CN113846045B - 一种可用于细胞培养的鱼鳞组织支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种可用于细胞培养的鱼鳞组织支架的制备方法，采用鱼鳞为原料，对鱼鳞分别进行脱细胞、一次脱钙、二次脱钙处理，75%酒精浸泡和紫外照射杀菌，吸附牛血清白蛋白后经京尼平固化处理得到三种鱼鳞支架材料，用于细胞的贴壁培养，本发明的鱼鳞细胞支架材料具有良好的细胞亲和性、引导细胞定向迁移生长的能力，有利于快速修复细胞缺损，提示本发明的鱼鳞支架在细胞培养和组织工程领域具有良好的应用前景。

Description

一种可用于细胞培养的鱼鳞组织支架的制备方法
技术领域
本发明属于组织工程领域的一种可用于细胞培养的鱼鳞组织支架的制备方法。
背景技术
中国作为淡水鱼大国，每年产生的大量鱼鳞废料，是一种价格低廉且易获得的生物资源。文献分析表明鱼鳞通常有两个不同的层：外层骨层由羟基磷灰石晶体组成，内层或底层由含有胶原纤维的胶合板结构组成，其结构及组分类似于骨细胞外基质。此外鱼鳞的主要组成成分，羟基磷灰石和Ⅰ型胶原纤维，成为生物资源领域的研究热点，两者都表现出良好的生物学特性。Ⅰ型胶原是细胞外基质的主要成分，具有组织器官的机械保护或细胞环境的生理调节等功能。鱼鳞的另一个主要成分是羟基磷灰石，具有独特的生物活性和稳定性，是骨组织工程中最重要的天然生物材料。
另一方面，鱼鳞表面分布着放射状鳞沟和环状磷脊结构类似于微米拓扑结构，先前研究表明细胞外基质的微纳米级拓扑结构是调节细胞黏附和胞内骨架组装的重要生物物理信号，因此，鱼鳞表面的拓扑结构可能影响细胞的粘附、增殖、和迁移等重要的细胞行为。另外，虽然用于体外研究的细胞培养基底多为水平二维刚性结构，但二维结构并不能实现细胞真实三维微环境的复杂性。然而鱼鳞的结构可以看作是含有羟基磷灰石和Ⅰ型胶原蛋白成分的二维基底材料与表面微米拓扑结构的结合，既可以一定程度模拟三维微环境，又可以保持二维结构操作的简便性。因此，他们天然的复合结构和组分具有成为细胞工程支架材料的潜能。
文献报道一些人工细胞支架材料对细胞亲和力不高且不能引导细胞生长。然而鱼鳞属于天然生物材料，具有良好的生物相容性和生物可降解性并且鱼鳞表面具有天然的纹路可以引导细胞沿着磷脊通道迁移，这种引导迁移活动可能有利于快速修复细胞缺损，促进受损组织或器官的修复。因此本发明旨在发明一种对细胞具有高亲和力并可引导细胞定向迁移生长的鱼鳞支架材料。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于细胞培养的鱼鳞组织支架的制备方法，生产一种具有良好生物相容性和生物可降解性并且可以引导细胞定向迁移生长的天然细胞支架材料，用于组织工程中诱导组织再生。
本发明采用鱼鳞为原料，以脆皖鱼鱼鳞为例，用细胞裂解液对鳞片进行脱细胞处理，避免发生免疫原性反应，得到以羟基磷灰石和Ⅰ型胶原蛋白为主要成分的脱细胞鳞片（HCS），其他鱼鳞如草鱼鱼鳞、鲤鱼鱼鳞、青鱼鱼鳞和相似的硬骨鱼鳞也都适用于本发明。
为满足不同组织工程支架的需求，例如含有羟基磷灰石和胶原蛋白成分的支架适用于骨组织支架材料；含有胶原蛋白成分的支架适用于眼角膜、血管修复支架材料。因此本发明用不同浓度的柠檬酸水溶液对脱细胞鳞片进行了一次脱钙和二次脱钙处理，得到以Ⅰ型胶原蛋白为主要成分的鱼鳞（CS1,CS2）,与脱细胞鳞片相比，脱钙鱼鳞具有更好地柔韧性和亲水性。
由于细胞对支架材料的响应是在蛋白质吸附之后，所以蛋白质吸附层将介入细胞与材料之间的反应，并且牛血清白蛋白（Bovine serum albumin，BSA）对细胞有良好的支持繁殖作用，所以本发明在三种鱼鳞（HCS、CS1、CS2）表面吸附了牛血清白蛋白，促进细胞增殖。
为了强化本发明鱼鳞支架的机械强度和牛血清蛋白在鱼鳞支架上牢固的附着，本发明采用了京尼平交联处理，其他交联剂如戊二醛、多巴胺、橄榄苦苷、原花青素和茶多酚也适用于本发明。
