KR102068465B1 - 세포 배양 구조체, 이의 제조방법 및 세포 배양 구조체를 포함하는 세포 배양 장치 - Google Patents

세포 배양 구조체, 이의 제조방법 및 세포 배양 구조체를 포함하는 세포 배양 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 배양 구조체, 이의 제조방법 및 세포 배양 구조체를 포함하는 세포 배양 장치에 관한 것이다.
특히, 본 발명에 따른 세포 배양 구조체는 다공성 멤브레인의 다공성을 유지하되 세포 배양시 상기 세포가 누출되는 것을 방지할 수 있는 효과가 있다. 아울러, 상기 세포 배양 구조체는 세포 배양시 390 내지 700 nm 의 가시광선 파장영역에서 70% 이상의 평균 광투과도를 갖는 효과가 있다.

Description

세포 배양 구조체, 이의 제조방법 및 세포 배양 구조체를 포함하는 세포 배양 장치{Cell culture structure, manufacturing method thereof and Cell culture device including the cell culture structure}
본 발명은 세포 배양 구조체, 이의 제조방법 및 세포 배양 구조체를 포함하는 세포 배양 장치에 관한 것이다.
세포와 조직을 배양하는 기술은 기초 또는 응용 생명 과학 연구를 위해서 점점 더 중요해지고 있다. 세포 배양이라 함은 일반적으로 다세포 생물의 개체로부터 조직 편을 분리하고, 조직 편을 용기 내에서 배양 및 증식시키는 것을 의미한다.
특정한 세포는 다른 종류의 세포와의 직접적인 상호작용이 세포의 성장, 이동 및 분화에 매우 큰 영향을 미친다. 예를 들어, 암세포의 경우 다른 조직 세포와 함께 있어야 세포의 성장 속도가 빨라진다.
한편, 세포 배양 인서트(cell culture insert)는 삽입구를 구비한 플레이트에 삽입되는 세포 배양 구조체로, 다양한 세포의 성장 및 분화를 촉진시킬 수 있어, 합성 및 천연 혼합물의 이동, 확산, 섭취(uptake), 변태(metabolization) 및 분비를 조사하는데 주로 사용된다.
미국 등록특허 제5,578,492호에 세포 배양 구조체(10)에 대해서 개시되어 있으며, 특히, 상기 세포 배양 구조체(10)의 몸체(1) 하단에 다공성 멤브레인(2, porous membrane)을 포함하는 구성이 개시되어 있다. 이러한 다공성 멤브레인(2)은 플라스틱 등으로 구성된 층에 특정 물질의 이동 통로인 홀(hole)을 형성함으로써 제작된다(도 1 참조).
그러나, 상기 세포 배양 구조체(10)에 형성된 다공성 멤브레인(2)은 생체 내 기저막과 전혀 다른 구조를 가진다. 구체적으로, 상기 다공성 멤브레인(2)은 2차원 평면으로 이루어진 반면, 생체 내의 구조는 3차원 형상으로 구조상의 창가 있다.
따라서, 출원인은 세포 배양에 있어서 생체 내와 유사한 환경을 제공해 주기 위하여, 나노섬유 멤브레인이 포함된 세포 배양 구조체를 개발하였다(도 2 참조).
하지만, 나노섬유 멤브레인이 형성된 세포 배양 구조체를 이용하여 세포를 배양하는 경우, 나노섬유 멤브레인 위 아래로 세포를 관찰하기 위하여 70% 이상의 빛 투과도가 확보되어야 하는데, 복잡한 나노구조로 인하여 투과도가 낮은 문제가 있다.
아울러, 투과도를 높이기 위하여 나노섬유 멤브레인의 두께를 줄이는 경우, 상기 세포 배양 구조체에서 배양되는 세포가 누출되는 문제가 발생하게 된다.
따라서, 세포 배양에 적절한 빛 투과도를 갖되, 세포 누출을 방지할 수 있는 멤브레인을 갖는 세포 배양 구조체가 필요한 실정이다.
미국 등록특허 제5,578,492호
이러한 상기 문제를 해결하기 위하여,
본 발명의 목적은 70% 이상의 빛 투과도가 확보되되, 세포 배양시 상기 세포가 누출되는 문제를 방지할 수 있는 세포 배양 구조체를 제공하고자 한다.
본 발명의 다른 목적은 상술한 세포 배양 구조체를 용이하게 제조할 수 있는 세포 배양 구조체의 제조방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 상술한 세포 배양 구조체를 포함하는 세포 배양 장치를 제공하고자 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 하나의 실시예에서,
일단과 타단이 관통하도록 형성된 몸체; 및
몸체의 일단에 형성되되, 나노섬유로 형성된 다공성 부재와 나노섬유 표면에 형성된 콜라겐을 포함하는 다공성 멤브레인; 을 포함하며,
상기 다공성 멤브레인은 390 내지 700 nm 의 가시광선 파장영역에서 70% 이상의 평균 광투과도를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 배양 구조체를 제공한다.
