JP2011041716A

JP2011041716A - 生体組織の処理方法

Info

Publication number: JP2011041716A
Application number: JP2009192608A
Authority: JP
Inventors: Azhim Azran; アズラン・アズヒム; Masato Tanaka; 眞人田中; Kazuaki Muramatsu; 和明村松; Susumu Minezaki; 進峰嵜; Osamu Endo; 修遠藤
Original assignee: CELL REMOVER KK; Tokyo Denki University
Current assignee: CELL REMOVER KK; Tokyo Denki University
Priority date: 2009-08-21
Filing date: 2009-08-21
Publication date: 2011-03-03

Abstract

【課題】正常に機能しない患者自身の器官や組織に代わって移植し、正常な機能を回復させる再生医療技術および多様な細胞の成長分化を観察するための三次元的足場としての研究材料技術の分野における生体組織の処理方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る生体組織の処理方法は、動物由来の生体組織である血管、心臓弁膜、芯膜、角膜、羊膜及び硬膜を含む軟組織、骨、軟骨及び歯を含む硬組織、心臓、腎臓、肝臓、膵臓及び脳を含む臓器もしくはその一部を、界面活性剤を含んでいる処理液に浸漬し、これらに対し、０°Ｃ〜４０°Ｃの温度を維持しながら周波数２０〜１００ｋＨｚの超音波を、正味照射時間として１時間ないし２４時間照射し、これにより破壊したドナー細胞を前記生体組織から洗浄液を用いて洗浄除去することを特徴とし、超音波照射により処理して移植用組織片を作成する。
【選択図】図１

Description

本発明は、正常に機能しない患者自身の器官や組織に代わって移植し、正常な機能を回復させる再生医療技術および多様な細胞の成長分化を観察するための三次元的足場としての研究材料技術の分野において、動物由来の生体組織から細胞成分を除去するか、または典型的にはグルタルアルデヒドである固定剤を用いて組織を処理することによって移植用組織片を作成する生体組織の処理方法に関するものである。

これまで、生体組織を化学的に固定化し、或いは細胞成分を取り去ることにより移植用組織が作成され、臨床応用されてきている。たとえば心臓弁置換術の異種生体弁は、ウシ心膜をグルタルアルデヒドで固定化したものであり、抗凝固性に優れるとされているが、耐久性に乏しく、通常は高齢者への適用とされるものである。また、近年、整備されつつある組織バンクでは、死体から提供された凍結保存同種弁が臨床で使用され、抗血栓性、耐久性及び抗感染性に優れるとされるが、その提供数が常に絶対的に不足しているという大問題を残している。さらに、一般的なＲｏｓｓ手術では、自己肺動脈弁を大動脈弁位に置換移植し、欠損した肺動脈弁を機械弁、異種生体弁あるいは凍結保存同種弁によって再建するが、大動脈弁位に移植された自己肺動脈弁は患者の成長と共に増大するのに対して肺動脈弁の機械弁や異種生体弁はもとより凍結保存同種弁でも成長する患者の場合では最移植となる例が少なくない。最近、同種弁からドナー由来細胞を除去することで抗原性の減弱によって免疫反応の関与を低下させることで、耐久性及び自己化を向上させる研究報告がなされてきた。これらの細胞除去は界面活性剤などにより処理されるが、組織片内部の細胞成分および細菌やウィルスの除去は困難である。

異種または同種の細胞成分を取り除いた移植用組織片に、患者自身の細胞を播種し、細胞片内で自家細胞を増殖させて、移植用の再生組織として利用される。このような再生組織へのアプローチも進められており、早稲田大学のグループによるマイクロ波照射と処理液の拍動還流を組み合わせた技術によりＨＥ染色像でのより高度な脱細胞処理を実現し、その組織劣化は極めて低く保たれていると報告されている（「人工臓器」３３巻３号、２００４年）。この組織片にレシピエントの細胞が播種され、ハイブリッド再生組織が準備されるに至るが、その工程の再現性や比較的複雑な組織（平滑筋細胞や線維芽細胞層の多い組織）での実績の報告はされていない。

