JP2005253305A

JP2005253305A - ３次元細胞培養素子の製作方法

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Publication number: JP2005253305A
Application number: JP2004065021A
Authority: JP
Inventors: Masataka Murahara; 正隆村原; Porter Elizabeth; ポーターエリザベス; Lee William; リーウィリアム
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2004-03-09
Filing date: 2004-03-09
Publication date: 2005-09-22

Abstract

【課題】多孔質フッ素樹脂内孔壁を紫外線の光化学反応によって、露光部のみに、親水性基を置換して、３次元細胞培養の足場を作り、その３次元構造体である細孔内壁にドーパミン産生細胞、あるいは線維芽細胞、骨芽細胞、コラーゲン増産細胞、幹細胞、髄核細胞、インシュリン産生細胞などの細胞を培養増殖することによって、パーキンソン、アルツハイマー、糖尿病、骨軟化症などの患者を救うための患部に移植・着床可能な細胞培養素子を作ることができる。
【解決手段】フッ素樹脂などのプラスチック多孔質内孔を親水性化するために、多孔質部にアルコールを浸透させるか、放電を行うことによって内孔を一時的に水が着くようにする。内孔に水を入れ、その上から水を垂らし石英ガラス窓を被せ、193nmのArFレーザー光を照射すると、表面と内孔が親水性であるセル・チップができる。これをガス滅菌した後、細胞培養して、人体移植用セル・チップを生産する。
【選択図】なし

Description

本発明は、3次元細胞培養素子の製作方法に関する。

生体適合性材料は、生体には不活性で、生体反応を生じない材料が求められる。もし、組織適合性の悪い材料を生体に触れさせたりすると、材料表面から溶出した低分子物質、触媒、添加物、可塑剤などが組織反応を引き起こし、拒絶反応を起こす。このため生体との接触によって材料が劣化せず、かつ、それらの材料の物理的・化学的・生物的性質などが長期間維持されることが必要である。このため生体との反応が少ない材料として、フッ素樹脂、シリコーン樹脂、PET樹脂、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート樹脂、ポリプロプレン、ポリエチレン、ポリイミド、ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート等が採用されてきた。

ところが、これらの材料は生体と拒絶反応は起こし難いが、生体親和性に乏しい物が殆どである。これらの材料に、生体組織や器官が有する機能を付与する事が望まれる。特に生体適合性で最も重要な要素が「親水性」である。これを達成するために材料表面にプラズマ照射処理を行なう事が広く行なわれている。しかしこれでも当該処理によって発現された性質を長時間維持する事は難しかった。

これらの材料に薬品の存在下でエキシマレーザー光を照射して、光化学的にレーザー露光部のみを親水基や疎水基を置換して、恒久的な親水性や撥水性を付与する方法が、本願発明者らによって特許文献1から7に報告されている。さらに本願発明者らによる、透明フッ素樹脂（FEP）チューブの中に水またはアルミン酸ナトリウム水溶液を流し、チューブの外壁から格子状ArFレーザー光を投影して、チューブ内壁に親水基と疎水基のミクロドメイン構造を作り、これを人工血管に応用した非特許文献1に開示されている。

一方細胞培養に関してはコラーゲンを培地として、線維芽細胞に包まれた自己の皮膚を培養・増殖した人工皮膚については、非特許文献2に記載されている。さらに最近、培養した細胞や組織、生きた細胞を埋め込んだ医療機器を、機能不全に成った臓器や組織を再生・回復させる「再生医学」が台頭し、マサチューセッツ「医科大学Tissue Engineeringでは培養の足場に体内に溶けるポリマーを用い、包皮細胞を生体外培養し、1998年FDAの認可を得て人工皮膚を商品化している。また米国のオシリス・セラピューティクス社は成人の骨髄の中にある間葉系幹細胞を培養し、血球や骨、軟骨、腱、・筋肉などの細胞・組織を作っている。国内では京大再生医科学研究所の清水慶彦らは培養の足場にコラーゲンを使用し、動物生体内で各臓器の再生に成功している。また慶応大学医学部の福田敬一らは骨髄細胞を利用した臓器再生の可能性を示唆している。

