에 난소암 환자의 조직으로부터 얻은 세포를 직접 초대 배양(primary culture)한 난소암 세포를 촬영한 SEM 사진이다.

도 3b는 도 3a의 일부분을 확대하여 촬영한 SEM 사진이다.

도 3c는 폴리하이드록시알카노에이트만을 이용하여 나노섬유를 제작한 나노 섬유 지지체에 HCT116 대장암 세포를 1일 동안 배양한 결과를 주사전자현미경을 이용하여 1,000배로 측정한 암세포 사진이다.

도 3d는 폴리하이드록시알카노에이트만을 이용하여 나노섬유를 제작한 나노섬유 지지체에 HCT116 대장암 세포를 1일 동안 배양한 결과를 주사전자현미경을 이용하여 5,000배로 측정한 암세포 사진이다.

도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따라 폴리하이드록시알카노에이트와 콜라겐으로 제조된 세포 배양용 나노섬유 지지체 정상 연골세포를 배양한 결과를 주사전자현미경 사진으로 측정한 결과이다.

도 3f는 본 발명의 일 실시예에 따라 폴리하이드록시알카노에이트로 이루어진 세포 배양용 나노섬유 지지체에 흰쥐의 정상 섬유아세포를 배양한 결과를 주사전자현미경 사진으로 측정한 결과이다.

도 4a는 콜라겐이 도포된 페트리 접시 위에 초대 배양한 난소암 세포를 촬영한 SEM 사진이다.

도 4b는 도 4a의 일부분을 확대하여 촬영한 SEM 사진이다.

도 5는 본 발명의 세포 배양용 나노섬유 지지체에 HCT116 대장암 세포를 배양한 결과를 촬영한 SEM 사진이다.

도 6은 콜라겐이 도포된 페트리 접시 위에 HCT116 대장암 세포를 배양한 결과를 촬영한 SEM 사진이다.

도 7은 본 발명의 세포 배양용 나노섬유 지지체가 부착된 원형 폴리에틸렌 필름 및 이들이 다수 밀집된 세포 배양용 플레이트를 나타낸 사진이다.

본 발명은 세포 배양용 나노섬유 지지체 및 이러한 지지체를 포함하는 세포 배양용 플레이트에 관한 것이다.

최근 분자생물학, 조직공학, 유전공학 등의 급속한 발달로 인하여 세포 단위의 연구가 활발해짐에 따라 세포를 배양할 필요성이 크게 대두되어 있다. 예를 들어, 조직공학의 경우 세포를 체외에서 배양하여, 인체의 근육조직, 장기 등과 같은 손상된 생체조직의 재생, 인공장기의 개발 등에 이용하고 있으며, 의약분야의 경우 세포배양기술을 배양된 세포에서 생산하는 단백질을 이용한 생리활성 물질, 의약품 등의 개발에 이용하고 있다. 이러한 연구에는 세포의 수를 늘리기 위한 세포배양이 필수적이며, 특히 배양된 세포에서 항체, 항원, 생리활성물질 등을 얻는 분야에 있어서는 세포배양 효율성이 점점 중요해지고 있다.

이러한 세포배양기술은 또한 암 환자 치료과정에서 이용될 수 있다. 악성종양 환자에서 암을 효과적으로 치료하는데 있어 중요한 것은 환자에게 부작용이 적고 종양세포의 발육을 억제하는 능력이 우수한 화학요법제를 선택하는 것이다. 병리조직학적으로 같은 범주의 종양이라도 환자에 따라 항암제에 대한 반응정도가 다르고 정상세포 중에서도 분열증식속도가 빠른 골수조혈세포, 모근세포 등이 손상을 입게 되므로 이런 부작용을 가능한 줄이고 효과적으로 종양세포 발육을 억제할 수 있는 항암제의 선택이 매우 중요하다. 따라서 암환자 개개인의 암세포에 대한 항암 제 감수성 검사의 필요성이 대두하여 암세포 배양에 대한 많은 연구가 이루어져 오고 있으며, 또한 항암제 신약 개발을 위한 효율적 연구 수행을 위하여 질병(암세포)의 기전을 연구하고, 새로운 항암제에 대한 효력평가를 위하여 충분한 암세포가 필요한 실정이다. 이러한 목적들에서 암세포 배양, 배양 매질, 배양 지지체 등에 대한 많은 연구가 있어 왔다.