또한, 본 발명은 다른 하나의 실시예에서,
일단과 타단이 관통하도록 형성된 몸체와 몸체의 일단에 형성되되, 나노섬유로 형성된 다공성 부재에 콜라겐을 도포하는 단계;
콜라겐이 도포된 다공성 부재를 플라즈마 처리하는 단계; 를 포함하는 세포 배양 구조체의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 하나의 실시예에서,
하나 이상의 수용부를 갖는 배양 플레이트; 및
각 수용부에 삽입되는 세포 배양 구조체; 를 포함하는 세포 배양 장치를 제공한다.
본 발명의 실시예에 따른 세포 배양 구조체의 다공성 멤브레인은 다공성 부재에 콜라겐을 포함하고 있어, 다공성을 유지하되, 세포 배양시 세포가 누출되는 것을 방지할 수 있다.
아울러, 상기 세포 배양 구조체는 세포 배양시 390 내지 700 nm 의 가시광선 파장영역에서 70% 이상의 평균 광투과도를 갖는 효과가 있다.
도 1은 종래의 세포 배양 구조체를 나타내는 도면이다.
도 2는 종래의 고분자 나노섬유 멤브레인이 포함된 세포 배양 구조체를 나타내는 도면이다((a) 세포 배양 구조체, (b) 고분자 나노섬유 멤브레인의 확대도).
도 3은 본 발명에 따른 세포 배양 구조체를 나타내는 도면이다.
도 4는 본 발명에 따른 세포 배양 구조체의 다공성 멤브레인을 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 5는 본 발명에 따른 세포 배양 구조체의 제조방법을 설명하기 위한 흐름도이다.
도 6은 본 발명에 따른 세포 배양 장치를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 세포 배양 구조체의 다공성 부재에 콜라겐을 코팅하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 8은 다공성 부재의 두께에 따른 세포 누출 실험 과정 및 결과를 나타내는 도면이다((a) 투과도에 따른 세포 누출 실험 과정에 대한 개략도, (b) 비교예의 투과도에 따른 세포 누출 문제 실험 결과).
도 9(a)는 비교예 1과 실시예 1에서 다공성 멤브레인의 광 투과도를 비교한 그래프이며, (b)는 광 투과도에 따른 세포의 생존율을 측정한 그래프이다.
도 10은 비교예 2의 다공성 멤브레인의 표면을 확대한 도면이다((a) ×200, (b) ×1000).
도 11은 비교예 2의 다공성 멤브레인의 표면을 확대한 도면이다((a) ×1,100, (b) ×7,000).
본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 실시예를 가질 수 있는 바, 특정 실시예들을 도면에 예시하고 상세한 설명에 상세하게 설명하고자 한다.
그러나, 이는 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본 발명에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
또한, 본 발명에서 첨부된 도면은 설명의 편의를 위하여 확대 또는 축소하여 도시된 것으로 이해되어야 한다.
이하, 본 발명에 대하여 도면을 참고하여 상세하게 설명하고, 도면 부호에 관계없이 동일하거나 대응하는 구성 요소는 동일한 참조 번호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다.
본 발명에서, "세포 배양 구조체" 란, 다양한 세포의 성장 및 분화를 촉진시키기 위하여 통상의 웰(well) 플레이트에 삽입되는 구조체로, 일종의 세포 배양 인서트(cell culture insert)를 의미한다.
본 발명에서, "다공성 부재" 란, 세포는 통과할 수 없으나, 배양액은 통과할 수 있는 미세한 관통홀이 형성된 막을 의미한다. 한편, 본 발명에서 다공성 부재는 나노섬유가 얽혀있는 구조로 형성될 수 있으며, 세포 배양 구조체의 몸체 일단을 덮도록 형성될 수 있다.
아울러, 본 발명에서, "다공성 멤브레인"은 상기 다공성 부재와 콜라겐을 포함하는 구성으로, 보다 구체적으로, 다공성 부재의 나노섬유 표면에 콜라겐이 도포된 부재를 의미할 수 있다.
한편, "일측" 이란, 세포 배양 구조체의 한쪽 방면을 의미하는 것으로, 일 예로, 세포 배양 구조체에서 일측은 세포 배양 장치의 배양 플레이트에 먼저 삽입되는 측을 의미할 수 있다. 아울러, "일단"은 세포 배양 구조체 끝단을 의미한다.
"타측"은 일측의 반대 측을 의미하는 것으로, 후술하게 되는 리브가 형성되는 측을 의미할 수 있으며, "타단"은 상술한 일단의 반대측의 끝단을 의미한다.
본 발명은 세포 배양 구조체, 이의 제조방법 및 세포 배양 구조체를 포함하는 세포 배양 장치를 제공한다.
종래, 나노섬유 멤브레인이 형성된 세포 배양 구조체를 이용하여 세포를 배양하는 경우, 나노섬유 멤브레인 위 아래로 세포를 관찰할 때, 복잡한 나노구조로 인하여 투과도가 낮은 문제가 있었다. 아울러, 투과도를 높이기 위하여 상기 멤브레인의 두께를 줄이는 경우, 세포 배양 구조체에서 배양되는 세포가 누출되는 문제점이 있었다.
이러한 문제점을 극복하기 위해서, 본 발명은 세포 배양 구조체, 이의 제조방법 및 세포 배양 구조체를 포함하는 세포 배양 장치를 제공한다.
