CN108355171A - 脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料及其制备方法和应用，涉及医用生物材料的技术领域。本发明的制备方法包括以下步骤：前处理，脱表皮层、制备疏松面，稳定化，脱细胞处理，洗涤和灭菌；由本发明的方法制备的膜材料以鱼皮为原料，具有三维空间框架结构，包括由生物基底膜构成的致密面和由真皮支架构成的胶原蛋白疏松面。本发明的膜材料避免了现有组织修复材料存在人畜共患病毒的携带和传播的风险，对细胞成分去除干净，免疫原性低，增加了胶原纤维的间隙，保留了真皮层结构，组织相容性良好，既具有良好的机械屏障作用又有利于新骨的生成；用于口腔种植手术的骨缺损修复治疗时，材料可吸收，有效避免了二次手术及其对患者的损伤。

Description

脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医用生物材料的技术领域，特别是指一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料及其制备方法和应用。
背景技术
近几年来，随着科学技术水平的不断发展和进步，一种新型修复技术——膜引导组织再生术(membrane guided bone/tissue regeneration，MGBR/MGTR)的出现极大地提高了口腔修复学的水平。引导组织再生术(guided bone/tissue regeneration，GBR/GTR)具有引导成骨和促进种植体周围骨性结合形成的作用，其原理是根据各类不同组织细胞迁移速度不同，即上皮细胞、成纤维细胞比形成牙槽骨的细胞快，采用生物材料制成一种具备致密面和疏松面的生物膜，致密面起屏障作用，以阻止软组织中成纤维细胞及上皮细胞长入骨缺损区，避免这些细胞与有骨生成能力的细胞产生竞争抑制，疏松面则保护血块的稳定，维持血块充填的间隙，使有骨生成能力的细胞缓慢进入骨缺损区，修复骨缺损。
临床中因各种原因导致的牙周组织缺损、拔牙后牙槽嵴吸收、牙缺失等，经常伴有牙周组织和牙槽骨的缺损。口腔种植术成为常规修复的方法，该手术成功的关键是有足够的骨量，除了为种植体提供了初期的机械力学以及长期的生物力学稳定，也满足了人们在视觉上的要求。在骨缺损修复过程中，不同组织细胞向骨缺损区迁移速度是不同的，而其中成纤维细胞和上皮细胞较快，导致非成骨细胞大量占据骨缺损区，影响骨生成量；因此，需要在口腔软组织与骨缺损区之间放置引导组织再生膜材料，起机械屏障作用，从而选择性地将非成骨细胞阻挡于骨缺损区以外，使成骨细胞顺利地进入骨缺损区，以提高新骨的生成量。
根据临床需要，有效引导组织再生膜应该具有适当的机械强度，以阻挡生长快速的软组织远离牙根表面，在牙根面上维持一个的空间。另外，引导组织再生膜需要具备良好生物相容性、无抗原活性和一定的手术可操作性，并且，能够保持一段足够引导组织再生的时间。根据在体内是否容易降解，临床应用的引导组织再生膜可分为生物降解和不可降解两大类。
目前，现有的引导组织再生膜材料产品在临床中应用时，仍存在抗原性高、力学强度不够、膜塌陷、移位、不可吸收膜需要二次手术取出、可吸收膜的体内维持时间不够长等问题。脱细胞真皮基质(acellular dermal matrix，ADM)是利用物理和化学方法将动物皮肤中的表皮层和细胞等抗原成分去除，只保留了基底膜和真皮中的细胞外基质纤维支架而得到的。脱细胞真皮基质具有良好的降解性能、力学性能和生物学性能，在口腔医用材料领域具有巨大的应用前景。然而，目前的脱细胞真皮基质主要来源于脱细胞猪/牛/异体人皮等，异体组织的获取日益困难，而猪、牛等陆地哺乳动物源性材料存在人畜共患病毒的携带和传播的风险；因此，急需寻找安全性更高的脱细胞基质材料以满足临床应用的需求。
发明内容
本发明提出一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料及其制备方法和应用，解决了现有技术中的引导组织再生膜存在人畜共患病毒的携带和传播的风险的问题。
