WO2004052416A1 - マイクロ波照射による生体組織の処理方法 - Google Patents

Abstract

動物由来の生体組織からドナー細胞を除去または固定化する処理を効果的に達成する方法は、処理液中に浸漬した動物由来の生体組織に対し、０℃～４０℃の温度を維持しながらマイクロ波を照射することを含む。

Description

曰月 糸田 マイ ク口波照射による生体組織の処理方法

〔技術分野〕

本発明は、 再生医療、 すなわち正常に機能しない患者自身の器官 や組織に代って移植し、 正常な機能を回復させる医療技術の分野に 関する。 詳しく は、 動物由来の生体組織から細胞成分を取り去るか 、 または典型的にはグル夕ルァルデヒ ドである固定剤を用いて組織 を固定するこ とによつて移植用組織片を作成する方法に関する。 〔背景技術〕

生体組織をグル夕ルアルデヒ ドのような固定剤によつて化学処理 することによって、 あるいは生体組織から細胞成分を取り去ること によって移植用組織片が作成され、 広く臨床応用されている。 例え ば心臓弁置換術において、 異種生体弁はブタ心臓弁あるいはゥシ心 膜を免疫原性の低下のためにグルタルアルデヒ ドで固定化したもの である。 この異種生体弁は抗凝固性に優れてはいるが、 若年者では

5〜 1 0年程度の耐久性しかなく、 通常は 6 0歳以上の高齢者への 適用とされる。 欧米では 1 9 8 5年頃から、 我が国でも近年、 凍結 保存による組織バンクが整備されたことで、 死体から提供された凍 結保存同種弁が臨床で使用されつつある。 この同種弁は機械弁に比 ベて抗血栓性で、 異種生体弁に比べて耐久性で、 そして抗感染性で 優れているとされる。 しかしながら、 提供数が絶対的に不足してい るのが大きな問題である。 また、 若年者では比較的早期に機能不全 を来す症例も報告されており、 免疫反応の関与が強く示唆されてい る。 若年者に有効とされる R o s s手術では、 自己肺動脈弁を大動 脈弁位に置換移植し、 欠損した肺動脈弁を凍結保存同種弁によつて 再建するが、 大動脈弁位に移植された自己肺動脈弁は患者の成長と ともに増大するという特徴がある。 これに対して、 機械弁や異種生 体弁はもとよ り、 凍結保存同種弁でも成長性を有しないため、 小児 患者の場合では再移植となる場合が少なく ない。 最近、 これらの問 題を解決するために、 同種弁から ドナー由来細胞を除去することで 抗原性の減弱によつて免疫反応の関与を低下させることで、 耐久性 及び自己化を向上させる研究の報告がなされてきた。 米国 C r y 0 L i f e社は S y n e r G r a f t と称する薬液処理による細胞除 去方法を発表しており、 移植後数ケ月間で自己細胞が組織内に浸潤 し、 自己組織化すると報告している。 また、 ドイツ . ハノーバー医 科大学の H a V e r i c hらのグループは、 界面活性剤である T r i r ο η X - 1 0 0やタンパク分解酵素である ト リブシン溶液を細 胞除去に用いている。 しかしながら、 従来の界面活性剤あるいは薬 液のみによる洗浄工程だけでは、 組織片内部の細胞成分および細菌 やウイルスの除去は薬液の表面からの拡散および浸透によるため、 十分ではない。 また、 このような制約のため、 大型の組織片の処理 については完全な細胞除去や細菌、 ゥィルス除去が困難であつた。 また、 化学処理による場合では、 十分な効果を得るためには処理の 度合いを高める必要があり、 それによつて埋入後の石灰化や処理試 薬の除去などの問題が生じる。 さ らに、 硬膜移植における B S Ε及 び C J Dの感染で明らかとなつたように、 移植組織の安全性確保は 極めて重要であるが、 現在の化学薬液処理においては、 組織内のゥ ィルスを完全に不活化できるとの保証が得られていない。 また、 処 理過程における汚染によって、 移植用組織からの感染事故も しばし ば発生している。

また、 細胞成分を取り去った異種または同種の移植用組織片は、 これに患者自身の細胞を播種し、 細胞片内で自家細胞を増殖させ、 ハィブリ ッ ド再生組織と して移植するためにも利用される。

〔発明の開示〕

本発明の目的は、 上記のような従来技術の問題点を改善すること にある。 すなわち、 まず第 1 に、 薬液処理では達成できない大型組 織内部の細胞成分および細胞やウイルスの除去を達成すること、 第

2 に、 処理組織の生体力学特性を損なう ことなく処理を行う こと、 第 3 に、 簡便かつ短時間に処理を行う ことである。

本発明は、 処理液中に浸漬した動物由来の生体組織に対し、 0 °C 〜 4 0 °Cの温度を維持しながらマイ ク口波を照射することを特徴と する生体組織の処理方法を提供する。