특히, 본 발명에 따른 세포 배양 구조체는 몸체의 일단에 나노섬유로 형성된 다공성 부재를 포함하고, 상기 나노섬유의 표면을 둘러싸는 콜라겐을 포함하는 다공성 멤브레인을 포함한다. 이에 따라, 상기 다공성 멤브레인의 다공성을 유지하되 세포 배양시 상기 세포가 누출되는 것을 방지할 수 있는 효과가 있다.
아울러, 상기 세포 배양 구조체는 세포 배양시 390 내지 700 nm 의 가시광선 파장영역에서 70% 이상의 평균 광투과도를 갖는 효과가 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 하나의 실시예에 따른 세포 배양 구조체(10)는 후술하게 되는 배양 플레이트의 수용부에 삽입되도록 이루어지며, 도 3에 도시된 바와 같이, 몸체(100) 및 다공성 멤브레인(110)을 포함한다.
이때, 몸체(100)는 원통형으로 일단과 타단이 관통되도록 형성되며, 상기 수용부에 실질적으로 삽입되는 부분이다. 특히, 수용부의 밑면과 서로 접하지 않도록, 몸체(100)의 높이는 수용부의 높이 보다 작게 이루어질 수 있다.
이러한 구조에 의해서, 상기 수용부와 몸체(100)의 밑면 사이가 이루는 공간은 부유 배양이 이루어지는 공간으로 활용될 수 있다.
몸체(100)는 일단과 타단이 관통되도록 형성되며, 내부에 중공이 형성되는 원통형일 수 있으며, 세포 배양을 용이하게 할 수 있는 형태라면 특별히 제한되지 않는다.
아울러, 몸체(100)는 생체 친화성 재질로 이루어질 수 있다. 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리카보네이트(PC) 와 같은 투명한 생체 친화성 플라스틱, 유리 등으로 이루어질 수 있다.
본 발명의 하나의 실시예에 따른 다공성 멤브레인(110)은 몸체(100)의 일단에 형성될 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 다공성 멤브레인(110)은 나노섬유(1111)로 형성된 다공성 부재(111)와 상기 나노섬유(1111) 표면에 형성된 콜라겐(112)을 포함하며, 몸체(100)의 일단을 덮도록 형성될 수 있다.
여기서, "다공성 부재" 란, 세포는 통과할 수 없으나, 배양액은 통과할 수 있는 미세한 관통홀(113)이 형성된 막을 의미한다. 본 발명에서 다공성 부재(111)는 나노섬유(1111)가 얽혀있는 구조로 형성될 수 있으며, 세포 배양 구조체(10)의 몸체(110) 일단을 감싸도록 형성될 수 있다.
아울러, "다공성 멤브레인"은 상술한 바와 같이, 상기 다공성 부재(111)와 콜라겐(112)을 포함하는 구성으로, 다공성 부재(111)의 나노섬유(1111) 표면에 콜라겐(112)이 도포된 부재일 수 있다.
다공성 멤브레인(110)도 상기 다공성 부재(111)와 마찬가지로 세포는 통과할 수 없으나, 배양액은 통과할 수 있으며, 세포배양시 지지체 역할을 할 수 있다.
한편, 본 발명의 하나의 실시예에 따르면, 콜라겐(112)은 다공성 부재(111)의 일면 또는 양면에 부착되어 형성된 것이 아니라, 나노섬유(1111)의 표면을 둘러싸도록 형성된 것을 특징으로 한다.
이러한 경우, 콜라겐이 나노섬유(1111) 표면을 둘러싸도록 형성됨으로써, 나노섬유(1111) 사이의 기공을 메워주어 세포 누출을 방지할 수 있다. 아울러, 콜라겐이 나노섬유(1111) 표면에 형성되어 상기 나노섬유(1111)와 세포의 친화도가 보다 높아져 세포의 부착능이 증대될 수 있다. 즉, 상술한 바와 같이, 나노섬유(1111)로 형성된 다공성 부재(111)와 나노 섬유의 표면에 콜라겐으로 인하여, 본 발명의 세포 배양 구조체(10)에서 세포 배양시 세포 정렬 능력이 유지될 수 있다.
한편, 콜라겐 외에도 알지네이트, 아가로즈, 젤라틴 등의 하이드로겔도 가능하다.
본 발명의 하나의 실시예에 따르면, 상기 다공성 멤브레인(110)은 390 내지 700 nm 의 가시광선 파장영역에서 70% 이상의 평균 광투과도 또는 75 내지 95% 의 광투과도, 또는 80 내지 90% 이상의 광투과도를 갖는 것을 특징으로 한다.
구체적으로는 680nm 에서는 70% 이상의 평균 광투과도를 갖고, 75% 이상 또는 80% 이상의 평균 광투과도를 가질 수 있다. 이러한 광투과도는 통상적인 분광 광도계에 의해서 붉은 빛에 대한 투과율을 측정할 수 있다.
특히, 세포 배양시 70% 이상의 광투과도를 가질 때, 세포의 생존률이 증가할 수 있다.