本发明的一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法，其技术方案是这样实现的：包括以下步骤：1)前处理：取鱼皮，去除鱼鳞、内侧脂肪和多余鱼肉；2)洗涤：将步骤1)所得的鱼皮采用生理盐水反复冲洗数次，接着，采用超纯水反复冲洗数次；3)脱表皮层、制备疏松面：将步骤1)所得的组织置于0.01～1.0mol/L的酸溶液中，在20～37℃下，振荡5～30min，以去除表皮层并得到疏松面；4)稳定化：将步骤3)所得的组织置于0.5～2.5mol/L的氯化钠溶液中，在20～37℃下，振荡30～120min，以稳定结构；5)脱细胞：将步骤4)所得的组织置于-80～-70℃下冻融，反复冻融数次，然后，依次采用0.5～4.0wt％的脱氧胆酸钠溶液、3.5～6.5g/L的十二烷基磺酸钠溶液和0.1～1.0g/L的胰蛋白酶溶液进行脱细胞处理；6)洗涤：采用生理盐水进行洗涤；7)灭菌：冻干，定型，经Co-60γ射线辐照灭菌，得引导组织再生膜材料。
本发明的引导组织再生膜材料的制备方法中以鱼皮为原料，避免了使用猪或牛等陆地哺乳动物源性材料存在人畜共患病毒的携带和传播的风险；保留了真皮层结构，对细胞成分去除干净，免疫原性低；通过酸处理法得到了一面致密一面疏松的脱细胞基质，组织相容性良好，可以与组织有机缝合，用于口腔种植手术的骨缺损修复治疗时，放置于口腔软组织与骨缺损区之间，致密面起到了良好的机械屏障作用，同时疏松面有利于成骨细胞进入形成新骨；脱细胞的过程中增加了冻融的处理方法，增加了膜材料中胶原纤维的间隙，为细胞提供了通道，增大了细胞的迁移速度，同时提供了细胞生长空间。该制备方法简单，操作方便，对设备无特殊要求，易于实现产业化。
作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中酸溶液是盐酸溶液、硫酸溶液、甲酸溶液、乙酸溶液中的任意一种或几种。本发明通过酸溶液对洗涤后的鱼皮组织进行处理，在鱼皮组织的一侧形成疏松面，改变了现有鱼皮组织仅具有致密面而没有疏松面的特点；这些酸来源容易，酸性温和，能起到除去组织中的蛋白聚糖，分离胶原纤维的作用，适于制备疏松面。
作为一种优选的实施方案，所述步骤7)中灭菌的剂量为15～20kGy。本发明采用Co-60γ射线辐照灭菌，与其它病毒灭活方法相比，该法灭活病毒彻底，对有包膜和无包膜病毒均有杀灭作用，并且能对密封后的产品进行灭活，辐照后不会污染环境或产生有毒副作用的物质。
作为一种优选的实施方案，所述步骤5)中冻融的次数为3～5次。本发明在脱细胞的过程中增加了冻融处理过程，通过这种低温反复冻融，使鱼皮组织中胶原纤维的间隙逐渐扩大，间隙结构稳定，成型性好。
作为一种优选的实施方案，所述步骤2)中生理盐水冲洗和超纯水冲洗的次数均为3～5次，每次冲洗的时间均为10～15min。本发明首先采用刀子或镊子将鱼皮上的鱼鳞以及内侧脂肪和多余鱼肉去除，由于鱼皮中的脂质层得到了去除，降低了膜材料的免疫原性；前处理后的鱼皮经过生理盐水和超纯水反复冲洗，通过控制冲洗次数和冲洗时间，确保洗涤干净，达到卫生要求。
本发明的一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料，其技术方案是这样实现的：由上述任意一项所述的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法制备而成；所述引导组织再生膜材料是具有三维空间框架结构的脱细胞细胞外基质，所述引导组织再生膜材料包括由生物基底膜构成的致密面和由真皮支架构成的胶原蛋白疏松面。
本发明的膜材料以鱼皮为原料，是一面为致密面另一面为疏松面的脱细胞细胞外基质，保留了真皮层结构，主要成分是胶原蛋白，组织相容性良好，免疫原性低；该膜材料用于口腔种植手术的骨缺损修复治疗时，放置于口腔软组织与骨缺损区之间，致密面起机械屏障作用，能够选择性地将非成骨细胞阻挡于骨缺损区以外，使成骨细胞顺利地从疏松面进入骨缺损区，因此，能够提高新骨的生成量；该引导组织再生膜材料可吸收，有效避免了二次手术及其对患者的损伤，在口腔医学领域具有良好的应用前景，具有较高的医学领域实际应用价值。