パーキンソン病はアルツハイマー病についで疾患人口が多く、約1000人に１人の難病であると言われる神経変性疾患であるが、この病気の原因はドーパミン放出細胞の変性によるものと言われている。これらの患者にドーパミンを生合成する前駆物質のL-Dopa薬を服用し、ドーパミンを補う方法は広く行なわれているが、持続性に乏しく、さらに進んでドーパミン神経の変性を食止める方法は無かった。ところが最近ボストンレイヒーク病院では1995年から豚の胎児の脳からドーパミンを産生する中脳細胞を採取し、パイプにより患者の脳内に30万/cc個の細胞を注入し20％以上の患者の症状が改善されている。国内では、非特許文献３に示すように岡山大学医学部神経外科のIsao Dateらがラットの副腎細胞腫から培養したドーパミン産生細胞[PC-12]をポリサルファン製マイクロカプセルに入れ猿に移植し1年以上ドーパミンを出し続けた事を報告している。しかし、これらの報告とも細胞は患部に固定されていない。
特願平1-15961 , 特願平5-238350 特願平5-238349 特願平5-238351 特願平5-080435 特願平8-194472 USP-6117497 特願平10-287742 特願2003-070216 特願 2002-350311 日本工業新聞1991年3月25日号宮田輝夫：人工皮膚、医学の歩み、134、9、p 839-843 (1985) Cell Transplantation, Vol.9, p.705-709 (2000) 大越昌幸、井上陽子、豊田浩一、村原正隆；レーザー研究、Vol.24(11), p1234-1238 (1996) H.Omuro, K.Hamada, T.Nakajima, E.Sinpuku, M.Nakagawa, H.Fukuda and M.Murahara: UV Laser Induced Amino Group Substitution on Pet Ligament to Promote Inhibition of Collagen, M.R.S. Sympo. Proc. Vol. 711, p85-90 (2002) Masataka Murahara, Yuji Sato, Viviana Fernandez, Francisco Fantes, Izuru Nose, William Lee, Peter Milne, Jean-Marie Parel: Hydrophilic Treatment of Porous PTFE for Intractable Glaucoma Implant Devices, SPIE/Progress in Biomedical Optics and Imaging, Vol. 4245, No2, 221-227 (2001)

最近宇宙環境利用センターが中心になって、宇宙再生医療技術研究会が発足し、微少重力下で骨、軟骨、神経、心臓、肝臓、膵臓、肝臓などを「3次元培養」する計画がある。一方、米航空宇宙局(NASA)の研究によると、通常の細胞培養では、スフェロイドと呼ばれる細胞の塊を形成できるものの、重層化する事が難しく、細胞同士が結合した後、平面状に広がってしまう。ところが宇宙環境下では沈降や対流が無いため、細胞同士が自然と集合化し、1mm以上の組織形成が可能であり、この「高密度細胞培養」によって、良質な組織・器官形成が促進される可能性があると報告されている。

この「高密度細胞培養」を促進させるためには、先ず生体への親和性の高い特殊な高分子材料を細胞培養の足場として使い、それに3次元的な組織を構築する必要がある。この目的のために、本発明では、拒絶反応が極力起こり難い材料を用い、光化学反応によって親水性化して細胞培養の足場を作り、かつ、宇宙での細胞培養ではなく、地上で「3次元培養」を行うものである。さらに本願発明による細胞は3次元構造体であるにもかかわらず、その周囲が繊維によるマトリックスで保護されている。この為、手術による移植過程に於ける細胞の物理的損傷を軽減し、繊細な神経細胞を保護する事が出来る。これにより、従来法による移植手術での90％の細胞死を50％以下に軽減する事が可能である。さらに本願発明の細胞素子はマイクロチップであるため患部に密着して着床させる事が出来る。

本願発明者らは、非特許文献4に開示したように1996年細菌を培養する目的でフッ素樹脂フィルム上にホウ酸水溶液存在下でパターン状のArFレーザー光を照射して露光部に親水基を置換し、それをゼラチン溶液に浸し、親水性化された部分のみにゼラチン培地を形成させ、そこにバクテリアを培養した。さらに非特許文献５に開示したように2002年PETフィルム表面に親水基やアミノ基にフッ素樹脂やポリエチレンテレフタレート(PET)などに光化学的に親水基を置換し、これを兎の皮膚内に移植した試料の親水基置換部に対応して白血球の集属が確認され、その部分に線維芽細胞が増殖することが明らかに成った。