아울러, 본 발명의 하나의 실시예에 따른 다공성 멤브레인(110)에 포함되는 다공성 부재(111)는 평균 0.5 내지 5 ㎛ 의 두께를 갖는 것을 특징으로 한다.
통상적으로, 다공성 부재(111)의 두께가 얇을수록 광투과도가 증가하게 되는데, 다공성 부재(111)의 두께가 얇으면, 세포 배양 구조체(10) 내에 배양하던 세포가 누출될 수 있다.
그러나, 본 발명의 하나의 실시예에 따른 세포 배양 구조체(10)는 다공성 부재(111)와 콜라겐으로 형성되어 있어, 분리막의 두께가 얇아도 세포의 누출을 방지할 수 있다.
구체적으로, 다공성 부재(111)는 0.5 내지 5 ㎛ 의 두께일 수 있으며, 또는 1.0 내지 4.0 ㎛, 또는 2.0 내지 4.0 ㎛ 두께일 수 있다.
다만, 다공성 부재(111)의 두께가 0.5 ㎛ 미만인 경우, 다공성 부재(111)에 포함되는 나노섬유(1111)가 너무 적어 세포가 부착될 수 있는 공간이 부족해지며 기공이 너무 넓어져, 세포 누출의 문제가 발생할 수 있으며, 5.0 ㎛ 를 초과하게 되면, 다공성 부재(111)를 이루는 나노섬유(1111)가 너무 많이 엉켜있어 광투과도를 70% 이상 확보할 수 없다.
한편, 다공성 부재(111)가 0.5 내지 5.0 ㎛ 의 두께일 때, 다공성 부재(111)에 형성된 기공의 평균직경은 0.4 내지 0.9 ㎛ 범위일 수 있다. 다공성 부재(111)의 평균직경이 0.4 ㎛ 미만인 경우, 상술한 바와 같이, 다공성 부재(111)를 이루는 나노섬유(1111)가 너무 많이 엉켜있어, 광투과도를 85% 이상 확보할 수 없게된다. 아울러, 다공성 부재(111)의 평균직경이 0.9 ㎛를 초과하게 되면, 기공이 너무 넓어져 세포 누출의 문제가 발생할 수 있다.
아울러, 나노섬유(1111)는 생체물질이 용이하게 부착될 수 있는 고분자 나노섬유일 수 있으며, 상기 고분자 나노섬유(1111)는 폴리카프로락톤(PCL), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리락틱산(PLLA), 폴리락틱코글라이콜릭산(PLGA), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 고무로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상으로부터 형성될 수 있다.
일 예로, 생체 적합성 고분자인 폴리카프로락톤(PCL)일 수 있다.
이때, 나노섬유(1111)는 평균 직경이 100 내지 900 nm 일 수 있으며, 또는 110 내지 800 nm, 또는 280 내지 550 nm 또는 390 내지 430 nm 일 수 있다.
콜라겐(112)은 단백질의 일종으로서, 길고 가는 섬유형태를 띠며, 인간을 비롯한 동물의 체내에서 세포와 세포 사이를 연결하는 세포접착 및 고리 사슬 같은 역할을 할 수 있다.
본 발명에서 콜라겐(112)은 1 내지 5%(w/v) 농도의 콜라겐 용액일 수 있으며, 구체적으로, 플라즈마 처리된 콜라겐일 수 있다.
아울러, 세포 배양 구조체(10)의 상단, 즉 몸체(100)의 타단에는 후술하게 되는 배양 플레이트에 걸리도록 리브(120)가 형성될 수 있다. 상기 리브는 걸림턱의 역할을 하는 것으로, 상기 리브(120)가 배양 플레이트 수용부의 상단에 걸리도록 이루어짐에 따라, 세포 배양 구조체(10) 및 수용부의 상단이 대체로 동일면상에 배치될 수 있다.
또한, 도 5를 참조하면, 본 발명은 다른 하나의 실시예에서,
일단과 타단이 관통하도록 형성된 몸체와 몸체의 일단에 형성되되, 나노섬유(1111)로 형성된 다공성 부재에 콜라겐을 도포하는 단계(S100);
콜라겐이 도포된 다공성 부재를 플라즈마 처리하는 단계(S200); 를 포함하는 세포 배양 구조체의 제조방법을 제공한다.
먼저, 콜라겐을 도포하는 단계는 다공성 부재를 1 내지 5%(w/v) 농도의 콜라겐 용액에 30 내지 90 분 침지하여 콜라겐을 도포할 수 있다.
이때, 콜라겐의 농도가 1 %(w/v) 내지 5 %(w/v), 1.5 내지 4.5%(w/v) 또는 1.5 내지 3%(w/v)이거나, 2.0 (w/v)인 것일 수 있다. 다만, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 다공성 부재는 상기 콜라겐 용액에 30 내지 90 분 침지하여 콜라겐을 도포할 수 있다.
다음으로, 플라즈마 처리하는 단계는 산소 기체를 이용하여 처리시간 10 내지 600 sec, 전력 50 내지 200 W, 가스유속 0.1 내지 20 cc/min 의 조건으로 플라즈마 처리하여, 다공성 부재(111)를 친수성 표면으로 개질할 수 있다.