1970년대에 Hamburger 및 Salmon에 의해 이중 반고형 아가(double semisolid agar) 배양법을 이용한 다발성 골수종 세포의 생체 외 배양의 성공으로 항암제 감수성 검사가 실시되기 시작하였으나, 이러한 방법은 낮은 세포집락 형성율(plating efficiency)과 낮은 암세포 성장률 등의 문제점이 있다.

일반적으로 배양 페트리 접시 표면에만 세포를 부착시켜 배양하면 일정 증식 후에 세포는 더 이상 증식되지 않으며, 세포 성장률 또한 매우 낮다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 3차원적 세포배양 지지체가 요구되며, 더욱 바람직하게는 지지체 위에 세포 부착이 용이하도록 비표면적이 큰 3차원적 세포배양 지지체가 요구된다.

기존의 3차원적 세포배양 지지체는 비표면적이 그다지 높지 않을 뿐만 아니라 세포 등의 세포부착성이 그다지 높지 않다는 문제점이 있다. 특히 콜라겐을 주원료로 이용하여 제조된 스폰지 형태의 세포 배양 지지체는 배양액 속에서 불어나는 등의 지지체 변형이 있으며, 세포를 분리해 내려면 아교질분해효소(collagenase)를 사용하여 배양된 세포 사이의 콜라겐을 제거해야 하는 문제점이 있다. 또한 기존에 3차원적 세포배양을 위해 통상적으로 사용되어온 지지체는 비록 다공성이나 구멍이 매끄럽게 연결되어 있지 못하여 영양분 등이 원활하게 공급되기 어렵고, 특히 이러한 문제점으로 인하여 일반 세포에 비하여 증식속도가 매우 빠른 암세포를 배양하는 것은 용이하지 않고 암세포 성장률 또한 낮다는 문제점이 있다.

따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 세포 접촉이 용이하며 구멍이 구조적으로 잘 연결되어 지지체 사이사이의 세포로 영양분, 산소 등이 원활하게 공급될 수 있는 세포 배양용 지지체를 제공하는데 있다.

전술한 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 3차원 세포배양이 가능한 다공성 지지체로서, 폴리하이드록시알카노에이트로 이루어진 선형 나노섬유가 교차되어 망상구조를 이루는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체를 제공한다.

바람직하게, 본 발명은 전술한 선형 나노섬유가 폴리하이드록시알카노에이트 이외에 콜라겐, 젤라틴 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체를 제공한다.

보다 바람직하게, 본 발명은 전술한 선형 나노섬유가 폴리하이드록시알카노에이트(A)와 콜라겐(B)의 중량비(B/A) 2-10 중량%인 혼합물로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체를 제공한다.

보다 바람직하게, 본 발명은 전술한 선형 나노섬유가 폴리하이드록시알카노에이트(A)와 젤라틴(B)의 중량비(B/A) 10-100 중량%인 혼합물로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체를 제공한다.

보다 바람직하게, 본 발명은 전술한 선형 나노섬유의 직경이 50-2,000 ㎚인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체를 제공한다.

보다 바람직하게, 본 발명은 전술한 세포 배양용 지지체를 구성하는 폴리하이드록시알카노에이트가 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-3-하이드록시발레레이트) (poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate))인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체를 제공한다.

보다 바람직하게, 본 발명은 전술한 세포 배양용 지지체가 암세포 배양용인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체를 제공한다.

본 발명은 또한 전술한 세포 배양용 지지체가 부착된 세포 배양용 폴리에틸렌 필름을 제공하며, 보다 바람직하게, 본 발명은 전술한 세포 배양용 폴리에틸렌 필름이 세포를 배양하기에 적당한 크기의 원형으로 절단되어 다수 포함된 세포 배양용 플레이트를 제공한다.