一方、「3次元培養」の足場に用いようとする多孔質プラスチックの一つである多孔質フッ素樹脂内壁を光化学的に親水性に改質する技術も、本願発明者らによって特許文献５，７に開示してある。さらに非特許文献６に、多孔質フッ素樹脂内孔を親水基置換する際の改質条件及び生体での拒絶反応制御について、フッ素樹脂表面を脱フッ素する場合の脱フッ素原子として、ホウ素やアルミ原子は反応化合物が多孔質内に残留するため、これを兎の角膜に移植すると、その材料を新生血管が異物と認識して角膜外に排除する拒絶反応を観察した。ところが脱フッ素原子として水素原子を用いると拒絶反応が全く起こらない事が明らかに成り、この知見に基ずき表面改質の為の薬剤を水(H₂O)にする事が決定した事について開示している。

一般にフッ素樹脂は、たとえ多孔質といえども撥水性を呈し、内孔に水溶液が浸透しないため紫外線による水溶液と内孔壁との光化学反応が起こらない。このため内壁に親水基を置換する事が出来ない。そこで特許文献５，７および非特許文献６に記載してあるごとく、多孔質フッ素樹脂内孔にアルコール類を先ず浸透させる。これは水の表面張力(73.7dyn/cm)、フッ素樹脂の表面張力(28.5dyn/cm)、エチルアルコールの表面張力(22.3dyn/cm)である為、フッ素樹脂は水を弾く。ところがフッ素樹脂よりもアルコールの方が表面張力が小さい為、多孔質内孔壁に密着する。ところが水と鎖式の一価アルコールは低級のものは水と良く混じる。そこで先ず多孔質フッ素樹脂にエチルアルコールを浸透させ、その上から水を滴下すると、水が内孔にトラップされる。この状態で試料表面に再度水を滴下し、その上から石英窓をかぶせ、ArFレーザー光を照射すると、光化学反応によって試料内孔壁に親水基が置換される。試料が厚い場合には試料の両側から光を入射する。これらの親水性処理によって「3次元培養」の足場（培養床）が完成する。

本願発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意研究した結果、多孔質フッ素樹脂内孔壁に紫外線の光化学反応を利用して親水基を置換し、そこに細胞を床着させ、かつ、細胞を三次元培養させることが出来ることを見出した。その際、上記特許文献1，２，３，５，６，７，８，９，１０および非特許文献４，５，６に開示された方法を利用する。

多孔質フッ素樹脂フィルムは気体を通すが、水は高い圧力を掛けない限り通らない。一般に水の表面張力は72.3dyn/cm、フッ素樹脂は28.5dyn/cmである。従って、フッ素樹脂内孔に溶液を浸透させるには、28.5dyn/cm以下の表面張力を有する溶液でないとならない。一方エチルアルコールは22.3dyn/cmと低いため、多孔質フッ素樹脂内孔にアルコールを浸透させることが出来る。ところがメチルアルコールやエチルアルコールなどの低級アルコールは水と良く混じりあう。そこでエチルアルコールを浸透させた多孔質フッ素樹脂に水を注ぐと、水が内孔に入り込み、時間経過と共にアルコールは大気中に蒸発するが、水は多孔質内部にトラップされる。そこでさらにその上から水を垂らし石英ガラス窓を被せ、150から350nmの範囲のKr、F2、ArF、KrCl、XeCl、XeFなどのエキシマレーザー、N2レーザーあるいはKrやXe2、KrCl、XeClエキシマランプ、D2、Hg-Xe、Hgランプ、非線形素子による高調波レーザー光などを照射すると、内孔壁および表面が親水性に改質される。この親水基置換によって内孔が親水性に成り、細胞付着の足場ができ、そこに立体的に細胞を着床させることが出来る。