本発明は、上記の従来の問題点を解決することにある。すなわち、まず、第１に薬液処理では解決できない大型あるいは比較的複雑な組織内部の細胞成分および細胞やウィルスを除去すること、第２に生体力学特性を損わずに組織を処理すること、第３に生体組織を簡便かつ短時間に処理することを目的としている。

上記の各目的を達成するため、本発明に係る生体組織の処理方法は、動物由来の生体組織である血管、心臓弁膜、芯膜、角膜、羊膜及び硬膜を含む軟組織、骨、軟骨及び歯を含む硬組織、心臓、腎臓、肝臓、膵臓及び脳を含む臓器もしくはその一部を、界面活性剤を含んでいる処理液に浸漬し、これらに対し、０°Ｃ〜４０°Ｃの温度を維持しながら周波数２０〜１００ｋＨｚの超音波を、正味照射時間として１時間ないし２４時間照射し、これにより破壊したドナー細胞を前記生体組織から洗浄液を用いて洗浄除去することを特徴とし、超音波照射により組織内部の細胞成分および細胞やウィルスの除去を生体力学特性を損わずに簡便かつ短時間に処理できるように構成した。

また、請求項２の発明に係る生体組織の処理方法は、処理された生体組織は、ドナー細胞の除去を容易にする前処理を受けていることを特徴とし、生体組織から細胞成分の除去を、既知の方法と組合わせて使用できるように構成した。

本発明によれば、処理液中に浸漬した動物由来の生体組織に対し、０°Ｃ〜４０°Ｃの温度を維持しながら超音波を照射することにより薬液処理では達成できない大型組織内部の細胞成分および細胞ウィルスの除去を達成でき、しかも、処理組織の生体力学特性を損なうことなく生体組織から細胞成分を除去し、移植用組織片を作成する処理に適用することができる。また、超音波の照射には、主に界面活性剤を含んでいる処理液を組織深部まで浸透させることになるので、処理時間を１時間半程度まで簡単に短縮することができ、予想される試料の微生物による汚染や組織内に残存する酵素による自己消化を抑止することができる。換言すれば、組織から細胞を除去して移植片を作成する場合、これまでの方法では不可能ないし困難であった組織深部からの細胞核の除去を短時間で達成することが可能になるという優れた効果を奏するものである。

次に、本発明の最良の形態を図面に基いて説明する。図１は本発明を実施するための装置の一例を示す概略図、図２は牛腱間充組織の組織断面写真であって、（ａ）は従来法による処理断面写真、（ｂ）は超音波照射を併用による処理断面写真、図３はデオキシコール酸および超音波処理によるブタ頸静脈の細胞の残存率を示すグラフである。

図１において、１は超音波装置のプローブ、２は発振機、３は水槽である。水槽３内には試料固定用のアダプター４がほぼ中央部に設置されている。また、水槽３内には処理液（図示せず）が満たされ、その中に試料、すなわち処理しようとする生体組織（破線で示す）５が浸漬されている。

前記超音波装置のプローブ１によって水槽３内において加熱された処理液は、冷却装置６に連繋した冷却コイル７によって冷却される。前記水槽内３の処理液の温度は、温度センサー８によって感知され、当該温度が０°Ｃ〜４０°Ｃの範囲内の特定温度（例えば、３５°Ｃ）に維持されるようにコントローラ９によって制御される。この制御は、冷却装置６の作動時間を間歇的かつ自動的にコントロールすることにより行われる。

前記超音波装置のプローブ１からの超音波は、周波数２０〜１００ｋＨｚで、正味の照射時間として１時間乃至２４時間照射することによりドナー細胞を破壊し、洗浄液を用いて洗浄除去する。この洗浄液は新鮮なものがよい。また、前記超音波を均等に照射するために３次元アクチュエータ（図示せず）を水槽３の下に設置しておくこともできる。

