CN1522766A - 脱细胞真皮基质的制备方法 - Google Patents

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CN1522766A CNA031529445A CN03152944A CN1522766A CN 1522766 A CN1522766 A CN 1522766A CN A031529445 A CNA031529445 A CN A031529445A CN 03152944 A CN03152944 A CN 03152944A CN 1522766 A CN1522766 A CN 1522766A
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谭谦
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Abstract

本发明是一种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于将切取的断层异体或异种皮肤浸入质量百分比为0.04％～0.06％的胰蛋白酶中于2℃～4℃消化16小时～20小时；将消化处理好的皮肤在无菌条件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸盐缓冲液中持续震荡洗涤，以去除分离的细胞；此后将其浸入0.04％～0.06％(质量百分比)的胰蛋白酶中于36.8℃～37.2℃消化30分钟～60分钟，然后用磷酸盐缓冲液洗涤；最后，将其进行预冷，－70℃～－80℃冷冻和37℃～39℃下融化的冻融，如此反复冻融不超过4次，再用磷酸盐缓冲液充分洗涤后，置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中处理。本发明具有方法简便，容易操作，实用性强的优点。

Description

脱细胞真皮基质的制备方法
一、技术领域
本发明涉及一种脱细胞真皮基质的制备方法。
二、背景技术
脱细胞真皮基质的制备方法很多，如：单纯缓冲液或培养液孵育法、高渗NaCl+SDS孵育法、单纯酶消化法、酶消化+培养液孵育法、胰蛋白酶(Trypsin)消化+戊二醛交联法、胰蛋白酶+TritonX-100浸泡法、Dispase/detergent(分离酶/TritonX-100)法、反复冻融孵育法等。最佳的方法应该是能够去除真皮内所有的细胞成分而最大限度保留真皮内胶原结构等的完整性。目前，效果肯定而最常用的方法为高渗NaCl+SDS孵育法、胰蛋白酶(Trypsin)/Dispase消化+戊二醛交联法、胰蛋白酶+TritonX-100孵育法、Dispase/Detergent(分离酶/TritonX-100)孵育法。研究表明，Dispase较Trypsin能有效地去除皮肤的细胞成分，但两者单独酶处理时都不能充分去除所有的细胞和细胞碎片，必须联合其它的方法。文献报道制备脱细胞真皮中所用的化学制剂的残留对脱细胞真皮上培养的角朊细胞或移植的表皮产生毒性作用；较高浓度(常用浓度为0.25％)的胰蛋白酶处理时，易破坏基底膜和真皮胶原纤维结构；用单纯冻融法处理，需10次以上才能去除真皮内的细胞成分，但这又会破坏基底膜和真皮胶原。
三、技术内容
技术问题：本发明提供一种能够保持基底膜和胶原成分完整且细胞成份脱净率高的脱细胞真皮基质的制备方法。
技术方案：本发明是一种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于将切取的断层异体或异种皮肤浸入质量百分比为0.04％～0.06％的胰蛋白酶中于2℃～4℃消化16小时～20小时；将消化处理好的皮肤在无菌条件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸盐缓冲液中持续震荡洗涤，以去除分离的细胞；此后将其浸入0.04％～0.06％(质量百分比)的胰蛋白酶中于36.8℃～37.2℃消化30分钟～60分钟，然后用磷酸盐缓冲液洗涤；最后，将其进行预冷，-70℃～-80℃冷冻和37℃～39℃下融化的冻融，如此反复冻融不超过4次，再用磷酸盐缓冲液充分洗涤后，置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中处理。
技术效果：本发明采用低浓度(0.05％)胰蛋白酶消化加反复冻融法处理3次，制备脱细胞真皮基质，此方法既能完全脱去细胞成分，又保留了真皮的正常胶原结构，而且避免了去垢剂等化学物质的残留而影响角朊细胞的生长。经组织学、免疫组化染色、细胞培养和细菌培养证实，该法制备的真皮替代物是含基底膜的以胶原为主的细胞外基质，而且无菌、无细胞、无毒性，是一种简便有效的方法，具体来说，此方法处理后的脱细胞真皮基质细胞成分去除干净，并含有完整的基底膜和胶原成分，不破坏组织结构，未采用化学制剂处理(如去垢剂)，避免了化学物质残留而造成的不良影响，胰蛋白酶浓度低，反复冻融次数少，避免了对基底膜和胶原结构的破坏，方法简便，容易操作，实用性强。