本发明用于细胞贴壁培养，以大鼠骨髓间充质干细胞（rat bone marrowmesenchymal stem cells, BMSCs）的贴壁培养为例，将细胞接种到三种鱼鳞支架上（HCS、CS1、CS2），分别培养1,3,7天，可以观察得到细胞长势良好，形态呈纺锤形或梭形，并且细胞生长沿着磷脊通道生长，其他细胞如小鼠成纤维细胞（mouse fibroblast）、胚胎成纤维细胞（embryofibroblast）、人牙周膜成纤维细胞（human periodontal ligamentfibroblasts）、人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells）、人皮肤成纤维细胞（human skinfibroblast））和相似的贴壁生长细胞也适用于本发明的细胞培养。
附图说明
图 1、鱼鳞支架：I: 脱细胞鳞片（HCS）、II: 一次脱钙鳞片（CS1）、III: 二次脱钙鳞片（CS2）。
图 2、鱼鳞支架片培养大鼠间充质干细胞（BMSCs）7天后的荧光电镜图（比例尺：1000微米）。
图 3、鱼鳞支架分别培养BMSCs 3天和7天后的扫描电镜图。
鱼鳞支架材料的结构图片和细胞在鱼鳞支架上的生长状态图片，可以展现出本发明的鱼鳞细胞支架材料具有良好的细胞亲和性、引导细胞定向生长的能力，提示本发明的鱼鳞支架在细胞培养和组织工程领域具有良好的应用前景。
具体实施方式
将3份新鲜的脆皖鱼鱼鳞用蒸馏水清洗干净晾干，浸入含有蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF，0.35mL/L）的低渗Tris缓冲溶液（10 mM , PH=7.4）中，并在4℃条件下搅拌36小时-42小时。
将0015.中得到的样品使用质量浓度0.5%-5%的Triton X-100溶液与含有蛋白酶抑制剂的Tris缓冲液（0.05 M）混合后（V/V， 1:2），浸没鱼鳞并在4℃条件下搅拌36小时-42小时，得到的鳞片在PBS缓冲液（pH 7.4）中清洗。
将0016.中得到的样品用DNase（5 μg/mL）和RNase（5 μg/mL）在37℃下消化 2 小时，在Tris缓冲溶液（0.05 M，pH7.4）中用Triton X-100 在4℃条件下进一步处理24小时-36小时，然后用PBS（pH 7.4）清洗后，再浸泡48小时-72小时，每12小时换浸泡液。
将0017.中得到的样品用乙酸（0.2 M）浸泡1小时，用蒸馏水、PBS（pH 7.4）缓冲液冲洗，得到的脱细胞的样品为HCS。
支架脱钙处理，对0018.中得到的HCS中的2份，用质量浓度10%-20%柠檬酸搅拌处理5小时-8小时，在去离子水中透析3天-6天，用PBS（pH 7.4）浸泡，4℃条件下保存，该样品为CS1；取其中1份CS1用质量浓度40%-50%柠檬酸搅拌处理2小时-3小时，在去离子水中透析4天-7天，用PBS（pH 7.4）浸泡，4℃条件下保存，该样品为CS2。
灭菌处理，对0018.和0019.中得到的HCS、CS1、CS2三种样品分别用75%酒精浸泡2小时、紫外照射24小时灭菌。
鱼鳞支架对牛血清白蛋白（BSA）的吸附，对0020.中得到的3种样品（HCS、CS1、CS2）分别和BSA溶液（100μg/mL-300μg/mL，pH=7.4）按质量体积比为1:6混合，在37℃条件下分别孵育1小时-24小时，为了控制BSA在鱼鳞支架上的吸附量，可以在浸泡时间内测定浸泡液中BSA的剩余量，然后去掉BSA浸泡液。
固化处理，将0021.中得到的3种样品（HCS、CS1、CS2）分别浸泡于0.05mM-0.5mM的京尼平的PBS缓冲液（pH=7.4）中，处理10分钟-1.0小时，除去液体，然后用PBS（pH 7.4）洗涤，用BSA溶液（100μg/mL-300μg/mL，pH=7.4）中和，既得到本发明的鱼鳞支架产品。