前記処理液中に浸漬した動物由来の生体組織としては、血管、心臓弁膜、芯膜、角膜、羊膜及び硬膜を含む軟組織と、骨、軟骨及び歯を含む硬組織と、心臓、腎臓、肝臓、膵臓及び脳を含む臓器もしくはその一部である。

前記動物由来の生体組織から細胞成分を除去し、移植用組織片を作成する処理に適用する処理液としては、水、高張液、低張液、界面活性剤溶液、酸素液、培地、または少割合の有機溶媒を含んでいる液体が使用される。また、組織を固定し、移植用組織片を作成する処理に適用する場合は、グルタルアルデヒドのような化学的固定剤の溶液を使用することも可能である。

上記いずれの処理においても、超音波を照射しない従来の方法では、処理液は試料表面からの拡散及び浸透によつて全体に行きわたるので、長時間の処理が必要であり、この間に試料の汚染等の危険もあった。超音波の照射は処理液を組織深部まで浸透させることになるので、処理時間を１時間半程度まで簡単に短縮することができる。従来法の４８時間と較べると３２倍の効率の上昇となる。その間に予想される試料の微生物による汚染や組織内に残存する酵素による自己消化を抑止することができる。また、組織から細胞を除去して移植片を作成する場合、これまでの方法では不可能ないし困難であった組織深部からの細胞核の除去を短時間で達成することが可能になる。

前記超音波処理は生化学・細胞生物学分野において、細胞の破壊、ＤＮＡ鎖の切断、細胞内器官の単離、生体膜断片の断片化など、さまざまな生体物質の均一化に応用されている。しかしながら、今までに超音波照射を移植用組織片の作成に適用した事例はない。本発明の生物由来組織の新しい処理法においては、超音波を透過しないガラスあるいはプラスチック製の試料容器内に処理試料を入れ、細胞除去処理においては界面活性剤や低張液や高張液などの処理液を、細胞固定処理においてはグルタルアルデヒド等の化学固定液を試料が完全に漬かるよう注ぐようにしている。

処理試料の温度を０°Ｃ〜４０°Ｃ内にコントロールしながら超音波を照射するが、一般に超音波を照射すると超音波発生装置、特に、プローブ及び処理液の温度が上昇するため、長時間、超音波を照射するには、超音波発生装置とともに処理液を介して試料も冷却しなければならない。病理組織学分野と異なり、移植用生体組織の場合は、生体力学特性を変化させないために、構成マトリックスの変性を防ぐ必要があり、超音波照射時において温度が、氷点未満や４０°Ｃ以上になることを避けねばならないし、処理する試料によって適当な周波数とエネルギーの超音波を照射する必要がある。

前記ドナー細胞の洗浄除去前には、界面活性剤または酵素を使用して組織内の細胞を除去する前処理を超音波照射下において行うことがよい。すなわち、超音波装置のプローブ１からの超音波には、生体組織から細胞成分を除去するための既知の方法と組合わせて使用することもできる。

超音波装置のプローブ１からの超音波は、
１）移植用動物由来軟組織
たとえば、脳死あるいは心臓死ドナーからの移植用軟組織処理、もしくはブタ、ウシ等の異種動物からの移植用軟組織処理から細胞成分を除去する洗浄処理工程の効率を飛躍的に高めることができる。また、抗原性原因物質の大幅な減少が達成できる。
２）移植用動物由来硬組織
たとえば、上記と同様に、骨・軟骨・歯などの硬組織処理を行うことができる。
３）医療用生物組織の処理
たとえば、動物および植物由来組織のうち、細胞を含んだものについての細胞破壊処理に用いることができる。