作为一种优选的实施方案，所述引导组织再生膜材料为柔软的片状。该引导组织再生膜材料放置在口腔软组织与骨缺损区之间，其致密面朝向口腔软组织的方向，疏松面朝向骨缺损区的方向，这种柔软的片状膜材料在口腔软组织与骨缺损区之间起到了很好的屏蔽膜的作用，能够选择性地将非成骨细胞阻挡于骨缺损区以外，使成骨细胞顺利地进入骨缺损区，因此，能够提高新骨的生成量。
作为一种优选的实施方案，所述引导组织再生膜材料的规格为15～25mm×15～25mm×0.5～1.0mm。材料的尺寸和形状可根据实际情况进行调整，这个尺寸是根据临床上常用的规格裁剪的，临床使用方便。
作为一种优选的实施方案，所述引导组织再生膜材料的外观为白色。该膜材料为白色，与皮肤的颜色接近，使用后不影响口腔的美观，适配效果好。
本发明的一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的应用，其技术方案是这样实现的：所述引导组织再生膜材料用于口腔种植手术的骨缺损修复中，置于口腔软组织与骨缺损区之间。本发明的这种膜材料作为骨组织和牙周组织再生的屏障膜，既具有良好的机械屏障作用又有利于新骨的生成，可吸收，有效避免了二次手术及二次手术对患者的损伤。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用了物理和化学的方法对鱼皮组织进行脱细胞，所制备的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料中细胞成分去除彻底，细胞等抗原物质处理干净，降低了免疫原性，并具备了疏松面；在脱细胞的过程中采用冻融以及胰蛋白酶处理的方法，增加了脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料中胶原纤维的间隙，为细胞提供了通道，增大了细胞的迁移速度，同时提供了细胞生长空间。本发明的膜材料以鱼皮为原料，来源丰富，避免了使用猪或牛等陆地哺乳动物源性材料存在人畜共患病毒的携带和传播的风险；其是一面为致密面另一面为疏松面的脱细胞细胞外基质，保留了真皮层结构，主要成分是胶原蛋白，组织相容性良好。本发明制备的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料可用于口腔种植手术的骨缺损修复，放置于口腔软组织与骨缺损区之间，具有可以与口腔软组织紧密贴附，组织相容性好，术后可被降解吸收，不产生有毒产物和厚度适宜等优点，在口腔医学领域具有良好的应用前景，具有较高的医学领域实际应用价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例一所得的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的立体结构示意图；
图2为实施例一中未处理鱼皮即鱼皮原料一个面的扫描电镜观察图；
图3为实施例一中未处理鱼皮即鱼皮原料另一个面的扫描电镜观察图；
图4为实施例一中冻融处理前鱼皮截面的扫描电镜观察图；
图5为图1中的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的致密面的扫描电镜观察图；
图6为图1中的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的疏松面的扫描电镜观察图；
图7为图1中的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料截面的扫描电镜观察图；
图8为未处理鱼皮组织的组织学结构光学显微镜观察图；
图9为图1中的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的组织学结构光学显微镜观察图；
1-致密面；2-疏松面。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法，包括以下步骤：
