CN106822997A - 一种去抗原骨支架材料的制备方法 - Google Patents

一种去抗原骨支架材料的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种去抗原骨支架材料的制备方法，所述方法为：取动物松质骨预处理后浸入去离子水中，超声浸泡8～12小时；取出松质骨浸入胰酶，37℃浸泡3～6小时；清洗，甩干；将松质骨浸入体积比1:1甲醇/氯仿溶液中，室温浸泡24～48小时；清洗，甩干；将松质骨浸入质量浓度10～20％H2O2水溶液中，室温浸泡6～12小时；清洗，冻干、灭菌，得到去抗原骨支架材料。利用本发明方法制备的去抗原骨支架材料具有良好的机械性能和适合细胞生长的孔径，DNA残留量低、去抗原性优良，较好的保留了胶原成分，且具有良好的细胞相容性，适用于骨组织工程的研究和应用，以及作为临床治疗中的骨损伤修复材料。

Description

一种去抗原骨支架材料的制备方法
(一)技术领域
本发明涉及用于骨损伤修复的支架材料制备方法，特别涉及一种去抗原骨支架材料的制备方法。
(二)背景技术
骨缺损治疗是骨科面临的难题之一，其疗效以自体骨移植为佳，但骨源不足严重制约了其临床应用，因此寻找理想的替代材料一直是骨组织工程研究领域的重点。研究表明，适用于骨修复的支架材料应具备有一定的机械强度、良好的生物相容性、合适的孔径大小以及合适的降解率等特点。目前常用的骨支架材料包括：骨水泥、聚合材料(如PLGA、钛合金等)等，但都多少存在细胞相容性差以及因降解造成局部炎症等问题。动物骨来源的异种骨修复材料是目前临床和科研中另一种常用的支架材料，如临床上使用的小牛骨来源的异种骨，其修复效果目前已被广泛接受。但异种骨仍存在一定的免疫排异源性等问题，因此制备一种以动物骨为原料，去抗原性、生物相容性良好，可促进受体骨组织生长愈合的生物型骨修复材料，在骨损伤修复中具有重要的临床意义。
(三)发明内容
本发明的目的是提供一种去抗原骨支架材料的制备方法。本发明所要解决的技术问题是异种骨修复材料的高免疫排异源性问题，从而提供一种去抗原骨支架材料的制备方法。
本发明采用的技术方案：
本发明提供一种去抗原骨支架材料制备方法，所述制备方法步骤如下：
(1)取动物松质骨，去离子水清洗去除附着组织，获得预处理后的松质骨；
(2)取步骤(1)预处理后的松质骨浸入去离子水中，超声浸泡8～12小时；
(3)将步骤(2)处理后的松质骨浸入胰酶溶液中，37℃浸泡3～6小时；清洗松质骨，甩干；所述胰酶溶液由生理盐水配制成2.5-5mg胰酶/ml生理盐水；
(4)重复步骤(2)-(3)，2～4次；
(5)将步骤(4)松质骨浸入体积比1:1甲醇/氯仿溶液中，室温(25℃)浸泡24～48小时；清洗松质骨，甩干；
(6)将步骤(5)得到的松质骨浸入质量浓度10～20％H2O2水溶液中，室温浸泡6～12小时；清洗，冻干(优选-50℃)、灭菌，得到去抗原骨支架材料。
进一步，步骤(1)中动物松质骨来源广泛，如猪、牛等大型哺乳动物。
进一步，步骤(2)所述预处理后的松质骨分割为0.5-2cm3的块，再浸入去离子水中进行超声处理。
进一步，步骤(2)所述超声功率为20-40KHZ。
进一步，所述步骤(3)中胰酶质量浓度为3.5mg/ml。
进一步，所述步骤(4)中重复次数为3次。
进一步，所述步骤(6)中H2O2质量浓度为15％。
进一步，步骤(6)所述灭菌是用钴60对去抗原骨支架材料进行照射灭菌，辐照剂量为18KGy。
本发明提供了一种去抗原骨支架材料的制备方法。利用本发明提供的方法制备所得松质骨支架材料，经检测具有适合细胞生长的孔径，脱细胞、DNA残留等去抗原效果好，较好的保留了胶原成分，有良好的细胞相容性，满足骨组织工程研究和应用中对骨修复材料的要求。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于，利用本发明方法制备的骨支架材料，DNA残留极低，仅为未处理骨组织的千分之二，极大的降低了支架材料的抗原性，现有技术中关于DNA残留的评估极少体现。同时本制备方法步骤简单、设备要求低、成本低廉，适合大规模工业化生产。因此本发明在医学领域具有较高的应用价值。
(四)附图说明
图1本发明制备的骨支架材料外观形态(A)和扫描电镜检测结果图(B)。
图2本发明制备的骨支架材料脱细胞检测HE染色图。
图3本发明制备的骨支架材料胶原保留检测Masson染色图。
图4本发明制备的骨支架材料细胞相容性检测。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：去抗原骨支架材料的制备
1、以猪的松质骨为原材料制备去抗原骨支架材料，具体制备步骤如下：
(1)用电动摆锯将猪松质骨切成0.5-2cm3的骨条，并用去离子水清洗去除附着的肌腱组织，处理完毕后放入-20℃冰箱冻存过夜；
(2)取出骨条，用去离子水冲洗解冻后浸入装有去离子水的容器中；将容器放入超声清洗仪超声处理8-12小时，至换水时去离子水无浑浊，同时容器内去离子水内无杂质颗粒(超声清洗仪功率设定为40KHZ)，期间每1h更换一次去离子水和超声用水，保证容器内水位不超过容器高度的3/4，温度控制在37℃-50℃之间；