〔図面の簡単な説明〕

図 1 本発明を実施するための装置の一例を示す概略図。

図 2 ブタ心臓弁組織の組織断面写真。 左が従来法による処理、 右 がマイ ク口波照射を併用した本発明による処理を示す。 従来の処理 では組織深部 （写真の左下） 内では細胞核の残存が認められる。 図 3 ト リ ト ン X - 1 0 0 にて細胞除去したブ夕心臓弁からの ト リ ト ン X— 1 0 0 の除去効率を示すグラフ。 マイ ク口波照射による本 発明方法では従来法の約 1 0分の 1 の時間でト リ ト ン X— 1 0 0 を 除去することが可能であつた。

〔発明を実施するための最良の形態〕

本発明の方法は、 生体組織から細胞成分を除去し、 移植用組織片 を作成する処理に適用することができる。 この場合は、 処理液と し て水、 高張液、 低張液、 界面活性剤溶液、 酵素液、 媒地、 または少 割合の有機溶媒を含んでいるこれらの液体が使用される。

本発明の方法を組織を固定し、 移植用組織片を作成する処理に適 用する場合は、 グルタルアルデヒ ドのような化学的固定剤の溶液を 使用する。

いずれの処理においても、 マイ クロ波を照射しない従来の方法で は、 処理液は試料表面からの拡散および浸透によつて全体に行きわ たるので、 長時間の処理が必要であり、 この間に試料の汚染等の危 険もあった。 マイ ク口波の照射は処理液が組織深部まで浸透に要す る時間をこれまでの約 1 0分の 1 に短縮することができるので、 処 理の効率を大幅に高めるこ とができ、 その間の試料の汚染等を防止 することができる。 また、 組織から細胞を除去して移植片を作成す る場合、 これまでの方法では不可能ないし困難であった組織深部か らの細胞核の除去を短時間で達成することが可能になる。

マイ クロ波処理は病理組織学分野において、 組織の固定、 骨の脱 灰、 脱脂、 免疫組織化学等に応用されている。 しかしながら、 マイ ク口波照射を移植用組織片の作成に適用した事例はない。 本発明の 新しい生物由来組織の処理法においては、 マイ ク口波を透過するガ ラスあるいはプラスチッ ク製の試料容器内に処理試料を入れ、 細胞 除去処理においては界面活性剤や低調液、 高調液などの処理液を、 細胞固定処理においてはグルタルアルデヒ ド等の化学固定液を、 試 料が完全に漬かるよう注ぐ。 処理試料の温度を 0 〜 4 0 °C内にコン トロールしながらマイ クロ波を照射するが、 一般にマイ クロ波を照 射すると試料温度が上昇するため、 長時間マイ ク口波を照射するに は試料を冷却しなければならない。 これには、 例えば市販のマイ ク 口ウェーブ迅速試料処理装置の使用が有効である。 この装置を、 マ ィ ク口波を照射するための電子レンジオーブン内の試料容器周囲に 、 電子レンジ外部の冷却装置によつて冷却された不凍液を循環させ るように改造して用いる。 試料容器内に温度センサを設置し、 冷却 装置及びマイ ク口波照射時間を間欠的に制御するこ とで、 マイ クロ 波照射時における試料温度を 0 〜 4 0 °Cにコ ン トロールすることが 可能である。 病理組織学分野と異なり、 移植用生体組織の場合は、 生体力学特性を変化させないために、 構成マ ト リ ッ クスの変性を防 ぐ必要があり、 マイ クロ波照射時において温度が氷点以下や 4 0 °C 以上になることを避けなければならない。

図 1 は、 本発明を実施するための装置の一例を示す概略図である 。 装置は、 マグネ トロン 1 2 を備えた電子レンジオーブン 1 よ りな る。 オーブン内部には、 冷却用不凍液 2 1 を収容した冷却槽 2が設 置されており、 冷却槽 2 のほぼ中央に試料容器 3が置かれる。 試料 容器 3 は処理液で満たされ、 その中に試料すなわち処理しょう とす る生体組織 4が浸漬される。 冷却槽 および試料容器 3 はガラスや プラスチッ ク例えばポリプロピレン、 ポリスチレン等のマイ クロ波 を透過する材質でつく られる。 先に述べたようにマイ ク口波の照射 は処理液 3 1従って試料 4 を加熱し、 試料の構成マ ト リ ッ クスを不 可逆的に熱変性させるので、 冷却槽 2内の冷却液 3 1 をオーブン 1 の外に設置した冷却装置 7 と冷却槽 1 の間を導管 5 , 6 を通って循 環させる必要がある。 そのため冷却槽 2 1 で暖められた冷却液 2 1 は導管 6 を通って冷却装置の熱交換器 7 2へ返還され、 再び冷却さ れた後導管 5 を通つて冷却槽 1 1 へポンプ 7 1 によって戻される。 槽 2 1 内の冷却液の温度をセンサー 1 1 によつて感知し、 該温度が 0 °C〜 4 0 ΐの範囲内の一定温度例えば 2 0 °Cに維持されるように 、 コ ン ト ローラー 1 3 によってマグネ ト ロン 1 2 の作動時間を間歇 的かつ自動的に制御する。 マイ ク口波を均等に照射するために攪拌 ファンその他の手段を設置すること もできる。

