CN113425905A - 一种血管材料及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物材料领域，具体涉及一种血管材料及其制备方法和用途。利用本发明加工制备的血管材料，通过基因编辑技术从原材料源头降低其免疫原性，使用优化的脱细胞处理技术和交联技术进一步降低其免疫原性。本发明的血管材料免疫原性低、生物活性好，用于临床不同组织/器官的修复再生。

Description

一种血管材料及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物材料领域，特别涉及一种血管材料及其制备方法和用途。
背景技术
动物源性血管材料已广泛用于组织工程与再生医学研究，在临床应用中展示出巨大潜力。面对异种血管材料存在的免疫原性问题，一般通过去除血管组织中的异种细胞，降低其免疫原性。现有降低血管材料免疫原性的方法主要包括物理法，化学法和生物法(酶法)。仅从脱细胞程度上说，各种方法均可制备出脱细胞程度较高的产品。但从临床应用效果来看，产品的生物活性等仍不令人满意。主要原因在于：现有的脱细胞方案均不可避免的导致细胞外基质成分的丢失，尤其是可溶性的蛋白多糖和糖蛋白成分，丢失率可达80％。为了提高产品性能，满足临床治疗效果，需要进一步优化降低血管材料免疫原性的技术方案。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种血管材料及其制备方法和用途。利用本发明加工制备的血管材料，通过基因编辑技术从原材料源头降低其免疫原性，使用优化的脱细胞处理技术和交联技术进一步降低其免疫原性。本发明的血管材料用于临床不同组织/器官的修复再生，在使用过程中可以结合活性分子和/或活细胞。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种血管材料的制备方法，包括如下步骤：
步骤1、繁育基因编辑动物；
步骤2、采集步骤1动物的血管作为原料；
步骤3、取步骤2制得的所述原料脱细胞；
步骤4、取步骤3制得的材料交联化。
其中，步骤3具体为：
浸没于0.001～5wt.％中性蛋白酶溶液中，温度为0～40℃，振荡频率为500～1000rpm，处理时间为2～12h；酶活为800～10000U/g；
超声波清洗，20～120KHz处理2～12h，功率4～10KW，温度为0～40℃；
浸没于0.001～5wt.％SDS溶液中2～24h，振荡频率为100～1000rpm，温度为0～40℃；
超声波清洗，40～120KHz处理2～12h，功率4～10KW，温度为0～40℃；
浸没于0.0001～1wt.％SDS溶液中2～12h，振荡频率为100～1000rpm，温度为10～40℃；
超声波清洗，60～120KHz处理2～12h，功率4～10KW，温度为0～40℃；
步骤4具体为：
浸没于0.00001～2wt.％京尼平溶液中1～12h，浸没温度为25～40℃，重复浸没1～10次。
浸没于0.005～5wt.％戊二醛溶液中1～12h，浸没温度为25～40℃，重复浸没1～5次。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3具体为：
浸没于0.1wt.％中性蛋白酶溶液中，温度为37℃，震荡频率为1000rpm，处理时间为6h；
浸没于超声波清洗器中，60KHz处理8h，功率4KW，温度为30℃；
浸没于0.01wt.％SDS溶液中10h，震荡频率为700rpm，温度为20℃；
浸没于超声波清洗器中，90KHz处理3h，功率5KW，温度为20℃；
浸没于0.0001wt.％SDS溶液中8h，振荡频率为1000rpm，温度为30℃；
超声波清洗，80KHz处理10h，功率6KW，温度为20℃。
步骤4具体为：
浸没于0.0001wt.％京尼平溶液中10h，浸没温度为37℃，重复浸没5次；
浸没于0.005wt.％戊二醛溶液中12h，浸没温度为25℃，重复浸没3次。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3具体为：