산소 플라즈마 처리의 경우 소수성의 나노섬유의 경우 친수성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 이 외에도 아르곤, 헬륨 등의 불활성기체에 의한 대기압 플라즈마 발생의 경우 역시, 공기중의 O2/H2 등에 의해 히드록실기가 형성되어 친수성으로 개질될 수 있다.
한편, 다공성 부재(111)의 표면을 친수성으로 개질하는 것은 상기 콜라겐의 침투성을 증가시키기도 하고, 세포의 흡착이 용이하도록 하기 위함이다. 특히, 다공성 부재(111)의 표면에 콜라겐을 골고루 도포하여 다공성 멤브레인(110)을 제조하기 위함이다.
그리고, 플라즈마 처리한 다공성 멤브레인(110)의 콜라겐을 겔화(gelation)시킬 수 있다. 콜라겐을 겔화시킴으로써, 다공성 부재(111)를 이루는 나노섬유(1111)가 콜라겐 겔에 둘러싸인 복합체 형태로 형성될 수 있다.
구체적으로, 플라즈마 처리한 다공성 멤브레인은 37℃ 이상의 인큐베이터 내에서 20 내지 60 분을 유지하여 콜라겐을 겔화시킬 수 있다.
콜라겐을 겔화시키는 단계는 37℃ 내지 40℃, 37℃? 내지 39℃, 또는 37℃ 내지 38℃에서 수행할 수 있다. 37℃ 미만의 온도에서는 콜라겐 가교 결합이 일어나지 않을 수 있으며, 40℃ 를 초과하게 되면, 콜라겐이 변성이 일어날 수 있기 때문에 상술한 온도에서 반응시키는 것이 바람직하다.
한편, 콜라겐이 겔화 되는 동안 건조되는 것을 방지하기 위하여, 인큐베이터의 습도는 70% 이상 유지할 수 있다.
한편, 다공성 부재(111)는 세포 배양 구조체(10)의 일단에 형성되는 것으로, 몸체(100)의 일단에 고분자 나노섬유(1111)를 전기 방사하여 형성할 수 있다.
전기 방사는 고분자 물질을 전기 방사가 가능한 적절한 점도를 갖도록 용액 탱크에 저장한 후, 방사부의 방사 노즐을 통해 고분자 물질이 토출되도록 한다. 고분자 물질은 토출한 후 비산과 동시에 경화되어 고분자 나노섬유를 형성한다. 고분자 나노섬유는 액적 위에 적층되면서 섬유가 얽혀서 망형 구조를 형성한다.
고분자 물질은 클로로폼(chloroform)과 메탄올(methanol)을 질량비로 1:1로 혼합한 용매에, 폴리카프로락톤을 혼합하여 5% 내지 25% 농도인 고분자 용액일 수 있다.
또는 아세톤(acetone)과 디메틸포르마이드(Dimethylformamide)를 3:7의 부피비로 혼합한 후, 25wt%인 폴리비닐 리덴플로라이드를 혼합하여 25% 내지 30% 농도인 고분자 용액일 수 있다.
그 외에도 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 콜라겐/폴리카보네이트를 이용하여 고분자 용액을 제조할 수 있다.
이때, 노즐을 통한 고분자 섬유의 방출 속도는 액적의 형상을 유지하면서, 액적 위에 고분자 섬유가 얹혀질 수 있도록 0.01 ml/h 내지 3 ml/h의 속도로 방사하는 것이 바람직하다.
그리고 방사 노즐과 전해질 사이에는 전기장이 인가되는데, 이때 인가되는 전기장의 세기가 지나치게 낮을 경우 전기 방사용 조성물이 연속적으로 토출되지 않기 때문에 균일한 두께의 고분자 섬유를 제조하기 어렵고, 방사된 후 형성된 고분자 섬유가 액적 위에 원활하게 집속될 수 없기 때문에 망형 구조를 형성하기가 어렵다. 반대로, 전기장의 세기가 지나치게 높을 경우 고분자 섬유가 액적에 정확하게 안착되지 않기 때문에 정상적인 형태를 갖는 망형 구조를 형성하기 어렵다. 따라서 방사 노즐과 전해질 사이에 인가되는 전기장의 세기는 5kV 내지 30kV 로 인가하는 것이 바람직하다.
상기와 같은 토출 속도 및 전기장으로 형성하면, 고분자 섬유의 직경은 수십 내지 수백 나노 크기일 수 있다.
이처럼, 전기 방사기를 이용하여 고분자 물질을 방사하면, 섬유 형태의 고분자 섬유가 액적 위에 액적의 형상을 따라서 적층되며, 고분자 섬유들이 불규칙적이면서 연속적으로 얽힌 망형 구조를 이룰 수 있다.
또한, 도 6을 참조하면, 본 발명은 또 다른 하나의 실시예에서,
하나 이상의 수용부를 갖는 배양 플레이트; 및
각 수용부에 삽입되는 제1항에 따른 세포 배양 구조체; 를 포함하는 세포 배양 장치를 제공한다.