본 발명은 또한 3차원 세포배양이 가능한 다공성 지지체를 제조함에 있어서, (S1) 폴리하이드록시알카노에이트 용액을 준비하는 단계; (S2) 상기 용액을 (+)로 대전하는 단계; 및 (S3) 상기 양으로 대전된 용액을 미세구멍을 통하여 (-)로 대전된 물질 위로 분사(spray)하는 단계;를 포함하는 세포 배양용 지지체의 제조방법을 제공한다.

바람직하게, 본 발명은 상기 제조방법에 있어 (S1) 단계의 용액이 콜라겐, 젤라틴 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명의 세포 배양용 지지체 및 이의 제조방법에 대하여 좀 더 자세히 설명한다.

본 발명은 3차원 세포배양이 가능한 다공성 지지체로서, 폴리하이드록시알카노에이트, 보다 바람직하게는, 폴리하이드록시알카노에이트;와 콜라겐, 젤라틴 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나;의 혼합물로 이루어진 선형 나노섬유가 교차되어 망상구조를 이루는 것을 특징으로 하는 비표면적(specific surface area)이 높은 세포 배양용 지지체를 제공한다.

본 발명의 세포 배양용 지지체는 아스펙트 비율(직경에 대한 길이의 비율)이 높은 구조적 특성으로 인하여 비표면적이 높아, 즉 지지체 내에서 세포가 접촉할 수 있는 면적이 넓어 세포 배양에 용이할 뿐만 아니라, 본 발명의 지지체는 선형의 나노섬유가 교차되어 있어 지지체 내의 구멍이 매끄럽게 연결되어 있고, 이를 통해 세포 배양에 필요한 영양분, 산소 등이 상하좌우로 공급되기에 용이한 구조를 가진다.

3차원적으로 세포배양을 실시하는데 있어 적절한 영양분 등이 원활하게 공급되는 것이 중요하며, 특히 암세포의 경우 일반적인 세포와 달리 증식속도가 매우 빠르기 때문에 이러한 빠른 증식에 필요한 적절한 영양분, 산소 등을 원활하게 공급하는 것은 매우 중요하고, 이러한 측면에서 본 발명의 선형 나노섬유가 교차된 망상구조로 이루어진 지지체는 영양분 등이 이동하기에 용이하도록 구멍이 연결되어 있어 세포 배양, 특히 암세포 배양에 더욱 유용하다.

본 발명의 세포 배양용 지지체에 있어, 교차되어 망상구조를 이루는 선형 나 노섬유의 직경은 제조되는 지지체의 비표면적, 세포와의 접촉용이성, 생성되는 구멍의 크기 등을 종합적으로 고려하면 직경이 50 내지 2,000 ㎚인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 세포 배양용 지지체를 이루는 선형 나노섬유는 많은 부분이 폴리하이드록시알카노에이트(polyhydroxyalkanoate)로 되어 있다. 폴리하이드록시알카노에이트는 미생물에 의하여 생산되는 친수성 물질로 미생물 내 축적되는 탄소(에너지) 저장물질이다. 이러한 폴리하이드록시알카노에이트는 일반적으로 생분해성이고 독성이 없는 것으로 알려져 있다. 따라서, 기존의 콜라겐으로만 이루어진 세포 배양용 지지체와는 달리 생분해성이므로 지지체의 이러한 분해성을 이용하면 세포 배양 후 세포만을 분리할 필요가 있는 경우에 순수하게 분리하는 것이 더욱 용이하다.

본 발명의 세포 배양용 지지체를 제조하는데 사용되는 폴리하이드록시알카노에이트로는 폴리(3-하이드록시프로피오네이트), 폴리(3-하이드록시부티레이트), 폴리(3-하이드록시발레레이트(valerate)), 폴리(3-하이드록시헥사노에이트), 폴리(3-하이드록시옥타노에이트), 폴리(4-하이드록시부티레이트), 폴리(5-하이드록시발레레이트) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 제조용이성, 세포 배양효율성 등을 종합적으로 고려하면 폴리(3-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시발레레이트)(poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate), 이하, 'PHBV')가 더욱 바람직하다.