浸没于5wt.％中性蛋白酶溶液中，温度为37℃，振荡频率为500rpm，处理时间为12h；酶活为800U/g；
超声波清洗，120KHz处理12h，功率10KW，温度为40℃；
浸没于0.001wt.％SDS溶液中24h，振荡频率为1000rpm，温度为40℃；
超声波清洗，120KHz处理12h，功率4KW，温度为40℃；
浸没于0.0001wt.％SDS溶液中12h，振荡频率为100rpm，温度为10℃；
超声波清洗，60KHz处理12h，功率10KW，温度40℃。
步骤4具体为：
浸没于1wt.％京尼平溶液中6h，浸没温度为40℃，重复浸没10次；
浸没于0.005wt.％戊二醛溶液中12h，浸没温度为25℃，重复浸没4次。
在本发明的一些具体实施方案中，步骤3具体为：
浸没于0.001wt.％中性蛋白酶溶液中，温度为10℃，振荡频率为600rpm，处理时间为8h；酶活为2000U/g；
超声波清洗，50KHz处理8h，功率9KW，温度为37℃；
浸没于0.005wt.％SDS溶液中10h，振荡频率为600rpm，温度为25℃；
超声波清洗，80KHz处理10h，功率6KW，温度为35℃；
浸没于0.0008wt.％SDS溶液中25h，振荡频率为300rpm，温度为10℃；
超声波清洗，120KHz处理5h，功率8KW，温度为10℃。
步骤4具体为：
浸没于0.00005wt.％京尼平溶液中12h，浸没温度为25℃，重复浸没10次。
浸没于0.01wt.％戊二醛溶液中12h，浸没温度为40℃，重复浸没2次。
在本发明的一些具体实施方案中，所述基因编辑包括巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述基因编辑包括基因敲除和/或基因转入；
所述基因敲除中敲除的基因包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2或PERV中的至少一种；
基因转入中转入的基因包括hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI或EPCR中的至少一种。
在本发明的一些具体实施方案中，所述动物包括猪、牛、羊、马、猴、狗、兔、鸡、鼠、蚕、鱼、海洋生物、驴中的至少一种；所述动物为基因编辑后稳定传代3代以上的动物。在另一些具体实施方案中，选用基因编辑后稳定传代6代的动物。
所述鱼包括淡水鱼类。
所述海洋生物包括海洋动物和海洋植物；所述海洋动物包括海洋哺乳动物、海洋爬行动物、海洋鱼类、海洋节肢动物、藤壶、海洋软体动物、海洋棘皮动物或海洋腔肠动物中的一种或多种。所述海洋哺乳动物包括蓝鲸、抹香鲸、虎鲸、齿鲸、海豚、海豹、海狮、儒艮中的一种或多种。所述海洋爬行动物包括海蛇、海龟中的一种或多种。所述海洋鱼类包括前口蝠鲼、电鳐、刺鳐、星鳐、何氏鳐、中国团扇鳐、瞻星鱼、电鳗、康吉鳗、电鲶、箱鲀、鲂鮄、海马、石首鱼类、象鼻鱼、鲨鱼、蝴蝶鱼、刺盖鱼、甲尻鱼、石斑鱼、粗皮鲷、躄鱼、蝙蝠鱼、小丑鱼、带鱼、龙头鱼、烛光鱼、翻车鱼中的一种或多种。所述海洋节肢动物包括鲎、虾、蟹中的一种或多种。所述海洋软体动物包括石鳖、螠蛏、海兔中的一种或多种。所述海洋棘皮动物包括海星、海胆、海参中的一种或多种。所述海洋腔肠动物包括水母、薮枝螅、海蜇、珊瑚或海葵中的一种或多种。所述海洋植物包括浮游藻和底栖藻；所述底栖藻包括绿藻类、褐藻类和红藻类。
本发明中，血管包括：
1.动脉，包括：大动脉、中动脉、小动脉、微动脉；
2.毛细血管；
3.静脉，包括：大静脉、中静脉、小静脉、微静脉；
其中，心的血管包括：
1.冠状动脉
①左冠状动脉，包括：前室间支、旋支；
②右冠状动脉，包括：后室间支、左室后支；
2.心的静脉，包括：①心最小静脉；②心前静脉；③冠状窦，包括：心大静脉、心中静脉、心小静脉；
其中，动脉包括：
1.肺动脉干，包括①左肺动脉、②右肺动脉；
2.主动脉，包括①升主动脉；②主动脉弓，包括：头臂干、左颈总动脉、左锁骨下动脉；
③头臂干，包括：右颈总动脉、右锁骨下动脉；
3.头颈部的动脉