도 6을 참조하면, 배양 플레이트는 상방에서 하방으로 인입된 적어도 하나의 수용부를 포함한다. 상기 수용부는 세포 배양을 위한 배양액이 채워지며, 상기 세포 배양 구조체가 삽입되는 구조이다.
구체적으로, 수용부는 상단이 개방되어 있으며, 원통형 내벽과 바닥면을 갖는다. 수용부에는 배양액과 세포 배양 구조체에서 배양되는 세포와 상호작용을 하는 다른 세포가 저장될 수 있다. 일 예로, 암세포를 배양하는 경우에 상기 세포 배양 구조체에는 암세포를 투입하고, 수용부에는 조직세포를 투입할 수 있다.
배양 플레이트는 생체 친화성 재질로 이루어질 수 있다. 특별히 제한되는 것은 아니지만, 예를 들어, 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리카보네이트(PC) 와 같은 투명한 생체 친화성 플라스틱, 유리 등으로 이루어질 수 있다.
아울러, 수용부의 표면에는 용도에 따라서 세포 고정을 막는 표면 처리 층 또는 세포 고정을 위한 단백질 표면 처리 층이 형성된다.
상기 수용부에는 세포 배양 구조체가 삽입될 수 있다.
한편, 상기 수용부는 배양 플레이트에 다양한 수의 행과 다양한 수의 열로 형성될 수 있다. 예를 들어, 상기 수용부는 2개의 행과 3개의 열을 이루어서 총 6개의 수용부가 배양 플레이트에 형성될 수 있다.
또한, 상기 수용부는 3개의 행과 4개의 열을 이루어서 총 12개가 배양 플레이트에 형성될 수 있다. 또한, 상기 수용부는 6개의 행과 8개의 열을 이루어 총 48개가 배양 플레이트에 형성될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
실시예 1. 세포 배양 구조체의 제조
1-1. 다공성 부재에 콜라겐 코팅
5% 이상의 고농도 바이오 콜라겐 용액을 정제수를 이용하여 콜라겐 용액을 제조한 뒤, NaOH를 이용하여 pH 7.0으로 중화하였다. 그리고, 배양액을 이용하여 2 mg/ml(2%, w/v) 의 농도로 맞춰주었다. pH가 7.0이 아닌 선성이나 알칼리의 경우 신체 내 주입 시 문제를 야기할 가능성이 있어 중성콜라겐을 이용하는 것이 바람직하다.
도 7은 본 발명의 실시예에서 세포 배양 구조체의 다공성 부재에 콜라겐을 코팅하는 과정을 나타낸 사진이다.
도 7을 참조하면, 해당 콜라겐 용액을 세포 배양 구조체가 삽입될 수 있는 가이드의 수용부에 토출시켰다.
실시예에서는 12 well 사이즈이 경우 55 ㎕, 24 well 사이즈의 경우는 17㎕ 를 가이드의 수용부에 토출시켰다. 이는 정량의 콜라겐을 나노섬유 다공성 부재에 코팅하기 위함이다.
그리고, 상기 수용부에 평균 두께 2 ㎛ 의 다공성 부재를 포함하는 세포 배양 구조체를 침지시켰다. 상기 다공성 부재는 나노섬유가 무작위로 엉켜서 형성된 것이다.
1-2. 플라즈마 처리
콜라겐을 코팅한 다공성 부재의 친수성을 증가시키기 위해 다공성 부재에 플라즈마 장치를 이용하여 산소 플라즈마를 처리하였다. 이때, 무선주파수 출력은 100 W으로 30 초 동안 처리하였다.
1-3. 콜라겐의 겔화 ( gelation )
플라즈마 처리한 다공성 멤브레인의 콜라겐을 겔화(Gelation) 시켰다.
보다 구체적으로, 37℃ 의 인큐베이터에서 플라즈마 처리한 다공성 멤브레인을 30분동안 배양하였다. 한편, 다공성 부재에 도포된 콜라겐 용액의 양이 매우 적기 때문에, 상기 콜라겐이 건조되는 것을 방지하기 위하여 습도를 70% 이상 유지하였다.
실시예 2 및 실시예 3. 세포 배양 구조체의 제조
실시예 1과 동일한 방법으로 세포 배양 구조체를 제조하였다. 다만, 실시예 2와 3에서 제조한 세포 배양 구조체는 각각 3 ㎛와 4 ㎛ 의 다공성 부재를 포함하였다.
그리고, 실시예 1 내지 3의 다공성 부재의 두께를 아래의 표 1에 정리하였다.
실시예 1 실시예 2 실시예 3
다공성 멤브레인의 두께(㎛) 2 3 4
< 비교예 >
비교예 1 ~ 5.
다공성 부재를 포함하는 세포 배양 구조체를 준비하였다. 실시예 1과 마찬가지로, 상기 다공성 부재는 나노섬유에 의해서 형성된 다공성 부재이다. 세포 배양 구조체를 준비하였으며, 표 2의 두께를 가진 다공성 부재를 포함하는 세포 배양 구조체를 준비하였다(표 2 참조).
비교예 1 비교예 2 비교예 3 비교예 4 비교예 5
다공성 부재의 두께(㎛) 6 4 3 2 1
콜라겐 겔화 유무 Χ Χ Χ Χ Χ
비교예 6.