(3)超声处理结束后加入3.5mg/ml胰酶生理盐水溶液，使用的胰酶溶液体积为骨条体积的5倍，37℃浸泡5小时，处理完毕取出骨条用去离子水洗净，甩干；
(4)重复步骤2-3，3次；
(5)骨条浸于体积比1:1甲醇/氯仿溶液中，室温浸泡36小时。处理完毕取出骨条用去离子水洗净，甩干；
(6)骨条置于质量浓度15％H2O2水溶液中，室温浸泡8小时。处理完毕取出骨条用去离子水充分清洗；
(7)将骨条-50℃冻干，辐照(18KGy)灭菌后，得到去抗原骨支架材料。
2、去抗原骨支架材料的鉴定
1)、外观形态和扫描电镜观察
对所得骨支架材料肉眼观察外观，拍照记录，见图1中A所示。然后用扫描电镜对形态结构进行进一步检测，见图1中B所示。如图1中A所示骨支架材料呈白色，表面与内部无其它颜色的杂质残留，外部呈网状结构，有较好的机械强度和弹性。扫描电镜结果如图1中B所示支架材料内壁光滑，呈多孔结构，孔径大小200-500μm，适合细胞生长。上述检测结果表明本发明制备的骨支架材料具有良好的物理特性和合适的孔径。
2)、去抗原效果检测
为验证本发明制备的骨支架材料的去抗原性，对所得支架材料的脱细胞效果和DNA残留进行了检测。脱细胞效果检测采用石蜡切片后进行HE染色的方法，如图2所示，骨支架材料中的残留细胞组织已基本去除完全，同时也较完整的保留了骨支架结构。利用组织DNA提取试剂盒(购自杭州新景生物试剂开发有限公司)提取并检测了骨支架材料DNA残留量，如表1所示，本发明制备的骨支架材料仅有极低的DNA残留，低于1.5ng/mg支架，约为未处理松质骨的千分之二。
表1DNA残留检测结果
3)、胶原保留检测
天然骨表面的胶原对骨细胞的黏附和生长起非常重要作用，因此胶原保留对支架材料生物学功能发挥十分重要。利用Masson染色方法检测胶原纤维，如图3，结果显示本发明制备的骨支架材料有丰富的胶原纤维保留。
4、细胞相容性检测
为验证本发明制备的骨支架材料是否具有良好的细胞相容性，将人成纤维细胞与去抗原骨支架材料进行复合培养，具体步骤如下：无菌条件下将消毒好的支架材料置于12孔培养板中，加入500μL IMDM培养液预湿12h，将培养液吸干弃去；将人成纤维细胞悬液浓度调整为1×106个/mL，将100μL细胞悬液于无菌超净台内缓慢滴加到支架材料上，放于二氧化碳培养箱内孵育；孵育2h后将12孔板取出，于无菌超净台内沿孔板壁向支架材料缓慢加入IMDM培养液(含10％胎牛血清)1mL，放入二氧化碳培养箱中培养；每隔两天取出孔板，换新鲜IMDM培养液(含10％胎牛血清)；第7d，将支架材料取出，2.5％戊二醛固定，扫描电子显微镜观察细胞在支架材料上的黏附和生长情况。检测结果如图4所示，材料内部孔隙中有大量细胞黏附和生长，无明显的排异反应，表明本发明制备的去抗原骨支架材料具有良好的细胞相容性。
结果表明，利用本发明方法制备的去抗原骨支架材料具有良好的机械性能和适合细胞生长的孔径，去抗原性优良，较好的保留了胶原成分，且具有良好的细胞相容性，适用于骨组织工程的研究和应用，以及作为临床治疗中的骨损伤修复材料。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种去抗原骨支架材料的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：为：
(1)取动物松质骨，去离子水清洗去除附着组织，获得预处理后的松质骨；
(2)取步骤(1)预处理后的松质骨浸入去离子水中，超声浸泡8～12小时；
(3)将步骤(2)处理后的松质骨浸入胰酶溶液中，37℃浸泡3～6小时；清洗松质骨，甩干；所述胰酶溶液由生理盐水配制成2.5-5mg胰酶/ml生理盐水；
(4)重复步骤(2)-(3)，2～4次；
(5)将步骤(4)松质骨浸入体积比1:1甲醇/氯仿溶液中，室温浸泡24～48小时；清洗松质骨，甩干；
(6)将步骤(5)得到的松质骨浸入质量浓度10～20％H2O2水溶液中，室温浸泡6～12小时；清洗，冻干、灭菌，得到去抗原骨支架材料。
2.如权利要求1所述去抗原骨支架材料的制备方法，其特征在于步骤(1)所述动物松质骨来源于猪或牛。
3.如权利要求1所述去抗原骨支架材料的制备方法，其特征在于步骤(2)所述预处理后的松质骨分割为0.5-2cm3的块，再浸入去离子水中进行超声处理。
4.如权利要求1所述去抗原骨支架材料的制备方法，其特征在于步骤(2)所述超声功率为20-40KHZ。
5.如权利要求1所述去抗原骨支架材料的制备方法，其特征在于所述步骤(3)中胰酶质量浓度为3.5mg胰酶/ml生理盐水。
6.如权利要求1所述去抗原骨支架材料的制备方法，其特征在于所述步骤(4)中重复次数为3次。
7.如权利要求1所述去抗原骨支架材料的制备方法，其特征在于所述步骤(6)中H2O2质量浓度为15％。
8.如权利要求1所述去抗原骨支架材料的制备方法，其特征在于步骤(6)所述灭菌是用钴60对去抗原骨支架材料进行照射灭菌，辐照剂量为18KGy。
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