①颈总动脉，包括：颈内动脉、颈外动脉；
②颈外动脉
向前发出：甲状腺上动脉、面动脉、舌动脉；
向后发出：枕动脉、耳后动脉；
自内侧壁发出：咽升动脉；
终末支是：上颌动脉、颞浅动脉；
③颈内动脉(入颅腔)
4.上肢的动脉
①锁骨下动脉，包括：椎动脉、胸廓内动脉、甲状颈干；
②腋动脉，包括：胸肩峰动脉、胸外侧动脉、肩胛下动脉、旋肱后动脉；
③肱动脉，包括：桡动脉、尺动脉；
④桡动脉，包括：掌浅支、拇主要动脉；
⑤尺动脉，包括：骨间总动脉、掌深支；
⑥掌浅弓、掌深弓
5.躯干的动脉
①胸主动脉
a.壁支，包括：肋间后动脉、膈上动脉；
b.脏支，包括：支气管支、心包支、食管支；
②腹主动脉
a.壁支，包括：膈下动脉、腰动脉、骶正中动脉；
b.脏支，成对的脏支：肾上腺中动脉、肾动脉、睾丸动脉；
不成对的脏支：腹腔干、肠系膜上动脉、肠系膜下动脉；
6.盆部的动脉
①髂总动脉，包括：髂内动脉、髂外动脉；
②髂内动脉
a.壁支，包括：髂腰动脉、骶外侧动脉、臀上动脉、闭孔动脉；
b.脏支，包括：膀胱下动脉、直肠下动脉、子宫动脉、阴部内动脉；
③髂外动脉，包括：腹壁下动脉、旋髂深动脉；
7.下肢的动脉
①股动脉，包括：股深动脉、腹壁浅动脉、旋髂浅动脉；
②腘动脉，包括：胫前动脉、胫后动脉；
③胫前动脉
④胫后动脉，包括：腓动脉、足底内侧动脉、足底外侧动脉；
⑤足背动脉，包括：弓状动脉、足底深支、第一趾背动脉、足底弓；
⑥足底弓
其中，静脉包括：
1.肺循环的静脉，包括：左肺上、下静脉，右肺上、下静脉；
2.体循环的静脉
①上腔静脉系
a.头臂静脉(椎静脉、胸廓内静脉、甲状腺下静脉、肋间最上静脉)
b.头颈部的静脉：
I.颈内静脉(颅骨、脑、面、浅部和颈部大部分区域的静脉)即：颅内属支和颅外属支(面静脉、下颌后静脉、舌静脉、咽静脉、甲状腺上、中静脉)；II.颈外静脉；III.锁骨下静脉
C.上肢的静脉，包括：上肢的浅静脉(头静脉、贵要静脉、肘正中静脉)；上肢的深静脉(腋静脉)
d.胸部的静脉，包括：胸腹壁静脉、奇静脉、半奇静脉、副半奇静脉、脊柱的静脉(椎内静脉丛、椎外静脉丛)
②下腔静脉系
a.下腔静脉；b.髂总动脉：(髂内静脉、髂外静脉)；c.下肢的静脉，包括：下肢浅静脉(小隐静脉、大隐静脉)；下肢深静脉(腘静脉)；d.下腔静脉的属支，包括：壁支(膈下静脉、腰静脉)；脏支(睾丸静脉、卵巢静脉、肾静脉、肾上腺静脉、肝静脉)；e.肝门静脉系统，肝门静脉的主要属支(肠系膜上、下静脉、胃左、右静脉、胆囊静脉、附脐静脉)。
在上述研究的基础上，本发明还提供了所述的方法制得的动物源性血管材料。
本发明还提供了所述的动物源性血管材料在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用。
在上述研究的基础上，本发明还提供了组合物，包括本发明所述的动物源性血管材料以及医学或药学上可接受的活性分子或活细胞，所述活性分子包括生长因子；所述活细胞包括干细胞。
本发明还提供了所述的组合物在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用。
本发明提供了一种血管材料的制备方法，以及由此方法制备的生物材料及其用途。(1)“基因编辑技术”，通过基因编辑技术获得低免疫原性动物，采集血管得到低免疫原性血管原材料，即通过基因编辑技术从材料来源上降低动物源性血管材料的免疫原性；(2)“渐次脱细胞技术”，不同于常规方法(如高浓度试剂一次性脱细胞)，采用“少量多次”的原则进行脱细胞处理，比如，通过多次循环使用中性蛋白酶溶液浸泡、十二烷基硫酸钠(SDS)溶液浸泡、反复冻融、超声等步骤脱除血管原材料中的细胞、多糖等活性成分，降低其免疫原性，同时尽量减少处理过程中对血管材料生物活性等影响；(3)“渐次交联技术”，不同于常规方法(如高浓度交联剂一次性交联)，通过低浓度交联剂多次交联，封闭血管材料中的抗原活性位点降低其免疫原性。利用本发明加工制备的血管材料，不含活细胞，通过基因编辑技术从原材料源头降低其免疫原性，使用优化的脱细胞处理技术和交联技术进一步降低其免疫原性，减小对生物活性的影响。本发明的血管材料用于临床需求，在使用过程中可以结合活性分子和/或活细胞。