1)前处理：取鱼皮，去除鱼鳞、内侧脂肪和多余鱼肉；
2)洗涤：将步骤1)所得的鱼皮采用生理盐水反复冲洗数次，接着，采用超纯水反复冲洗数次；
3)脱表皮层、制备疏松面：将步骤1)所得的组织置于0.01～1.0mol/L的酸溶液中，在20～37℃下，振荡5～30min，以去除表皮层并得到疏松面；
4)稳定化：将步骤3)所得的组织置于0.5～2.5mol/L的氯化钠溶液中，在20～37℃下，振荡30～120min，以稳定结构；
5)脱细胞：将步骤4)所得的组织置于-80～-70℃下冻融，反复冻融数次，然后，依次采用0.5～4.0％的脱氧胆酸钠溶液、3.5～6.5g/L的十二烷基磺酸钠溶液和0.1～1.0g/L的胰蛋白酶溶液进行脱细胞处理；
6)洗涤：采用生理盐水进行洗涤；
7)灭菌：冻干，定型，经Co-60γ射线辐照灭菌，得引导组织再生膜材料。
优选地，所述步骤3)中酸溶液是盐酸溶液、硫酸溶液、甲酸溶液、乙酸溶液中的任意一种或几种。
具体地，所述步骤7)中灭菌的剂量为15～20kGy。
进一步地，所述步骤5)中冻融的次数为3～5次。
更优选地，所述步骤2)中生理盐水冲洗和超纯水冲洗的次数均为3～5次，每次冲洗的时间均为10～15min。
本发明的一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料，由上述任意一项所述的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法制备而成；所述引导组织再生膜材料是具有三维空间框架结构的脱细胞细胞外基质，所述引导组织再生膜材料包括由生物基底膜构成的致密面和由真皮支架构成的胶原蛋白疏松面。
优选地，所述引导组织再生膜材料为柔软的片状。
具体地，所述引导组织再生膜材料的规格为15～25mm×15～25mm×0.5～1.0mm。
进一步地，所述引导组织再生膜材料的外观为白色。
本发明的一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的应用，所述引导组织再生膜材料用于口腔种植手术的骨缺损修复中，置于口腔软组织与骨缺损区之间。
实施例一
本发明的一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法，包括以下步骤：
1)前处理：从鱼身上取下鱼皮，采用刀将鱼鳞、内侧脂肪和多余鱼肉去除；
2)洗涤：将步骤1)获得的鱼皮采用生理盐水反复冲洗3次，每次持续10min，并再以超纯水反复冲洗3次，每次持续10min；
3)脱表皮层、制备疏松面：将步骤2)获得的材料放入0.01mol/L的甲酸溶液中，在20℃恒温摇床中，振荡30min，以去除表皮层并制备疏松面；
4)稳定化：将步骤3)获得的材料放入0.5mol/L的氯化钠溶液中，在20℃恒温摇床中，振荡120min，以稳定结构；
5)脱细胞：将步骤4)获得的材料在-80℃下冻融，反复冻融3次，再分别采用0.5％的脱氧胆酸钠溶液、3.5g/L的十二烷基磺酸钠溶液和0.1g/L的胰蛋白酶溶液对该鱼皮组织进行脱细胞处理；
6)洗涤：采用生理盐水对步骤5)获得的脱细胞真皮基质进行洗涤；
7)灭菌：对步骤6)获得的脱细胞真皮基质依次进行冻干、定型和Co-60γ射线辐照灭菌，灭菌剂量为15kGy，得到成品。
参阅附图1，本发明所得的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料具有三维空间框架结构，包括由生物基底膜构成的致密面1和由真皮支架构成的胶原蛋白疏松面2，为柔软白色片状，规格为15mm×15mm×0.5mm；参阅附图2和附图3，本发明所采用的原料鱼皮，正反两面均为致密面，内侧还带有一些皮下组织，鱼皮纤维较细，表现为各个网状单元层平面二维致密编织，各个网状单元相互叠加且它们之间主要靠一些细小的胶原纤维束来联系；经过前处理之后，该鱼皮原料的脂肪含量很低，其DNA含量不到50ng/mg，几乎可以忽略不计；本发明的鱼皮经过洗涤、脱表皮层以制备疏松面、稳定化和冻融处理之后，参阅附图4、附图6和附图7，原本排列致密的胶原纤维层被打断，出现孔隙，鱼皮组织中的胶原纤维间隙增加。