四、附图说明
图1是处理后真皮基质组织学观察图。
图2是处理后真皮基质免疫组化染色图。
五、具体实施方案
实施例1
本发明是一种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于将切取的断层异体或异种皮肤浸入质量百分比为0.04％～0.06％的胰蛋白酶中于2℃～4℃消化16小时～20小时；将消化处理好的皮肤在无菌条件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸盐缓冲液中持续震荡洗涤，以去除分离的细胞；此后将其浸入0.04％～0.06％(质量百分比)的胰蛋白酶中于36.8℃～37.2℃(该温度的选择应由人体正常体温来确定，考虑到人体体温的变化，将该温度确定为36.8℃～37.2℃)消化30分钟～60分钟，然后用磷酸盐缓冲液洗涤；最后，将其进行预冷，-70℃～-80℃冷冻和37℃～39℃下融化的冻融，如此反复冻融不超过4次，在用磷酸盐缓冲液充分洗涤后，置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中，本实施例采用3次反复冻融，在置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中处理后再用磷酸盐缓冲液洗涤2～4次。
实施例2
本发明是一种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于将切取的断层异体或异种皮肤浸入质量百分比为0.04％的胰蛋白酶中于2℃消化16小时；将消化处理好的皮肤在无菌条件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸盐缓冲液中持续震荡洗涤，以去除分离的细胞；此后将其浸入0.04％(质量百分比)的胰蛋白酶中于36.8℃(该温度的选择应由人体正常体温来确定，考虑到人体体温的变化，将该温度确定为36.8℃)消化30分钟，然后用磷酸盐缓冲液洗涤；最后，将其进行预冷，-70℃冷冻和37℃下融化的冻融，如此反复冻融不超过4次，在用磷酸盐缓冲液充分洗涤后，置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中，本实施例采用3次反复冻融，在置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中处理后再用磷酸盐缓冲液洗涤2～4次。
实施例3
本发明是一种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于将切取的断层异体或异种皮肤浸入质量百分比为0.06％的胰蛋白酶中于4℃消化20小时；将消化处理好的皮肤在无菌条件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸盐缓冲液中持续震荡洗涤，以去除分离的细胞；此后将其浸入0.06％(质量百分比)的胰蛋白酶中于37.2℃(该温度的选择应由人体正常体温来确定，考虑到人体体温的变化，将该温度确定为37.2℃)消化60分钟，然后用磷酸盐缓冲液洗涤；最后，将其进行预冷，-80℃冷冻和39℃下融化的冻融，如此反复冻融不超过4次，在用磷酸盐缓冲液充分洗涤后，置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中，本实施例采用3次反复冻融，在置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中处理后再用磷酸盐缓冲液洗涤2～4次。
实施例4
本发明是一种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于将切取的断层异体或异种皮肤浸入质量百分比为0.05％的胰蛋白酶中于3℃消化18小时；将消化处理好的皮肤在无菌条件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸盐缓冲液中持续震荡洗涤，以去除分离的细胞；此后将其浸入0.05％(质量百分比)的胰蛋白酶中于37℃(该温度的选择应由人体正常体温来确定，考虑到人体体温的变化，将该温度确定为37℃)消化40分钟，然后用磷酸盐缓冲液洗涤；最后，将其进行预冷，-76℃冷冻和38℃下融化的冻融，如此反复冻融不超过4次，在用磷酸盐缓冲液充分洗涤后，置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中，本实施例采用3次反复冻融，在置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中处理后再用磷酸盐缓冲液洗涤2～4次。

Claims (3)