本发明血管材料的制备方法，涉及基因编辑技术，与常规方法不同(通过物理、化学、生物方法对既有动物组织/器官进行处理)，基因编辑技术是对目标基因进行定点“编辑”，实现对特定DNA片段的修饰，从血管材料的源头(采集动物)降低其免疫原性。此过程中，根据血管材料的特点，经过筛选确定编辑系统、目标基因、动物种类等，其中目标基因范围包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2和PERV等敲除基因，以及hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI和EPCR等转入基因。以GGTA1为例，当动物源性血管材料中残留的异种抗原进入人体内时，会引发超急性免疫排斥反应，这种免疫排斥反应的主要靶抗原被认为是由存在于动物组织中的a-Gal抗原引起的，a-Gal抗原存在于除人和高等灵长动物以外的大部分哺乳动物体内；通过基因编辑技术开发a-Gal抗原敲除(GTKO)动物源性血管材料，可以明显降低其免疫原性。
另一方面，本发明动物源性血管材料的制备方法，涉及脱细胞技术和交联技术，与常规方法不同(如高浓度SDS溶液单次脱细胞或高浓度戊二醛单次交联)，根据基因编辑技术降低其免疫原性的效果，将优化脱细胞处理和交联处理，比如，低浓度SDS溶液多次脱细胞或低浓度戊二醛多次交联，通过温和的处理方式尽量减小处理过程中对材料生物活性等影响。
因此，本发明提供的血管材料及其制备方法和用途具有重要的现实意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示实施例1与对比例1的免疫组化检测结果；
图2示示实施例1与对比例1的组织相容性检测结果；
图3示实施例2与对比例2的免疫组化检测结果；
图4示示实施例2与对比例2的组织相容性检测结果；
图5示实施例3与对比例3的免疫组化检测结果；
图6示示实施例3与对比例3的组织相容性检测结果。
具体实施方式
本发明公开了一种血管材料及其制备方法和用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供了一种血管材料免疫原性的制备方法，包括如下步骤：
a.繁育基因编辑动物；
b.采集所述动物的血管作为原材料；
c.将原材料进行多次循环处理，比如，处理方式包括超声、中性蛋白酶溶液浸泡、十二烷基硫酸钠(SDS)溶液浸泡；
d.将处理后材料多次浸没于交联剂溶液中。
在一些实施例中，所述基因编辑技术包括巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)和成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统中的至少一种。
在一些实施例中，所述基因编辑技术包括基因敲除和基因转入两种，其中，敲除的基因包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2和PERV中的至少一种，转入的基因包括hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI和EPCR中的至少一种。
在一些实施例中，所述动物包括猪、牛、羊、马、猴、狗、兔、鸡、鼠、蚕、鱼、海洋生物、驴中的至少一种；所述动物为基因编辑后稳定传代3代以上的动物，进一步的，选用基因编辑后稳定传代6代的动物。
在一些实施例中，所述超声处理中低频频率范围为10～40KHz，低频处理时间为5min～24h，高频频率范围为60～120KHz，高频处理时间为5min～24h，超声功率为100W～10KW，超声温度为0～40℃；所述中性蛋白酶处理中中性蛋白酶浓度范围为0.001～5wt.％，酶活为800～10000U/g；处理温度为10～40℃，振荡频率为50～3000rpm，处理时间为0.5～24h；所述SDS处理中SDS浓度范围为0.001～5wt.％，振荡频率为100～3000rpm，处理温度为0～40℃，处理时间为0.5～24h；所述多次循环处理是将上述处理方法进行组合使用，每种处理方法的使用次数为0～10次。