실시예 1과 동일한 방법으로 세포 배양 구조체의 다공성 부재에 콜라겐 코팅하였다. 다만, 플라즈마 처리 및 콜라겐 겔화는 수행하지 않았다. 참고로, 다공성 부재의 두께는 2 ㎛ 였다.
비교예 7.
실시예 1과 동일한 방법으로 세포 배양 구조체의 다공성 부재에 콜라겐을 코팅하였다. 그리고, 플라즈마를 처리하였다. 다만, 콜라겐 겔화는 수행하지 않았다. 참고로, 다공성 부재의 두께는 2 ㎛ 였다.
<실험예>
실험예 1. 다공성 부재의 두께에 따른 세포 누출 실험
세포 배양 구조체의 다공성 멤브레인(다공성 부재)의 두께에 따른 세포 누출 실험을 진행하였다.
보다 구체적으로, 다공성 멤브레인의 두께는 상기 다공성 멤브레인을 폴리디메틸실록산에 침지시키고, degassing 후, 굳혀 멤브레인의 단면을 현미경으로 관찰하여 측정하였다. 이때, 빛 투과도는 분광 광도계를 이용하여 평균 680nm 파장의 붉은 빛에 대한 투과율을 측정하였다(도 8(a)).
아울러, 세포 누출 여부는 인간 재정맥 내피세포를 배양 하고 24시간 후에 세포 배양 장치의 수용부 바닥에 세포가 누출되었는지 현미경으로 관찰하였다.
그리고, 그 결과를 아래의 표 3에 나타내었다.
다공성 부재의 두께(㎛) 콜라겐 겔화 유무 광투과도(%) 세포 누출 여부
실시예 1 2 ○ 90 x
실시예 2 3 ○ 85 x
실시예 3 4 ○ 80 x
비교예 1 6 x 25 x
비교예 2 4 x 40 x
비교예 3 3 x 50 x
비교예 4 2 x 60 ○
비교예 5 1 x 66 ○
본 발명의 실시예의 경우, 다공성 멤브레인의 두께가 얇아질수록 광 투과도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그리고, 다공성 부재의 두께가 2 ㎛ 일 때도 세포가 누출된 것을 확인할 수 없었다.
이는 다공성 부재를 이루고 있는 나노섬유 표면에 콜라겐이 둘러싸여 있으므로, 나노섬유와 세포의 친화도를 높여 세포의 누출을 방지할 수 있는 것으로 판단된다.
반면, 비교예의 경우, 다공성 멤브레인의 두께가 얇아질수록 빛 투과도가 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, 상기 다공성 멤브레인의 두께가 1 ㎛ 일 때, 배양 중에 세포가 누출된 것을 확인할 수 있었다(도 8(b) 참조).
아울러, 실시예와 비교예의 광투과도를 비교하였을 때, 비교예 대비 실시예의 광투과도가 우수한 것을 확인할 수 있다. 구체적으로, 실시예 1과 비교예 4를 비교하였을 때, 서로 동일한 두께의 다공성 부재일 지라도, 콜라겐이 도포된 실시예 1의 광투과도가 우수한 것을 확인할 수 있다.
이는 실시예 1이 다공성 부재에 콜라겐이 도포됨으로써 나타나는 효과인 것으로 판단된다.
실험예 2. 광 투과도에 따른 세포 생존률 변화 측정
실시예와 비교예의 광 투과도에 따른 세포의 생존률 변화를 측정하였다.
광 투과도 및 세포의 생존률 변화를 측정하여, 이를 도 9에 나타내었다. 구체적으로, 도 9(a)는 비교예 1과 실시예 1에서 다공성 멤브레인의 광 투과도를 비교한 그래프이며, (b)는 광 투과도에 따른 세포의 생존율을 측정한 그래프이다.
먼저, 다공성 멤브레인에 콜라겐의 유무에 따른 빛 투과도 변화를 측정하였다. 그 결과, 빛 투과도는 비교예 2 대비 실시예 3 이 30% 이상 향상된 것을 확인할 수 있었다.
즉, 본 발명의 실시예는 다공성 멤브레인에 콜라겐을 포함하였을 때, 콜라겐을 포함하지 않은 비교예 대비 다공성 멤브레인의 두께를 얇게 형성하는 것이 가능하였다. 이에 따라 평균 70% 이상의 광투과도를 갖는 것이 가능한 것으로 판단된다(도 9(a) 참조).
아울러, 비교예 2, 비교예 6과 실시예 3의 세포 배양 구조체에 세포를 배양하였으며, 배양 후 72 시간 후에 배양한 세포의 생존율을 비교하였다. 참고로, 비교예 6은 콜라겐은 도포하였으나, 플라즈마 처리하지 않은 다공성 멤브레인을 포함하는 세포 배양 구조체이다.
그 결과, 비교예 2의 세포 배양 구조체에서 배양한 세포는 생존율이 최대 80% 였으며, 비교예 6의 세포 배양 구조체에서 배양한 세포는 생존율이 최대 93% 였다. 반면, 실시예 3의 세포 배양 구조체에서 배양한 세포는 생존율이 최대 97% 였다.