本発明方法は、 組織から細胞成分を除去するための既知の方法と 組合せて使用することもできる。 例えば界面活性剤や酵素を使用し て組織内の細胞を除去する前処理を行つた後、 組織片に残っている 薬液を除去する洗浄をマイ ク口波照射下に行う ことができる。

本発明方法の利用分野または用途は、

1 ) 移植用動物由来軟組織

例 ： 脳死あるいは心臓死ドナーからの移植用軟組織処理、 も しく はブタ、 ゥシ等の異種動物からの移植用軟組織処理から細胞成分を 除去する洗浄処理工程の効率を飛躍的に高めることができる。 また 、 抗原性原因物質の大幅な減少が達成できる。

2 ) 移植用動物由来硬組織

例 ： 上記と同様に、 骨 · 軟骨 · 歯などの硬組織処理を行う ことが できる。

3 ) 医療用生物組織の処理

例 ： 動物および植物由来組織のうち、 細胞を含んだものについて の細胞破壊処理に用いることができる。

実施例

1 . 食用ブタ繁殖場からブタ心臓を購入し、 4 °Cにて搬送した。 心 臓摘出時における温阻血時間は 2 0分以内と した。 肺動脈弁、 血管 を摘出し、 ハンクス液で洗浄した。 界面活性剤である ト リ ト ン X _ 1 0 0 の 1 %水溶液に試料を浸漬し、 図 1 に概略図で示した装置に て 2 0 °Cでマイ ク口波を 4 8時間間欠的に照射し、 ドナ一細胞を除 去した。 処理後、 リ ン酸緩衝生理食塩水にて洗浄除去した。 処理標 本の組織断面を H E染色によ り光顕観察することで、 組織学的に評 価した。 その結果、 ブタ肺動脈弁葉組織では、 図 2 に示すようにマ ィ ク口波照射を併用すると、 併用しない場合と比較してよ り組織深 部まで細胞を除去することができた。

2 . 同様に食用ブタ繁殖場から購入したブタ心臓弁を、 界面活性剤 である ト リ ト ン X — 1 0 0 の 1 %水溶液中に 1 時間浸漬すること で細胞除去した。 その後、 リ ン酸緩衝生理食塩水に浸漬し、 1 0 °C 下にてマイ ク口波処理を間欠的に 4 8時間照射した。 その結果、 図 3 に示すように、 マイ ク口波を照射しない従来法では細胞毒性を示 すト リ ト ン X— 1 0 0溶液を除去するために 3週間程度必要であつ たのが、 マイ ク口波を照射することで数日間と大幅な処理時間の短 縮が可能であつた。

Claims

言青 求 の 範 囲

1 . 処理液中に浸漬した動物由来の生体組織に対し、 0 °C〜 4 0 °Cの温度を維持しながらマイ クロ波を照射することを特徴とする生 体組織の処理方法。

2 . 前記処理は、 生体組織から細胞成分を除去するための処理で あり、 処理液は水、 高張液、 低張液、 界面活性剤溶液、 酵素液、 媒 地、 または少割合の有機溶媒を含んでいるこれらの液体である請求 項 1 の方法。

3 . 前記処理は、 生体組織を固定するための化学処理であり、 処 理液はグルタルアルデヒ ドを含む薬液である請求項 1 の方法。

4 . 前記マイ ク口波照射は、 周波数 1 4 5 0 M H zにおいて正味 照射時間と して 1 時間ないし 1週間行われる請求項 1 ないし 3のい ずれかの方法。

5 . 処理される生体組織は、 血管、 心臓弁膜、 心膜、 角膜、 羊膜 、 および硬膜を含む軟組織である請求項 1 ないし 4のいずれかの方 法。

6 . 処理される生体組織は、 骨、 軟骨、 および歯を含む軟または 硬組織である請求項 1 ないし 4のいずれかの方法。

7 . 処理される生体組織は、 心臓、 腎臓、 肝臓、 膝臓、 および脳 を含む臓器も しく はその一部である請求項 1 ないし 4のいずれかの 方法。

8 . マイ ク口波照射後、 新鮮な洗浄液を用いて破壊された ドナー 細胞を組織から洗浄除去する工程を含む請求項 2 の方法。

9 . 処理される生体組織は、 ドナー細胞の除去を容易にする前処 理を受けている請求項 の方法。