본 발명의 세포 배양용 지지체는 폴리하이드록시알카노에이트로만 이루어지 거나, 콜라겐, 젤라틴 또는 이들의 혼합물을 추가로 함유한다. 본 발명의 세포 배양용 지지체는 콜라겐, 젤라틴 또는 이들의 혼합물을 더 포함함으로써 친수성을 증가시키고 이를 통해 세포의 부착성과 조직적합성을 더욱 향상시킨다. 바람직하게는, 콜라겐이 지지체에 추가로 포함되는 경우 세포 배양용 지지체를 구성하는 성분들인 폴리하이드록시알카노에이트(A)와 콜라겐(B)의 중량비(B/A)가 2 내지 10 중량%인 것이 바람직하다. 2 중량% 미만의 콜라겐이 포함된 폴리하이드록시알카노에이트를 사용하여 제조된 지지체는 세포 접착력이 다소 떨어지고, 10 중량% 초과의 콜라겐이 포함된 폴리하이드록시알카노에이트를 사용하는 경우는 제조비용이 높아지고, 접착력이 지나치게 높아져서 세포를 배양한 후 다시 회수하는 것이 어렵다.

바람직하게는, 젤라틴이 지지체에 추가로 포함되는 경우 세포 배양용 지지체를 구성하는 성분들인 폴리하이드록시알카노에이트(A)와 젤라틴(B)의 중량비(B/A)가 10 내지 100 중량%인 것이 전술한 콜라겐의 경우와 마찬가지 이유로 바람직하다.

본 발명은 또한 3차원 세포배양이 가능한 다공성 지지체를 제조함에 있어서, (S1) 폴리하이드록시알카노에이트 용액을 준비하는 단계 또는 (S1) 폴리하이드록시알카노에이트와 콜라겐 또는 젤라틴의 혼합용액을 준비하는 단계; (S2) 상기 용액 또는 혼합용액을 (+)로 대전하는 단계; 및 (S3) 상기 양으로 대전된 용액 또는 혼합용액을 미세구멍을 통하여 (-)로 대전된 물질 위로 분사하는 단계;를 포함하는 세포 배양용 지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 세포 배양용 지지체 제조방법의 바람직한 일 실시예를 도 1에 나 타내었다. 도 1에 나타나는 바와 같이 본 발명의 세포 배양용 지지체를 제조하는 장치의 구성은 고압전원장치부; 전술한 폴리하이드록시알카노에이트 함유 용액 또는 혼합용액을 미세구멍을 통하여 분사할 수 있는 주사기; 주사기 내의 고분자 혼합용액을 분사(spray)할 수 있는 주사기 펌프; 및 분사되며 선형으로 만들어지는 나노섬유를 3차원적인 지지체의 형태로 수집하는 일단이 접지된 회전물질로 구성된다. 회전물질로는 메탈 드럼 등이 사용될 수 있다. 고압전원장치에서 고압 전기장이 주사기 펌프와 수집하는 회전물질에 걸어지는데, 주사기 펌프의 주사기에는 (+)의 전압이 인가되고, 메탈 드럼에는 (-)전압이 인가된다. 양으로 대전된 고분자 혼합용액은 주사기 펌프의 주사기의 미세구멍으로부터 메탈드럼까지에 걸린 고압전기장에 의해서 연신되는 바, 주사기의 방사구로부터 접지된 메탈드럼으로 연신되는 용액에 제트 흐름이 생성된다. 많은 나노섬유들이 분사영역에서 나누어지고, 회전하는 메탈 드럼상에서 나노섬유가 교차되면서 망상구조를 이루는 세포 배양용 지지체가 형성된다.

본 발명의 세포 배양용 지지체 제조방법은 매우 간단하고 용이하며, 그 기공의 크기를 조절하기에 용이하다. 또한 대량생산이 용이하고, 용액 또는 용융액 형태의 유기 고분자뿐만 아니라 세포배양에 유용한 무기물을 첨가시켜 제조하는 것도 용이하다.