이는 다공성 멤브레인의 광투과도가 세포의 생존에 영향을 미치는 것을 알 수 있다.
실험예 3. 플라즈마 처리 유무에 따른 다공성 멤브레인 표면 비교
실시예 1과 비교예 7에서 제조한 세포 배양 구조체의 다공성 멤브레인의 표면을 관찰하였다.
도 10은 비교예 7의 다공성 멤브레인의 표면을 확대한 도면이며((a) ×200, (b) ×1000), 도 11은 실시예 1의 다공성 멤브레인의 표면을 확대한 도면이다((a) ×1,100, (b) ×7,000).
도 10을 참조하면, 나노섬유의 표면 상에 콜라겐 단위체가 붙어있는 것을 확인할 수 있다. 즉, 콜라겐이 나노섬유의 표면을 둘러싸도록 도포된 것이 아닌 나노섬유가 이루고 있는 다공성 부재의 일면에 붙어있는 것을 확인할 수 있다.
도 11은 콜라겐 용액을 나노섬유에 도포한 후 플라즈마 처리하고, 겔화시킨 것으로, 나노섬유 전체를 작은 콜라겐 미세섬유들이 감싼 형태를 갖는 것을 확인할 수 있다.
10: 세포 배양 구조체
20: 세포 배양 장치
100: 몸체 110: 다공성 멤브레인
111: 다공성 부재
1111: 나노섬유
112: 콜라겐 113: 홀
120: 리브
200: 배양 플레이트 210: 수용부

Claims (13)

  1. 일단과 타단이 관통하도록 형성된 몸체; 및
    몸체의 일단에 형성되되, 나노섬유로 형성된 다공성 부재와 상기 나노섬유 표면에 형성된 콜라겐 겔을 포함하는 다공성 멤브레인;을 포함하며,
    상기 다공성 멤브레인은 콜라겐 겔이 다공성 부재의 나노섬유 표면을 둘러쌈으로써 나노섬유 사이의 기공을 메우는 구조를 갖고,
    상기 다공성 부재는 평균 0.5 내지 5.0 ㎛의 두께를 가지며,
    상기 다공성 멤브레인은 390 내지 700 nm 의 가시광선 파장영역에서 70% 이상의 평균 광투과도를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 배양 구조체.
  2. 제1항에 있어서,
    다공성 멤브레인은
    390 내지 700 nm 의 가시광선 파장영역에서 75 내지 95% 범위의 평균 광투과도를 갖는 것을 특징으로 하는 세포 배양 구조체.
  3. 제1항에 있어서,
    다공성 부재에 형성된 기공은
    평균직경 0.4 내지 0.9 ㎛ 범위인 것을 특징으로 하는 세포 배양 구조체.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서,
    나노섬유는 고분자 나노섬유이고,
    상기 고분자 나노섬유는 폴리카프로락톤(PCL), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리스타이렌(PS), 폴리락틱산(PLLA), 폴리락틱코글라이콜릭산(PLGA), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 폴리에틸렌(PE), 폴리우레탄(PU), 셀룰로오스 및 고무로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상으로부터 형성된 것을 특징으로 하는 세포 배양 구조체.
  6. 제1항에 있어서,
    나노섬유는 평균 직경이 100 내지 900 nm 인 것을 특징으로 하는 세포 배양 구조체.
  7. 제1항에 있어서,
    몸체는 원통형으로 형성되며,
    상기 몸체의 타단에 상기 몸체의 직경보다 큰 직경을 가지는 리브를 포함하는 세포 배양 구조체.
  8. 일단과 타단이 관통하도록 형성된 몸체와 몸체의 일단에 형성되되, 나노섬유로 형성된 다공성 부재에 콜라겐을 도포하는 단계;
    콜라겐이 도포된 다공성 부재를 플라즈마 처리하는 단계; 및
    플라즈마 처리된 다공성 부재의 콜라겐을 겔화시켜 나노섬유가 콜라겐 겔로 둘러싸인 구조의 다공성 부재를 형성하는 단계를 포함하는 제1항에 따른 세포 배양 구조체의 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    다공성 부재는 세포 배양 구조체의 일단에 고분자 나노섬유를 전기 방사하여 다공성 부재를 형성하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 구조체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서
    전기 방사는 5 내지 30kV 의 전압을 인가하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 구조체의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서
    플라즈마 처리하는 단계는 산소 기체를 이용하여 처리시간 10 내지 600 sec, 전력 50 내지 200 W 의 조건으로 플라즈마 처리하여, 친수성 표면으로 개질하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 구조체의 제조방법.
  12. 제8항에 있어서,
    콜라겐을 도포하는 단계는 다공성 부재를 1 내지 5%(w/v) 농도의 콜라겐 용액에 30 내지 90 분 침지하여 콜라겐을 도포하는 것을 특징으로 하는 세포 배양 구조체의 제조방법.
  13. 하나 이상의 수용부를 갖는 배양 플레이트; 및
    각 수용부에 삽입되는 제1항에 따른 세포 배양 구조체; 를 포함하는 세포 배양 장치.
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