将本实施例最终所得的成品于日本JEOL公司生产的JSM-7500型号的扫描电子显微镜上进行观察，由附图5、附图6和附图7可以看出，其致密面表面光滑，非常密实，其疏松面呈疏松多孔状，具有很多明显的孔道；致密面和疏松面分层明显，结构完全不同，致密面有效地将成纤维细胞和上皮细胞等非成骨细胞阻挡于骨缺损区以外，成骨细胞顺利地通过致密面并从疏松面进入骨缺损区，从而提高了新骨的生成量；由附图8可以看出，原料鱼皮的黑色素细胞分布在皮层表层部分，鱼皮的主要成分是胶原纤维，结构上由平面二维编织的网状单元相互叠加，排列致密，各个网状单元主要靠一些纵向细小的胶原纤维束来联系，切片还能看到皮下脂肪组织；由附图9可以看出，处理后细胞得到了很好的脱除，基本无细胞核残留，并且原本层状排列的胶原纤维被打断，创造出纵向的细胞生长通道；另外，处理过程处理掉了表皮层和皮下组织层，减少了抗原性物质的存在。
实施例二
本发明的一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法，包括以下步骤：
1)前处理：从鱼身上取下鱼皮，采用镊子将鱼鳞以及内侧脂肪和多余鱼肉去除；
2)洗涤：将步骤1)获得的鱼皮采用生理盐水反复冲洗5次，每次持续15min，并再以超纯水反复冲洗5次，每次持续15min；
3)脱表皮层、制备疏松面：将步骤2)获得的材料放入0.1mol/L的盐酸溶液中，在25℃恒温摇床中，振荡10min，去除表皮层并制备疏松面；
4)稳定化：将步骤3)获得的材料放入1.0mol/L的氯化钠溶液中，在37℃的恒温摇床中，振荡90min，以稳定结构；
5)脱细胞：将步骤4)获得的材料在-70℃下冻融，反复冻融5次，再分别采用1.0％的脱氧胆酸钠溶液、5.0g/L的十二烷基磺酸钠溶液和0.5g/L的胰蛋白酶溶液对该鱼皮组织进行脱细胞处理；
6)洗涤：采用生理盐水对步骤5)获得的脱细胞真皮基质进行洗涤；
7)灭菌：对步骤6)获得的脱细胞真皮基质依次进行冻干、定型和Co-60γ射线辐照灭菌，灭菌剂量为17kGy，得到成品。
该成品即脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料具有三维空间框架结构，为柔软白色片状，规格为25mm×25mm×1.0mm，包括由生物基底膜构成的致密面和由真皮支架构成的胶原蛋白疏松面，致密面表面光滑，非常密实，疏松面呈疏松多孔状，具有很多明显的孔道；致密面和疏松面分层明显，结构完全不同。
实施例三
本发明的一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法，包括以下步骤：
1)前处理：从鱼身上取下鱼皮，采用刀或镊子将鱼鳞以及内侧脂肪和多余鱼肉去除；
2)洗涤：将步骤1)获得的鱼皮采用生理盐水反复冲洗4次，每次持续12min，并再以超纯水反复冲洗4次，每次持续12min；
3)脱表皮层、制备疏松面：将步骤2)获得的材料放入0.5mol/L的乙酸溶液中，在25℃恒温摇床中，振荡5min去除表皮层并制备疏松面；
4)稳定化：将步骤3)获得的材料放入2.0mol/L氯化钠溶液中，在25℃恒温摇床中，振荡60min以稳定结构；
5)脱细胞：将步骤4)获得的材料在-75℃下冻融，反复冻融4次，再分别采用2.0％的脱氧胆酸钠溶液、5.0g/L的十二烷基磺酸钠溶液和0.5g/L的胰蛋白酶溶液对该鱼皮组织进行脱细胞处理；
6)洗涤：用生理盐水对步骤5)获得的脱细胞真皮基质进行洗涤；
7)灭菌：对步骤6)获得的脱细胞真皮基质依次进行冻干、定型和Co-60γ射线辐照灭菌，灭菌剂量为18kGy，得到成品。
该成品即脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料具有三维空间框架结构，为柔软白色片状，规格为20mm×20mm×0.8mm，包括由生物基底膜构成的致密面和由真皮支架构成的胶原蛋白疏松面，致密面表面光滑，非常密实，疏松面呈疏松多孔状，具有很多明显的孔道；致密面和疏松面分层明显，结构完全不同。