본 발명은 또한 상기 세포 배양용 지지체의 실제 이용이 용이하도록 이러한 지지체가 부착된 폴리에틸렌 필름을 제공하며, 보다 바람직하게, 세포 배양용 지지체가 부착된 판상의 폴리에틸렌 필름을 프레스 등을 이용하여 세포 배양에 적당한 크기 및 모양으로 절단한 후, 이러한 절단된 폴리에틸렌 필름이 다량으로 밀집된 세포 배양용 플레이트를 제공한다(도 7 참조).

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명에 따른 실시예들은 여러 가지 다른 형태로 변형될 수 있으며, 본 발명의 범위가 아래에서 상술하는 실시예들에 한정되는 것으로 해석되어져서는 안 된다. 본 발명의 실시예들은 당 업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해서 제공되어지는 것이다.

<본 발명에 따른 세포 배양용 지지체 및 이를 포함하는 플레이트의 제조>

실시예 1-1: PHBV만으로 이루어진 세포 배양용 지지체의 제조

폴리(3-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시발레레이트)를 동일 질량의 헥사플루오로-2-프로판올(hexafluoro-2-propanol) 용매에 녹여 고분자 용액을 제조하였다. 그 후, 도 1에 나타난 나노섬유 제조장치를 사용하여 세포 배양용 지지체를 제조하였다. 제조 시 주사기 구멍과 메탈 드럼의 거리를 약 12㎝가 되게 하고, 10KV의 전압을 걸어 주었으며, 습도 20% 이하, 온도 40℃ 이상이 되도록 조건을 유지하였다. 제조 후 24시간 동안 진공 건조하였다.

실시예 1-2: PHBV와 콜라겐으로 이루어진 세포 배양용 지지체의 제조

폴리(3-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시발레레이트)에 PHBV 대비 6중량%가 되도록 콜라겐을 혼합한 후에 동일 질량의 헥사플루오로-2-프로판올(hexafluoro-2-propanol) 용매에 녹여 고분자 혼합용액을 제조하였다. 그 후, 실시 예 1-1과 동일한 방법으로 세포 배양용 지지체를 제조하였다. 제조된 지지체를 측정한 SEM 사진을 도 2a 및 도 2b에 나타내었다.

실시예 1-3: PHBV와 젤라틴으로 이루어진 세포 배양용 지지체의 제조

폴리(3-하이드록시부티레이트-co-3-하이드록시발레레이트)와 젤라틴을 중량비 70:30으로 혼합한 후에 동일 질량의 헥사플루오로-2-프로판올(hexafluoro-2-propanol) 용매에 녹여 고분자 혼합용액을 제조하였다. 그 후, 실시예 1-1과 동일한 방법으로 세포 배양용 지지체를 제조하였다. 제조된 지지체를 측정한 SEM 사진을 도 2c 및 도 2d에 나타내었다.

실시예 1-4: 암세포 배양용 플레이트의 제조

실시예 1-1 내지 1-3에서 제조한 지지체를 고농도에서 저농도의 순서로 에탄올(75%, 50%, 25%)로 멸균하고, PBS로 세척을 하여 건조시켰다. 그 후, A4 종이(210×297mm) 절반 크기인 폴리에틸렌 필름의 한쪽 면에 세척 및 건조된 세포 배양용 지지체를 부착한 후 그 직경이 11mm인 원형이 되도록 미리 제작한 프레스로 절단하였다. 그 후, 도 7에 나타난 바와 같이, 미리 제작한 원형의 홈을 다수 가진 플레이트에 절단된 폴리에틸렌 필름을 넣었다.