食肉加工場から牛腱を購入し、４°Ｃにて搬送した。腱の組織に沿って約１０ｍｍ角、長さ１００ｍｍに切り出し、リン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄した。界面活性剤である１％デオキシコール酸または１％トリトンＸ−１００などを含む緩衝液に試料を浸漬し、図１において概略図で示した装置にて４°Ｃまたは２０°Ｃで超音波を９０分間、間欠的に照射し、ドナー細胞を除去した。処理後、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄除去した。処理標本の組織断面をＨＥ染色により光学顕微鏡観察することで組織学的に評価した。その結果、繊維間に存在する間充組織では、図２（ｂ）に示すように、超音波照射を併用した処理の場合には、同図（ａ）の如く超音波照射を併用しない場合と比較してより組織深部まで細胞を除去することができた。なお、同図（ａ）中に表示されている黒い点状のものが残存細胞の核である。

食用ブタ繁殖場からブタ頸静脈を購入し、４°Ｃにて搬送した。頸静脈をリン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄した後、上記と同様に界面活性剤である１％デオキシコール酸または１％トリトンＸ−１００などを含む緩衝液に試料を浸漬し、図１において概略図で示した装置にて４°Ｃまたは２０°Ｃで超音波を５分間、間欠的に照射し、ドナー細胞を除去した。処理後、リン酸緩衝生理食塩水にて洗浄除去した。洗浄時にも超音波処理することで効率的に洗浄を実施できた。処理標本の組織断面をＨＥ染色により光学顕微鏡観察することで組織学的に評価した。その結果、ブタ頸静脈の組織では、図３に示すように、超音波照射を併用した場合には、併用しない場合と比較してより組織深部まで細胞を除去することが確認できた。換言すれば、図３のグラフにおいて、脱細胞化前と脱細胞化後の細胞の残存率の差を見ることにより判る。

実施例２と同様のサンプルをリン酸緩衝化生理的食塩水で洗浄し、界面活性剤である１％デオキシコール酸または１％トリトンＸ−１００などを含む緩衝液に浸漬し、４°Ｃまたは２０°Ｃで超音波を５分間、間欠的に照射し、破壊したドナー細胞を除去するまでに数日間で済み、超音波照射を行わない場合と比較して大幅な処理時間の短縮が可能であった。

本願処理方法は、正常に機能しない患者自身の器官や組織に代わって移植し、正常な機能を回復させる再生医療技術および多様な細胞の成長分化を観察するための三次元的足場としての研究材料技術の分野において有効であり、所定の生体組織に存在する原細胞の除去を効率的に行うことができ、医療の現場での利用性、すなわち、産業上の利用可能性は極めて高いものである。

本発明を実施するための装置の一例を示す概略図である。牛腱間充組織の組織断面写真であって、（ａ）は従来法による処理断面写真、（ｂ）は超音波照射を併用による処理断面写真である。デオキシコール酸および超音波処理によるブタ頸静脈の細胞の残存率を示すグラフである。

１超音波装置のプローブ
２発振機
３水槽
４試料固定用のアダプター
５生体組織
６冷却装置
７冷却コイル
８温度センサー
９コントローラ

Claims

動物由来の生体組織である血管、心臓弁膜、芯膜、角膜、羊膜及び硬膜を含む軟組織、骨、軟骨及び歯を含む硬組織、心臓、腎臓、肝臓、膵臓及び脳を含む臓器もしくはその一部を、界面活性剤を含んでいる処理液に浸漬し、これらに対し、０°Ｃ〜４０°Ｃの温度を維持しながら周波数２０〜１００ｋＨｚの超音波を、正味照射時間として１時間ないし２４時間照射し、これにより破壊したドナー細胞を前記生体組織から洗浄液を用いて洗浄除去することを特徴とする生体組織の処理方法。
処理された生体組織は、ドナー細胞の除去を容易にする前処理を受けていることを特徴とする請求項１に記載の生体組織の処理方法。