フッ素樹脂表面にプラズマ処理を施すと、水との接触角が一時的に小さくなる。その状態で試料に水を注ぎその上から石英ガラス窓を被せ、上部からArFレーザー光を照射すると、親水性化の効率が高くなることについて、本願発明者らは特許文献10で開示している。このプラズマ照射を表面だけでなく、多孔質内部まで処理をすることによって、アルコールの助けを借りなくても内孔に水を浸透できる。これによって紫外線による親水基置換反応を効率良く行い、光化学的にその内孔および表面を親水性化できる。この処理後、さらに試料表面にパーフロロポリエーテルなどの撥水基を有する溶液を注ぎ、その上から石英ガラス窓を被せ、150から350nmの範囲のKr、F2、ArF、KrCl、XeCl、XeFなどのエキシマレーザー、N2レーザーあるいはKrやXe2、KrCl、XeClエキシマランプ、D2、Hg-Xe、Hgランプ、非線形素子による高調波レーザー光などの紫外線を照射すると、表面のみを撥水性化し、表面は細胞の嫌気性領域を形成し、その内孔では立体的に細胞を着床させる事ができる。

生体との反応が少ない材料は、フッ素樹脂以外にも、シリコーン樹脂、PET樹脂、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート樹脂、ポリプロプレン、ポリエチレン、ポリイミド、ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなどの多孔質材料あるいは繊維状プラスッチクフィルム材料等があるが、これらも、プラズマ照射を表面だけでなく、多孔質内部まで処理をすることによって、内孔に水を浸透できる。これによって紫外線による親水基置換反応を効率良く行い、光化学的にその内孔および表面を親水性化できる。この処理後、さらに試料表面にパーフロロポリエーテルなどの撥水基を有する溶液を注ぎ、その上から石英ガラス窓を被せ、150から350nmの範囲のKr、F2、ArF、KrCl、XeCl、XeFなどのエキシマレーザー、N2レーザーあるいはKrやXe2、KrCl、XeClエキシマランプ、D2、Hg-Xe、Hgランプ、非線形素子による高調波レーザー光などの紫外線を照射すると、表面のみを撥水性化し、表面は細胞の嫌気性領域を形成し、その内孔は立体的に細胞を着床させる事ができる。

多孔質材料あるいは繊維状のプラスッチクフィルム材料内孔あるいは表面を、親水性に改質するためには、まず、それらプラスチック表面を構成している、HやFなどの末端原子を引き抜かねば成らない。それらの引き抜き原子として、脱水素原子としてはH、F、Cl 、脱フッ素原子としてはB、Al、Hなどである。これらの原子で末端原子を引き抜いた後に、-OH、-NH2、-COOH、-CO、-SO3H などの官能基を置換する。撥水性に改質する場合は -CH3、-C2H5、-CF3などの官能基を末端原子が引き抜かれた場所に置換する。実際には、予め所望の官能基と脱末端原子を結合させた水溶液を調合しておき、それを試料雰囲気中に置き、そこに紫外線を照射することによって、露光部のみを選択的に官能基を置換することができる。これらの処理によって内孔壁が親水性になった試料を細胞培養液に浸漬すると、親水性部分にドーパミン産生細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、コラーゲン増産細胞、幹細胞、髄核細胞、インシュリン産生細胞などの細胞が付着し、多孔質内壁に沿って3次元的に細胞の増殖培養が行なわれる。

本願発明によれば、多孔質フッ素樹脂内孔壁に紫外線の光化学反応を利用して親水基を置換し、そこに細胞を床着させ、かつ、細胞を三次元培養させることが出来るため高密度細胞培養が出来。

本発明では、拒絶反応が極力起こり難い材料を用い、光化学反応によって親水性化して細胞培養の足場を作り、かつ、宇宙での細胞培養ではなく、地上で「3次元培養」を行うものである。さらに本願発明による細胞は3次元構造体であるにもかかわらず、その周囲が繊維によるマトリクスで保護されている。この為、手術による移植過程に於ける細胞の物理的損傷を軽減し、繊細な神経細胞を保護する事が出来る。これにより、従来法による移植手術での90％の細胞死を50％以下に軽減する事が可能である。さらに本願発明の細胞素子はマイクロチップであるため患部に密着して着床させることができる。