<세포 배양 평가 실험>

실시예 2-1: 초대 배양(primary culture)한 난소암 세포를 이용한 세포배양 실험

초대 배양한 난소암 세포를 적정량의 세포(3×10⁴-5×10⁴)로 개수하여 맞춘 세포액을 제조한 후에, 실시예 1-2의 플레이트에 700㎕씩 준비한 초대 배양한 난소암 세포액을 로딩(loading)하여 3시간 동안 37℃, 5% CO₂에서 배양하였다. 웰의 배양액을 제거한 뒤, 인산완충생리식염수로 가볍게 세척하여 2.5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 30분간 고정하였다. 삼차증류수로 세포를 가볍게 씻어준 다음, 클린 벤치(clean bench)에서 저농도에서 고농도의 순서로 에탄올(25%, 50%, 75%, 100%)로 완전히 건조시키면서 탈수과정을 거쳤다. 100% 에탄올 과정 후에 16시간 동안 건조시켰다. 그 후 건조된 지지체를 약 0.5cm의 크기로 자른 후 SEM(Scaning Electron Microscope) 사진을 찍었다. Hitachi S4,300 주사전자현미경(Hitachi사, 일본)을 이용 가속전압 20KV로 관찰하고 필요한 부위를 선정하여 주사전자현미경 사진 이미지를 얻었다. 그 결과를 도 3a 및 3b에 나타내었다.

도 3a 및 3b는 초대 배양한 난소암 세포를 본 발명의 지지체에 1차 확산시킨 뒤 3시간 후 관찰한 주사전자현미경 사진으로 고정, 탈수, 수세 등의 주사전자현미경 처리 과정에도 발을 내며 잘 붙어 있는 것을 볼 수가 있다.

실시예 2-2: HCT116 대장암 세포를 이용한 세포배양 실험

난소암 세포 대신 HCT116 대장암 세포(KCLB No. 10247, Korean Cell Line Bank)를 이용하고, 실시예 1-2의 지지체 대신 실시예 1-1의 지지체를 이용하였으며, 1일 동안 배양한 것을 제외하고는 실시예 2-1과 동일한 방법으로 세포배양 실험을 실시하였으며, 그 결과를 도 3c와 3d에 나타내었다.

도 3c 및 3d는 초대 배양한 대장암 세포를 본 발명의 지지체에 1차 확산시킨 뒤 3시간 후 관찰한 주사전자현미경 사진으로 고정, 탈수, 수세 등의 주사전자현미경 처리 과정에도 발을 내며 잘 붙어 있는 것을 볼 수가 있다. 도 3c와 도 3d는 PHBV만을 이용하여 제조한 지지체에 HCT116 대장암 세포주를 1일 동안 배양하였고, 주사전자현미경을 이용하여 1,000배와 5,000배로 촬영한 암세포 사진이다. PHBV만을 이용하여 제작하였을 경우는 도 3c에서 보는 바와 같이 세포 주변의 이물질이 관찰되지 않았고, 세포들은 집락을 형성하고 중첩되어 잘 생착되어 있다. 도 3d에서 보는 바와 같이 세포의 변형없이 세포질 돌기도 잘 유지되어서 나노섬유 지지체에 강하게 붙어 있다.

실시예 2-3: 쥐의 정상 연골세포(chondrocyte) 및 정상 섬유아세포(fibroblast)를 이용한 세포배양 실험

흰 쥐(Splague-Dawley rat)를 도살한 즉시, 슬관절 연골세포를 분리하였고, 실시예 1-1에서 제조한 PHBV만의 이루어진 지지체를 사용하여, 실시예 2-2와 유사한 방법으로 정상 연골세포 배양실험을 하였다. 그 결과를 도 3e에 나타내었다.

또한 흰 쥐(Splague-Dawley rat)를 마취하여 복벽의 피부를 절개하여 피하의 교원섬유를 생산하는 섬유아세포를 분리하였고, 실시예 1-2에서 제조한 PHBV와 콜라겐으로 이루어진 지지체를 사용하여, 실시예 2-2와 유사한 방법으로 정상 섬유아세포 배양실험하였고, 그 결과를 도 3f에 나타내었다.

도 3e는 본 발명의 지지체에 연골세포를 1차 확산시킨 다음, 2시간 뒤 관찰한 주사전자현미경 사진으로 연골 세포가 발명의 지지체 내의 나노섬유에 강하게 붙어 있는 모습을 관찰할 수 있다.