细胞培养，将0022.中得到的3种鱼鳞支架产品分别接种上BMSCs, 在细胞培养箱中培养1，3，7天后，分别对细胞进行钙黄绿素-AM染色观察和扫描电镜观察，可以实现细胞贴壁生长的鱼鳞支架产品。
补充说明，本发明步骤0022.中的京尼平固化处理可以在改在本发明步骤0020.之后，即先进行对0020.中得到的3种样品（HCS、CS1、CS2）分别浸泡于0.05mM-0.5mM的京尼平的PBS缓冲液（pH=7.4）中，处理10分钟-1小时，除去液体，然后用BSA溶液（100μg/mL-300μg/mL，pH=7.4）中和，也可以得到本发明的鱼鳞支架产品。
以下几个用脆皖鱼鱼鳞为具体实施例进一步给出本发明的制备方法：
实施例1
取3份鱼鳞，加1.5倍体积的含有苯甲基磺酰氟（0.35mL/L）Tris缓冲液（10 mM ,PH=7.4）搅拌42小时得样品1；用0.5%的Triton X-100溶液与含有苯甲基磺酰氟（0.35mL/L）Tris缓冲液（0.05 M）搅拌42小时得样品2；用DNase（5 μg/mL）和RNase（5 μg/mL）在37℃消化2小时得到样品3；用0.5%的Triton X-100 Tris缓冲液（0.05 M）浸泡36小时，用PBS溶液中浸泡48小时，得样品4，用乙酸（0.2 M）浸泡1小时，即得HCS；再用质量浓度10%的柠檬酸搅拌8小时即得CS1；再进一步用质量浓度40%柠檬酸搅拌3小时即得CS2；对HCS、CS1、CS2用75%酒精和紫外照射灭菌后和BSA溶液（100μg/mL，pH=7.4）按质量体积比为1:6 混合，37℃共孵育24小时，于0.05mM的京尼平的PBS缓冲液（pH=7.4）中处理1.0小时，用BSA溶液（100μg/mL，pH=7.4）中和，既得到本发明的3种鱼鳞支架产品；3种鱼鳞支架分别接种上BMSCs, 培养1，3，7天，可染色观察。
实施例2
取3份鱼鳞，加1倍体积的含有苯甲基磺酰氟（0.35mL/L）Tris缓冲液（10 mM , PH=7.4）搅拌36小时得样品1；用5%的Triton X-100溶液与含有苯甲基磺酰氟（0.35mL/L）的Tris缓冲液（0.05 M）搅拌36小时得样品2；用DNase（5 μg/mL）和RNase（5 μg/mL）在37℃下消化2小时得样品3；用5%的Triton X-100 Tris缓冲液（0.05 M）提取24小时，在PBS溶液中浸泡72小时，得样品4；用乙酸（0.2 M）浸泡1小时得样品为HCS；用质量浓度20%的柠檬酸搅拌5小时脱钙；得样品CS1；用质量浓度50%柠檬酸搅拌2小时二次脱钙处理，得样品CS2；对HCS、CS1、CS2用75%酒精和紫外灭菌后和BSA溶液（300μg/mL，pH=7.4）按质量体积比为1:6混合，37℃共孵育1小时后浸泡于0.5mM的京尼平的PBS缓冲液（pH=7.4）中，处理10分钟，用BSA溶液（300μg/mL，pH=7.4）中和，既得到本发明的3种鱼鳞支架产品；3种鱼鳞支架分别接种上BMSCs, 培养1，3，7天，可染色观察。
实施例3
取3份鱼鳞，加2倍体积的含有苯甲基磺酰氟（0.35mL/L）Tris缓冲液（10 mM , PH=7.4）中搅拌40小时得样品1；用1%的Triton X-100溶液与含有苯甲基磺酰氟（0.35mL/L）的Tris缓冲液（0.05 M）搅拌40小时得样品2；用DNase（5 μg/mL）和RNase（5 μg/mL）在37℃条件下消化2小时得样品3；用1%的Triton X-100 Tris缓冲液（0.05 M）提取30小时后，在PBS溶液中浸泡64小时，得样品4；用乙酸（0.2 M）浸泡1小时得样品HCS；；用质量浓度15%的柠檬酸搅拌7小时脱钙得样品CS1；用质量浓度45%柠檬酸搅拌2.5小时二次脱钙得样品CS2；对HCS、CS1、CS2用75%酒精和紫外照射灭菌后和BSA溶液（200μg/mL，pH=7.4）按质量体积比为1:6 混合，37℃共孵育12小时后浸泡于0.3mM的京尼平的PBS缓冲液（pH=7.4）中，处理40分钟，用BSA溶液（200μg/mL，pH=7.4）中和，既得到本发明的3种鱼鳞支架产品；3种鱼鳞支架分别接种上BMSCs, 培养1，3，7天，可染色观察。