本願発明によって、多孔質または繊維状プラスチックなど3次元構造体内壁を紫外線の光化学作用によって、露光部のみ親水性に改質し、選択的に細胞が着床する場所を限定できる。このため内孔壁を親水性化処理した細胞増殖用セル・チップに、例えばラットの副腎褐色細胞腫から培養したPC-12細胞などのドーパミン産生細胞を培養すれば、セル・チップが布状であるためパーキンソン患者の患部（線条体）に着床が容易である。このようにセル・チップが多孔体であるため、移植手術中にセル・チップ表面で細胞欠損が生じても、多孔質内部には細胞が存在するため、手術の成功率は高く、ドーパミン産生細胞のみならず、線維芽細胞、骨芽細胞、コラーゲン増産細胞、幹細胞、髄核細胞、インシュリン産生細胞などの培養が出来、再生医学に貢献できる。

これまで本願発明者らは、特許文献3および7に開示してあるように、毛細現象を利用して合成石英窓とプラスチック表面との間隙に溶液を挟み、そこに10〜25ｍJ/cm² のArFレーザー光を照射して、親水基 -OH, -NH₂を置換する方法は特許文献3、親油基 -CH₃, を置換する方法は特許文献１に開示してある。これらの発明や特許文献５を使って多孔質内孔を親水性化するために、まず、多孔質フッ素樹脂にエチルアルコールを浸透させ、すぐに水を注ぐと、水が内孔に入り込み、時間経過と共にアルコールは大気中に蒸発し、水は多孔質内部にトラップされる。この内孔に水をトラップさせる方法は、アルコールの力を借りなくても、多孔質部分に真空中あるいは希薄空気の中で放電を行うことによって内孔を一時的に水が着くようになる。これら水が内孔に入り込んだ状態で、その上から水を垂らし石英ガラス窓を被せ、193nmのArFレーザー光を照射すると露光部のみ親水性に改質される。この処理によって石英ガラス窓を被せた面（表面）と内孔内壁が親水性になる。この時点で試料の裏面は紫外光が照射されていない場合はフッ素樹脂本来の撥水性を呈する。さらに撥水性を付与する場合はフォンブリンオイル、パーフルオロポリエーテル、CBrF3、CClF3rCl などの-CF3基を有する溶液やガスの存在下で紫外線を照射して試料表面の末端原子を引き抜き、そこに撥水性を有する官能基を置換する。このようにして試料の裏面が撥水性、表面と内孔が親水性であるセル・チップができる。このセル・チップに細胞培養した後に、このセル・チップの親水性を呈する表側を病巣の患部に載せると、セル・チップと患部は接着される。そして内孔内部に培養されたドーパミン産生細胞から患部にドーパミンが滲み出る。他方セル・チップの撥水性を呈する裏側では水や蛋白質を排除するため雑菌や、他の細胞の侵入を防止することができる。これによって感染症を防止できる。

本願発明で用いるセル・チップ材料は、プラスッチクフィルムがフッ素樹脂、シリコーン樹脂、PET樹脂、ポリカーボネート樹脂、ポリプロプレン、ポリエチレン、ポリイミド、ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリカーボネートなどから成る多孔質あるいは繊維状プラスッチクフィルム。セル・チップ両面あるいは内孔に官能基を置換するために不可欠な水溶性薬品は、B(OH)3, Al(OH)3, Al2(SO4)3, Al(CH3COO)2OH, H2O, H2O2, NH4F, N2H4, NH4Cl, HCOOH, (BHNH)3, スルホン酸、オキソ化合物、アルデヒド化合物などの水溶液で、それらの雰囲気下で、波長150から350nmの範囲のKr、F2、ArF、KrCl、XeCl、XeFなどのエキシマレーザー、N2レーザーあるいはKrやXe2、KrCl、XeClエキシマランプ、D2、Hg-Xe、Hgランプ、非線形素子による高調波レーザーなどの紫外光を照射して、光化学的にその内孔の壁を親水性化し、その内壁に立体的にドーパミン産生細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、コラーゲン増産細胞、幹細胞、髄核細胞、インシュリン産生細胞などの細胞を着床させるものである。