在一些实施例中，所述交联剂包括化学交联剂和生物交联剂中的至少一种；进一步的，化学交联剂包括醛类、亚氨酸酯类、N-羟基琥珀酰亚胺酯类(NHS酯)、马来酰亚胺类、卤乙酰基类、二硫代联吡啶、酰肼类、碳二亚酰胺类中的至少一种；更进一步的，醛类包括戊二醛、多聚甲醛中的至少一种；生物交联剂包括原花青素、京尼平中的至少一种；交联剂浓度范围为0.00001～5wt.％，浸没温度为0～40℃，单次浸没时间为0.5～12h，浸没次数为1～10次。
本发明还提供了所述的方法制备的动物源性血管材料。
本发明还提供了所述的血管材料在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用，在使用过程中可以结合活性分子和/或活细胞，活性分子包括生长因子；活细胞包括干细胞。
本发明提供的血管材料及其制备方法和用途中所用试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
一种猪源血管材料及其制备方法和在血管再生中的应用。
制备方法如下：
a.通过Meganuclease系统基因编辑制备敲除GGTA1的猪，使用稳定传代6代的基因编辑猪；
b.采集基因编辑猪的血管作为原材料；
c.将血管原材料进行如下处理：
c1.浸没于0.1wt.％中性蛋白酶溶液中，温度为37℃，震荡频率为1000rpm，处理时间为6h；
c2.浸没于超声波清洗器中，60KHz处理8h，功率4KW，温度为30℃；
c3.浸没于0.01wt.％SDS溶液中10h，震荡频率为700rpm，温度为20℃；
c4.浸没于超声波清洗器中，90KHz处理3h，功率5KW，温度为20℃；
c5.浸没于0.0001wt.％SDS溶液中8h，振荡频率为1000rpm，温度为30℃；
c6.超声波清洗，80KHz处理10h，功率6KW，温度为20℃。
d.浸没于0.0001wt.％京尼平溶液中10h，浸没温度为37℃，重复浸没5次；
浸没于0.005wt.％戊二醛溶液中12h，浸没温度为25℃，重复浸没3次。
通过以上步骤制备的猪血管材料，用于腹主动脉血管再生。
对比例1
采集普通猪血管。脱细胞处理为：浸没于5wt.％SDS溶液中24h，振荡频率为1000rpm，温度为25℃。交联处理为：浸没于1wt.％戊二醛溶液中6h，浸没温度为25℃。
效果例1免疫原性测试
1.1Gal含量检测：通过人α半乳糖苷酶(αGAL)ELISA试剂盒定量检测样品中Gal含量。
结果如下：
参照行业标准《组织工程医疗器械产品动物源性支架材料残留αGal抗原检测》(YY/T1561-2017)中的方法,按照中检院器械所质量评价室的“动物源医疗器槭中残留α-Gal抗原含量和Gal抗原清除率检测标准操作规范”(NIFDC-SOP-F-T-3001)进行检测，敲除GGTA1的猪(GTKO猪，实施例1用猪)血管样品的Gal抗原含量低于最低检测限(湿重)，对照组野生猪(对比例1用猪)Gal抗原含量为4.74±1.93×1014个/mg(湿重)，最低检测限为0.03125(相对于Gal-BSA)ug/mL(相当于8.25×1011个抗原表位/每个反应)。说明实施例1样品具有更低的免疫原性。
1.2免疫组化检测：在大鼠皮下植入样品，经特定时间后，处死实验大鼠，取出植入材料以及周围皮肤组织，用4wt.％多聚甲醛固定液固定，用CD68单抗做免疫组化染色。
结果如图1所示：
CD68单抗进行免疫组化染色，主要标识由于免疫排斥反应测试样品中出现的巨噬细胞(深棕色)。结果表明，经过1个月大鼠皮下植入，实施例1样品基本没有发现巨噬细胞，而对比例1发现大量巨噬细胞，说明实施例1样品的免疫原性远远低于对比例1。
效果例2生物活性测试
2.1组织相容性检测：将样品植入大鼠肌肉内，经特定时间后，处死实验大鼠，取出植入材料以及周围肌肉组织，用4wt.％多聚甲醛固定液固定，进行HE染色。
结果如图2所示：
HE染色表明，经过1个月大鼠肌肉植入，实施例1样品和周围肌肉组织完全融合，细胞进入样品生长，而对比例1样品和周围肌肉组织有明显界限，说明实施例1样品的生物活性更好。