实施例四
本发明的一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法，包括以下步骤：
1)前处理：从鱼身上取下鱼皮，采用刀将鱼鳞以及内侧脂肪和多余鱼肉去除；
2)洗涤：将步骤1)获得的鱼皮采用生理盐水反复冲洗3次，每次持续15min，并再以超纯水反复冲洗3次，每次持续15min；
3)脱表皮层、制备疏松面：将步骤2)获得的材料放入1.0mol/L的硫酸溶液中，在37℃恒温摇床中，振荡5min，以去除表皮层并制备疏松面；
4)稳定化：将步骤3)获得的材料放入2.5mol/L的氯化钠溶液中，在37℃恒温摇床中，振荡30min，以稳定结构；
5)脱细胞：将步骤4)获得的材料在-80℃下冻融，反复冻融4次，再分别采用4.0％的脱氧胆酸钠溶液、6.5g/L十二烷基磺酸钠溶液和1.0g/L胰蛋白酶溶液对该鱼皮组织进行脱细胞处理；
6)洗涤：采用生理盐水对步骤5)获得的脱细胞真皮基质进行洗涤；
7)灭菌：对步骤6)获得的脱细胞真皮基质依次进行冻干、定型和Co-60γ射线辐照灭菌，灭菌剂量为20kGy，得到成品。
该成品即脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料具有三维空间框架结构，为柔软白色片状，规格为20mm×15mm×0.5mm，包括由生物基底膜构成的致密面和由真皮支架构成的胶原蛋白疏松面，致密面表面光滑，非常密实，疏松面呈疏松多孔状，具有很多明显的孔道；致密面和疏松面分层明显，结构完全不同。
表1不同组织修复材料的性能测试结果
将实施例一至实施例四所得的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料分别进行性能测试实验，包括外观、抗张强度、羟脯氨酸含量、总蛋白含量、体外模拟降解时间、细胞毒性和致敏试验，其中，外观通过技术专家从外部感官质量上进行评价，抗张强度采用济南友创试验机有限公司生产的WDW-1型号的电子万能试验机测定的应力应变关系而测定，羟脯氨酸含量采用日立L-8900型号的氨基酸分析仪通过氨基酸分析方法测定，并以总蛋白含量为基数进行计量，总蛋白含量采用凯氏定氮方法测定，体外模拟降解时间采用体外模拟降解方法测定，细胞毒性采用MTT比色方法测定，致敏试验采用GBT16886.10-2005第10部分：刺激与迟发型超敏反应试验规定的方法测定，测试结果如表1所示。
由表1可以看出，本发明制备的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的外观均为白色，具有致密面和疏松面两个面，无肉眼可见杂质；其厚度在0.5～1mm之间；抗张强度均不低于4MPa；羟脯氨酸含量不小于总蛋白含量的7％(m/m)；总蛋白含量不低于95％；体外模拟降解时间不少于48h；细胞毒性反应均不大于1级，均无迟发型的超敏反应。因此，其具有很好的与口腔适配效果，厚度适中，抗张强度大，无细胞毒性和致敏反应，放置于口腔软组织与骨缺损区之间，可以与口腔软组织紧密贴附，组织相容性好，术后可被降解吸收，不产生有毒产物，在口腔医学领域具有良好的应用前景，具有较高的医学领域实际应用价值。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明采用了物理和化学的方法对鱼皮组织进行脱细胞，使制备的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料中细胞成分去除彻底，细胞等抗原物质处理干净，降低了免疫原性，并具备了疏松面；在脱细胞的过程中采用冻融以及胰蛋白酶处理的方法，增加了脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料中胶原纤维的间隙，为细胞提供了通道，增大了细胞的迁移速度，同时提供了细胞生长空间。本发明的膜材料以鱼皮为原料，来源丰富，避免了使用猪或牛等陆地哺乳动物源性材料存在人畜共患病毒的携带和传播的风险；其是一面为致密面另一面为疏松面的脱细胞细胞外基质，保留了真皮层结构，主要成分是胶原蛋白，组织相容性良好。