本発明においてはフッ素樹脂やPETなど多孔質または繊維状プラスチックフィルムなどの3次元構造体内壁を親水性に改質したバイオセル・チップを、雑菌を防止するために滅菌する必要がある。この滅菌に於いて、試料に置換した官能基が消滅してはならない。一般にオートクレーブによる水蒸気滅菌では、多くのプラスチックが熱変形するため、試料に置換した官能基が物理的に消滅し、水との接触角が大きくなり、親水性が低減する。このためエチレンオキサイドガス滅菌処理が効果的である。しかしこのガスは酸化力が強いため、ガス濃度が高すぎたり、被曝時間が長過ぎては置換基の維持効果が激減する。

本発明に於いてはガス滅菌されたセル・チップをドーパミン産生細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、コラーゲン増産細胞、幹細胞、髄核細胞、インシュリン産生細胞などの細胞培養液に浸漬しする。これは細胞膜表面の糖鎖が突き出して出来る親水性層を意識して、セル・チップに動物細胞が合成して分泌するコラーゲン、フィブロネクチン、ラミン等の結合に関与していると考えられるOH基、NH₂基、COOH基などの官能基を置換するものである。

孔径約10ミクロン、厚さ300ミクロンの多孔質フッ素樹脂フィルムは水を通さ無かったが、フィルム裏面から30 mmHgの水圧をかけると表面に水が滲み出る。この表面に15 mJ/cm2のArFレーザー光を3000ショット照射し、-OH基を置換したところ、試料に水圧をかけなくとも内孔に水が浸透し、露光部のみ内部に水がトラップされて透明を呈するようになった。

孔径約10ミクロン、厚さ300ミクロンの多孔質フッ素樹脂フィルムは水を通さ無かったが、フィルム表面にエチルアルコールを垂らすと、多孔内部にアルコールが浸透した。これに水を垂らすと水も多孔内部にトラップされた。この状態で、室温下で約10分間放置するとアルコールのみ蒸発し、多孔質内孔に水がトラップされた。この現象を赤外線分光で観測した結果、エチルアルコールを浸透させた後、水を垂らした状態では試料表面は3030cm-1にアルコール特有の吸収帯が観測されたが、10分後その吸収ピークは消滅し、水のみの吸収帯が観測された。この状態で試料表面に水を垂らし、その上から石英ガラス窓を被せ、15 mJ/cm2のArFレーザー光を1000ショット照射し-OH基を置換したところ、試料に水圧をかけなくとも内孔に水が浸透し、露光部のみ内部に水がトラップされて透明を呈するようになった。

孔径約10ミクロン、厚さ300ミクロンの多孔質フッ素樹脂フィルムは水を通さ無かったが、約0.１mmHgの酸素雰囲気でプラズマ照射を5分間行ない底に水を垂らすと、多孔内部に水が浸入した。この状態で試料表面に水を垂らし、その上から石英ガラス窓を被せ、15 mJ/cm2のArFレーザー光を2000ショット照射し-OH基を置換したところ、試料に水圧をかけなくとも内孔に水が浸透し、露光部のみ内部に水がトラップされて透明を呈するようになった。

孔径約３ミクロン、厚さ200ミクロンの多孔質フッ素樹脂フィルムは300mmHgの水圧をかけなければ水を通さ無かったが、フィルム表面にエチルアルコールを垂らすと、多孔内部にアルコールが浸透した。これに水を垂らすと水も多孔内部にトラップされた。この状態で室温下で約10分間放置するとアルコールのみ蒸発し、多孔質内孔に水がトラップされた。その上から石英ガラス窓を被せ、15 mJ/cm2のArFレーザー光を1000ショット照射し-OH基を置換したところ、20mmHgの水圧で水が透過するようになった。さらにArFレーザー光のショット数を2000にしたところ、試料に水圧をかけなくとも内孔に水が浸透し、露光部のみ内部に水がトラップされて透明を呈するようになった。