实施例4
取3份鱼鳞，浸入1.6倍体积的含有苯甲基磺酰氟（0.35mL/L）的低渗Tris缓冲溶液（10 mM , PH=7.4）中搅拌38小时后得到样品1；用3%的Triton X-100溶液与含有苯甲基磺酰氟（0.35mL/L）Tris缓冲液（0.05 M）搅拌38小时到样品2；用DNase（5 μg/mL）和RNase（5 μg/mL）在37℃条件下消化2小时得样品3；用3%的Triton X-100 Tris缓冲液（0.05 M）提取26小时，在PBS溶液中浸泡68小时得样品4；用乙酸（0.2 M）浸泡1小时得样品为HCS；用质量浓度12%的柠檬酸搅拌6小时脱钙，得样品CS1；用质量浓度42%柠檬酸搅拌2.8小时二次脱钙得样品CS2；对HCS、CS1、CS2用75%酒精和紫外照射灭菌后浸泡于0.1mM的京尼平的PBS缓冲液（pH=7.4）中处理20分钟，用BSA溶液（150μg/mL，pH=7.4）中和，再与BSA溶液（150μg/mL，pH=7.4）按质量体积比为1:6 混合，37℃共孵育20小时，既得本发明的三种鱼鳞支架产品；3种鱼鳞支架分别接种上BMSCs, 培养1，3，7天，可染色观察。

Claims (1)

1.一种可用于大鼠骨髓间充质干细胞培养的鱼鳞组织支架的制备方法，其特征在于采用新鲜脆皖鱼鱼鳞为原料，取三份样品，首先，用蒸馏水清洗干净晾干，浸入含有0.35mL/L蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟的浓度为10mM的PH 7.4的Tris缓冲溶液中，4℃下搅拌36～42小时；然后，将质量浓度0.5％～5％的Triton X-100溶液与含有蛋白酶抑制剂的0.05M的Tris缓冲液按照体积比1:2混合，把上述鱼鳞浸入混合液中，4℃下搅拌36～42小时，得到的鳞片用pH 7.4的PBS缓冲液清洗，用浓度为5μg/mL的DNase和5μg/mL的RNase在37℃下消化2小时，再在浓度为0.05M的pH 7.4的Tris缓冲溶液中用Triton X-100在4℃下处理24～36小时，之后用pH 7.4的PBS缓冲液清洗并浸泡48～72小时，期间每12小时换一次浸泡液；最后，所得鳞片用0.2M的乙酸浸泡1小时，再依次用蒸馏水、pH 7.4的PBS缓冲液冲洗，即得脱细胞样品HCS；接下来，取HCS中的两份，浸入质量浓度10％～20％柠檬酸中搅拌处理5～8小时，去离子水中透析3～6天，pH 7.4的PBS缓冲液浸泡，4℃下保存，即得一次脱钙样品CS1；取CS1中的一份用质量浓度40％～50％柠檬酸搅拌处理2～3小时，去离子水中透析4～7天，pH7.4的PBS缓冲液浸泡，4℃下保存，即得二次脱钙样品CS2，将所得HCS、CS1、CS2三种样品分别用75％的酒精浸泡2小时、紫外照射24小时灭菌；然后将三种样品分别与pH 7.4的100～300μg/mL牛血清白蛋白溶液按质量体积比1:6混合，37℃下孵育1～24小时，去除浸泡液，再分别浸入含0.05～0.5mM京尼平的pH 7.4的PBS缓冲液中处理10～60分钟，除去液体，先用pH 7.4的PBS缓冲液洗涤，再用pH7.4的100～300μg/mL牛血清白蛋白溶液中和，得到三种不同的鱼鳞组织支架产品，三种产品分别接种上大鼠骨髓间充质干细胞，均可实现贴壁生长。
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