本发明制备的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料可用于口腔种植手术的骨缺损修复，放置于口腔软组织与骨缺损区之间，具有可以与口腔软组织紧密贴附，组织相容性好，术后可被降解吸收，不产生有毒产物和厚度适宜等优点，在口腔医学领域具有良好的应用前景，具有较高的医学领域实际应用价值。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)前处理：取鱼皮，去除鱼鳞、内侧脂肪和多余鱼肉；
2)洗涤：将步骤1)所得的鱼皮采用生理盐水反复冲洗数次，接着，采用超纯水反复冲洗数次；
3)脱表皮层、制备疏松面：将步骤1)所得的组织置于0.01～1.0mol/L的酸溶液中，在20～37℃下，振荡5～30min，以去除表皮层并得到疏松面；
4)稳定化：将步骤3)所得的组织置于0.5～2.5mol/L的氯化钠溶液中，在20～37℃下，振荡30～120min，以稳定结构；
5)脱细胞：将步骤4)所得的组织置于-80～-70℃下冻融，反复冻融数次，然后，依次采用0.5～4.0wt％的脱氧胆酸钠溶液、3.5～6.5g/L的十二烷基磺酸钠溶液和0.1～1.0g/L的胰蛋白酶溶液进行脱细胞处理；
6)洗涤：采用生理盐水进行洗涤；
7)灭菌：冻干，定型，经Co-60γ射线辐照灭菌，得引导组织再生膜材料。
2.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法，其特征在于：
所述步骤3)中酸溶液是盐酸溶液、硫酸溶液、甲酸溶液、乙酸溶液中的任意一种或几种。
3.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法，其特征在于：
所述步骤7)中灭菌的剂量为15～20kGy。
4.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法，其特征在于：
所述步骤5)中冻融的次数为3～5次。
5.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法，其特征在于：
所述步骤2)中生理盐水冲洗和超纯水冲洗的次数均为3～5次，每次冲洗的时间均为10～15min。
6.一种脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料，其特征在于：
由根据权利要求1～5中任意一项所述的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的制备方法制备而成；
所述引导组织再生膜材料是具有三维空间框架结构的脱细胞细胞外基质，所述引导组织再生膜材料包括由生物基底膜构成的致密面和由真皮支架构成的胶原蛋白疏松面。
7.根据权利要求6所述的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料，其特征在于：
所述引导组织再生膜材料为柔软的片状。
8.根据权利要求7所述的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料，其特征在于：
所述引导组织再生膜材料的规格为15～25mm×15～25mm×0.5～1.0mm。
9.根据权利要求6所述的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料，其特征在于：
所述引导组织再生膜材料的外观为白色。
10.一种根据权利要求6所述的脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料的应用，其特征在于：
所述引导组织再生膜材料用于口腔种植手术的骨缺损修复中，置于口腔软组织与骨缺损区之间。
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