孔径約３ミクロン、厚さ200ミクロンの多孔質フッ素樹脂フィルムは300mmHgの水圧をかけなければ水を通さ無かったが、フィルム表面にエチルアルコールを垂らすと、多孔内部にアルコールが浸透した。これに水を垂らすと水も多孔内部にトラップされた。この状態で室温下で約10分間放置するとアルコールのみ蒸発し、多孔質内孔に水がトラップされた。その上から石英ガラス窓を被せ、15 mJ/cm2のArFレーザー光を1000ショット照射し-OH基を置換したところ、20mmHgの水圧で水が透過するようになった。さらにArFレーザー光のショット数を2000にしたところ、試料に水圧をかけなくとも内孔に水が浸透し、露光部のみ内部に水がトラップされて透明を呈するようになった。この試料をアルブミン水溶液に、３０℃、４０時間浸漬後、生理食塩水でリンスし、真空乾燥した後、1650cm-1 のアルブミンを構成するアミノバンドの吸収強度を赤外線分光（FTIR）で測定したところ、レーザーのショット数が増加する事によって親水基の密度が増加するため、アルブミンの付着もそれに連れて増加した。

PMMAフィルムの水との接触角は80度である。この表面に水を垂らし、その上から石英ガラス窓を被せ、15 mJ/cm2のArFレーザー光を0から3000ショットまで増加させていくと、-OH基密度が増加して、水との接触角が小さくなり、20度になった。つぎに同じPMMA試料表面にパーフルオロポリエーテル溶液を垂らし、その上から石英ガラス窓を被せ、15 mJ/cm2のArFレーザー光を0から3000ショットまで増加させていくと、-CF3基密度が増加して、水との接触角が大きくなり、120度になった。これら水との接触角と細胞付着の関係を調べるために、各接触角を呈する試料表面に、蛋白質の一種のアルブミン溶液に一昼夜浸漬して付着した細胞の量を測定した結果、水との接触角が120度を呈した強撥水性表面には殆ど細胞が付着しないが、接触角が小さくなるに連れて細胞付着量が増加した。そして水との接触角が30度以下に成ると、細胞付着が急上昇することが明らかに成った。

PMMAフィルムの水との接触角は80度である。この試料全表面を疎水性にする為に、フッ素系オイル（パーフロロポリエーテル）の存在下でXe₂エキシマランプを10分間照射し、試料全面に-CFｎ基を置換し、水との接触角を120度とした。次に、その一部を親水性にするために、疎水性に改質されている試料全表面に、水を滴下し、合成石英ガラスを被せ、水の薄液層を形成させる。この状態で、パターンマスクを通してレーザーエネルギー密度5 mJ/cm²、3000shotのArFエキシマレーザー光を投影露光する。この投影露光によって水および試料表面が光励起され、水の光分解によって生成した水素原子により、脱水素反応を起こし、未結合になった炭素原子に、水の光分解により生じたもう一方の分解物-OHを置換し、水との接触角が20度に成った。これにより、試料表面に撥水性部と親水性部ができた。この試料をエチレンオキサイドガス滅菌の後、線維芽細胞溶液下で細胞培養した結果、撥水性部には細胞が付着せず、親水性部には細胞の集族が走査電顕写真から確認された。

繊維状PET布の水との接触角は85度である。このPET 糸表面に-OH 基を置換させるために水を垂らし、その上から石英ガラス窓を被せ、15 mJ/cm2のArFレーザー光を1000ショット照射し-OH基を置換した。他方、-NH₂基を置換するためにアンモニアガス雰囲気で、PET表面にArFエキシマレーザー光を照射した。この処理によって、水(H₂O)あるいはアンモニア(NH₃)ガスが光化学分解され-OH基、および-NH₂基が生成される。それと同時にPET表面のC-H結合が切断され、Cの未結合手に-OH基および-NH₂基が置換される。改質した試料の蛋白質接着強度を測定する為に、コラーゲンの付着力を調べるために、膠による接着強度を測定したその結果、親水基の置換密度の増加と共に接着強度が増加し、未処理に比べ-OH 基を置換した試料では21倍、-NH₂基を置換した試料では8倍になった。