도 3f는 본 발명의 지지체에 초대 배양한 흰쥐의 섬유아세포를 1차 확산시킨 다음, 2시간 뒤 관찰한 주사전자현미경 사진으로 섬유아 세포가 세포질 돌기를 잘 형성하면서 본 발명의 지지체 내의 나노섬유에 잘 붙어 있는 모습을 관찰할 수 있다.

실시예 2-4: HCT116 대장암 세포를 이용한 세포배양 실험

HCT116 대장암 세포(KCLB No. 10247, Korean Cell Line Bank)를 이용하고, 실시예 1-2에서 제조한 지지체를 사용하여, 실시예 2-2와 동일한 방법으로 실험하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5는 초대 배양한 대장암 세포를 본 발명의 지지체에 1차 확산시킨 뒤 3시간 뒤 관찰한 주사전자현미경 사진으로 HCT116 대장암 세포가 본 발명의 지지체 내의 나노섬유에 강하게 붙어 있다.

비교예 1-1: 초대 배양한 난소암 세포를 이용한 세포배양 실험

본 발명의 암세포 배양용 지지체 대신에 콜라겐이 도포된 페트리 접시를 사용하여 전술한 실시예 2-1과 동일한 공정으로 실험하였다. 그 결과를 도 4a 및 4b에 나타내었다.

도 4a 및 4b는 초대 배양한 난소암 세포를 콜라겐이 도포된 페트리 접시 위에 1차 확산시킨 후 3시간 뒤 관찰한 주사전자현미경 사진으로 네 개의 세포가 붙어서 성장하는 것을 관찰할 수 있다. 고정, 탈수, 수세 등의 주사전자현미경 처리 과정에서 탈락이 되어 세포의 수가 본 발명의 지지체에 배양한 세포의 수보다 적다.

비교예 1-2: HCT116 대장암 세포를 이용한 세포배양 실험

난소암 세포 대신에 HCT116 대장암 세포를 이용하여 실시예 2-4와 동일한 방법으로 실험하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타나는 바와 같이, 도 5와는 달리 콜라겐이 도포된 페트리 접시 위에서 배양한 HCT 대장암 세포의 생착은 약해 보인다.

이와 같이, 본 발명에 따른 폴리하이드록시알카노에이트; 또는 폴리하이드록시알카노에이트와 콜라겐, 젤라틴 또는 이들의 혼합물로 이루어진 선형 나노섬유가 교차되어 망상구조를 이루는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체는 구조적 특성과 첨가된 콜라겐 또는 젤라틴의 영향으로 인하여 세포, 더욱 바람직하게는 암세포가 접착하여 배양하기에 용이하며, 연결된 구멍을 통하여 영양분, 산소 등이 공급되기에 용이하다.

Claims

3차원 세포배양이 가능한 다공성 지지체로서, 폴리하이드록시알카노에이트로 이루어진 직경 50-2,000 nm의 선형 나노섬유가 교차되어 망상구조를 이루는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체.
제1항에 있어서, 상기 선형 나노섬유는 콜라겐, 젤라틴 또는 이들의 혼합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체.
제2항에 있어서, 상기 선형 나노섬유는 폴리하이드록시알카노에이트(A)와 콜라겐(B)의 중량비(B/A)가 0.02-0.1인 혼합물로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체.
제2항에 있어서, 상기 선형 나노섬유는 폴리하이드록시알카노에이트(A)와 젤라틴(B)의 중량비(B/A)가 0.1-1인 혼합물로 이루어진 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체.
삭제
제1항에 있어서, 상기 폴리하이드록시알카노에이트는 폴리(3-하이드록시부티레이트-코-3-하이드록시발레레이트) (poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate))인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체.
제1항, 제2항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 지지체.
제1항, 제2항, 제3항, 제4항 및 제6항 중 어느 한 항의 세포 배양용 지지체가 부착된 세포 배양용 폴리에틸렌 필름.
제8항의 세포 배양용 폴리에틸렌 필름이 원형으로 절단되어 다수 포함된 세포 배양용 플레이트.
제9항에 있어서, 상기 세포는 암세포인 것을 특징으로 하는 세포 배양용 플레이트.