1.一种脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于将切取的断层异体或异种皮肤浸入质量百分比为0.04％～0.06％的胰蛋白酶中于2℃～4℃消化16小时～20小时；将消化处理好的皮肤在无菌条件下揭去表皮，剩下的真皮在磷酸盐缓冲液中持续震荡洗涤，以去除分离的细胞；此后将其浸入0.04％～0.06％(质量百分比)的胰蛋白酶中于36.8℃～37.2℃消化30分钟～60分钟，然后用磷酸盐缓冲液洗涤；最后，将其进行预冷，-70℃～-80℃冷冻和37℃～39℃下融化的冻融，如此反复冻融不超过4次，在用磷酸盐缓冲液充分洗涤后，置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中处理。
2.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于在置入含抗生素的磷酸盐缓冲液中处理后再用磷酸盐缓冲液洗涤2～4次。
3.根据权利要求1所述的脱细胞真皮基质的制备方法，其特征在于采用3次反复冻融。
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Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100372511C (zh) * 2005-11-30 2008-03-05 烟台正海生物技术有限公司 一种脱细胞真皮基质
CN100400655C (zh) * 2005-12-02 2008-07-09 王平安 组织工程化细胞外基质的制备方法
WO2009117858A1 (zh) * 2008-03-24 2009-10-01 中山大学中山眼科中心 一种制备脱细胞基质的方法
CN102178981A (zh) * 2011-04-20 2011-09-14 北京市创伤骨科研究所 一种软骨修复支架材料的制备方法
CN103920195A (zh) * 2014-04-24 2014-07-16 刘邑卿 净细核无菌异种乙膜的制备方法与应用
CN103990179A (zh) * 2014-05-24 2014-08-20 河北爱能生物科技有限公司 一种制备异种脱细胞基质的方法及其产品
CN106310352A (zh) * 2016-11-01 2017-01-11 广东泰宝医疗科技股份有限公司 一种抗菌性脱细胞真皮基质敷料的制备方法
CN106806942A (zh) * 2015-12-02 2017-06-09 中国科学院大连化学物理研究所 一种心肌组织工程脱细胞化胶原膜片的制备方法
CN107397972A (zh) * 2016-05-20 2017-11-28 北京纳通科技集团有限公司 一种动物皮脱细胞基质敷料的制备方法以及所得的敷料
CN108187140A (zh) * 2018-03-28 2018-06-22 中国海洋大学 一种鱼皮源脱细胞真皮基质及其制备方法
CN108355172A (zh) * 2018-04-17 2018-08-03 上海市第六人民医院 一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质及其制备方法和应用
CN108355171A (zh) * 2018-04-09 2018-08-03 青岛海洋生物医药研究院 脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料及其制备方法和应用
CN113425905A (zh) * 2020-03-23 2021-09-24 成都中科奥格生物科技有限公司 一种血管材料及其制备方法和用途

Cited By (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100372511C (zh) * 2005-11-30 2008-03-05 烟台正海生物技术有限公司 一种脱细胞真皮基质
CN100400655C (zh) * 2005-12-02 2008-07-09 王平安 组织工程化细胞外基质的制备方法
WO2009117858A1 (zh) * 2008-03-24 2009-10-01 中山大学中山眼科中心 一种制备脱细胞基质的方法
CN102178981A (zh) * 2011-04-20 2011-09-14 北京市创伤骨科研究所 一种软骨修复支架材料的制备方法
CN102178981B (zh) * 2011-04-20 2013-08-28 北京市创伤骨科研究所 一种软骨修复支架材料的制备方法
CN103920195B (zh) * 2014-04-24 2015-05-13 刘邑卿 净细核无菌异种乙膜的制备方法与应用
CN103920195A (zh) * 2014-04-24 2014-07-16 刘邑卿 净细核无菌异种乙膜的制备方法与应用
CN103990179A (zh) * 2014-05-24 2014-08-20 河北爱能生物科技有限公司 一种制备异种脱细胞基质的方法及其产品
CN106806942A (zh) * 2015-12-02 2017-06-09 中国科学院大连化学物理研究所 一种心肌组织工程脱细胞化胶原膜片的制备方法
CN107397972A (zh) * 2016-05-20 2017-11-28 北京纳通科技集团有限公司 一种动物皮脱细胞基质敷料的制备方法以及所得的敷料
CN106310352A (zh) * 2016-11-01 2017-01-11 广东泰宝医疗科技股份有限公司 一种抗菌性脱细胞真皮基质敷料的制备方法
CN108187140A (zh) * 2018-03-28 2018-06-22 中国海洋大学 一种鱼皮源脱细胞真皮基质及其制备方法
CN108355171A (zh) * 2018-04-09 2018-08-03 青岛海洋生物医药研究院 脱细胞真皮基质引导组织再生膜材料及其制备方法和应用
CN108355172A (zh) * 2018-04-17 2018-08-03 上海市第六人民医院 一种软组织修复用脱细胞罗非鱼皮仿生基质及其制备方法和应用
CN113425905A (zh) * 2020-03-23 2021-09-24 成都中科奥格生物科技有限公司 一种血管材料及其制备方法和用途

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