繊維状PET布の水との接触角は85度である。このPET 糸表面に-OH 基を置換させるために水を垂らし、その上から石英ガラス窓を被せ、8 mJ/cm2のArFレーザー光を1000ショット照射し-OH基を置換した。他方、-NH₂ 基を置換させるためにアンモニア水溶液を垂らし、その上から石英ガラス窓を被せ、23 mJ/cm2のArFを照射した。この処理によって、水あるいはアンモニア水溶液が光化学分解され-OH基、および-NH₂基が生成される。それと同時にPET表面のC-H結合が切断され、Cの未結合手に-OH基および-NH₂基が置換される。これら２種類の改質した試料を兎背部皮下に移植して２週間経過後、切開手術を施し、サンプルを取り出したところ、親水性に改質した部分に対応する組織表面に組織接着の初期指標である白血球の集族を走査電子顕微鏡で観察した。

内孔および表面に-OH基を置換した、孔径約10ミクロン、厚さ300ミクロンの多孔質フッ素樹脂フィルムをエチレンオキサイドガスで滅菌処理した後、その改質面の生理食塩水やグルコース水との接触角を指標とし、その面を培地としてPC−12細胞による培養を行い、その増殖過程をストリークカメラ内臓の蛍光分析を行った。この結果、15 mJ/cm2のArFレーザー光を1000ショット照射し-OH基を置換した試料よりも、2000ショット照射した方が細胞増殖率が高いことが明らかに成った。

本願発明によれば、多孔質フッ素樹脂内孔壁を紫外線の光化学反応によって、露光部のみ親水性化して細胞培養の足場を作り、宇宙での細胞培養では無く、地上で「3次元培養」を行うものである。さらに本願発明による細胞は3次元構造体であるにもかかわらず、その周囲が繊維によるマトリクスで保護されているため、手術による移植過程に於ける細胞の物理的損傷を軽減し、繊細な神経細胞を保護する事が出来る。

本願発明によるセル・チップにドーパミン産生細胞を培養すれば、セル・チップが布状であるためパーキンソン患者の患部（線条体）に着床が容易である。このようにセル・チップが多孔体であるため、移植手術中にセル・チップ表面で細胞欠損が生じても、多孔質内部には細胞が存在するため、手術の成功率は高く、ドーパミン産生細胞のみならず、線維芽細胞、骨芽細胞、コラーゲン増産細胞、幹細胞、髄核細胞、インシュリン産生細胞などの培養が出来、再生医学に貢献できる細胞培養素子を生産することができる。

Claims

細胞培養に先立ち、多孔質あるいは繊維状プラスッチクフィルム内孔および表面にプラズマ処理を施した後、あるいはそのままで、薬品雰囲気で紫外光を照射して、光化学的にその内孔および表面を親水性化し、あるいは表面のみを撥水性化し、その内孔に立体的に細胞を着床させる事を特徴とする3次元細胞培養素子の製作方法。
多孔質あるいは繊維状プラスッチクフィルムがフッ素樹脂、シリコーン樹脂、PET樹脂、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート樹脂、ポリプロプレン、ポリエチレン、ポリイミド、ナイロン、ポリ塩化ビニル、ポリビニルアルコール、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなどであることを特徴とする請求項1記載の3次元細胞培養素子の製造方法。
前記プラズマ処理が酸素雰囲気あるいは不活性ガス雰囲気の高周波あるいは直流放電プラズマ、グロー放電、スパッタリング、イオン、軟X線などである事を特徴とする請求項１に記載の3次元細胞培養素子の製造方法。
薬品を構成する分子の一方がB、Al、H、F、Cl、他方が親水性に改質する場合は-OH、-NH2、-COOH、-CO、-SO3H、撥水性に改質する場合は -CH3、-C2H5、-CF3であることを特徴とする請求項1記載の3次元細胞培養素子の製造方法。
紫外光が150から350nmの範囲のKr、F2、ArF、KrCl、XeCl、XeFなどのエキシマレーザー、N2レーザーあるいはKrやXe2、KrCl、XeClエキシマランプ、D2、Hg-Xe、Hgランプ、非線形素子による高調波レーザーであることを特徴とする請求項１記載の3次元細胞培養素子の製造方法。
多孔質または繊維状プラスチック内壁に培養する細胞がドーパミン産生細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、コラーゲン増産細胞、幹細胞、髄核細胞、インシュリン産生細胞などであることを特徴とする請求項1記載の3次元細胞培養素子の製造方法。