实施例2
一种猴源血管材料及其制备方法和在神经再生中的应用。
制备方法如下：
a.通过TALEN系统基因编辑制备敲除GGTA1、转入hCD46的猴，使用稳定传代3代的基因编辑猴；
b.采集基因编辑猴的血管作为原材料；
c.将血管原材料进行如下处理：
浸没于5wt.％中性蛋白酶溶液中，温度为37℃，振荡频率为500rpm，处理时间为12h；酶活为800U/g；
超声波清洗，120KHz处理12h，功率10KW，温度为40℃；
浸没于0.001wt.％SDS溶液中24h，振荡频率为1000rpm，温度为40℃；
超声波清洗，120KHz处理12h，功率4KW，温度为40℃；
浸没于0.0001wt.％SDS溶液中12h，振荡频率为100rpm，温度为10℃；
超声波清洗，60KHz处理12h，功率10KW，温度40℃。
d.浸没于1wt.％京尼平溶液中6h，浸没温度为40℃，重复浸没10次；
浸没于0.005wt.％戊二醛溶液中12h，浸没温度为25℃，重复浸没4次。
通过以上步骤制备的猴血管材料，用于神经再生。
对比例2
采集普通猴血管。脱细胞处理为：浸没于10wt.％SDS溶液中12h，振荡频率为600rpm，温度为25℃。交联处理为：浸没于5wt.％戊二醛溶液中12h，浸没温度为25℃。
效果例3免疫原性测试
3.1免疫组化检测：在大鼠皮下植入样品，经特定时间后，处死实验大鼠，取出植入材料以及周围皮肤组织，用4wt.％多聚甲醛固定液固定，用CD3单抗做免疫组化染色。
结果如图3所示：CD3单抗进行免疫组化染色，主要标识由于免疫排斥反应测试样品中出现的T细胞(深棕色)。结果表明，经过1个月大鼠皮下植入，实施例2样品基本没有发现T细胞，而对比例2发现大量T细胞，说明实施例2样品的免疫原性远远低于对比例2。
效果例4生物活性测试
4.1组织相容性检测：将样品植入大鼠肌肉内，经特定时间后，处死实验大鼠，取出植入材料以及周围肌肉组织，用4wt.％多聚甲醛固定液固定，进行HE染色。
结果如图4所示：HE染色表明，经过1个月大鼠肌肉植入，实施例2样品和周围肌肉组织完全融合，细胞进入样品生长，而对比例2样品和周围肌肉组织有明显界限，说明实施例2样品的生物活性更好。
实施例3
一种牛源血管材料及其制备方法和在血管再生中的应用。
制备方法如下：
a.通过CRISPR/Cas系统基因编辑制备敲除GGTA1的牛，使用稳定传代4代的基因编辑牛；
b.采集基因编辑牛的血管作为原材料；
c.将血管原材料进行如下处理：
浸没于0.001wt.％中性蛋白酶溶液中，温度为10℃，振荡频率为600rpm，处理时间为8h；酶活为2000U/g；
超声波清洗，50KHz处理8h，功率9KW，温度为37℃；
浸没于0.005wt.％SDS溶液中10h，振荡频率为600rpm，温度为25℃；
超声波清洗，80KHz处理10h，功率6KW，温度为35℃；
浸没于0.0008wt.％SDS溶液中25h，振荡频率为300rpm，温度为10℃；
超声波清洗，120KHz处理5h，功率8KW，温度为10℃。
d.浸没于0.00005wt.％京尼平溶液中12h，浸没温度为25℃，重复浸没10次。
浸没于0.01wt.％戊二醛溶液中12h，浸没温度为40℃，重复浸没2次。
通过以上步骤制备的牛血管材料，用于血管再生。
对比例3
采集普通牛血管。脱细胞处理为：浸没于8wt.％SDS溶液中10h，振荡频率为600rpm，温度为25℃。交联处理为：浸没于3wt.％戊二醛溶液中24h，浸没温度为25℃。
效果例5免疫原性测试
5.1免疫组化检测：在大鼠皮下植入样品，经特定时间后，处死实验大鼠，取出植入材料以及周围皮肤组织，用4wt.％多聚甲醛固定液固定，用CD3单抗做免疫组化染色。
结果如图5所示：CD3单抗进行免疫组化染色，主要标识由于免疫排斥反应测试样品中出现的T细胞(深棕色)。结果表明，经过1个月大鼠皮下植入，实施例3样品基本没有发现T细胞，而对比例3发现大量T细胞，说明实施例3样品的免疫原性远远低于对比例3。
效果例6生物活性测试
6.1组织相容性检测：将样品植入大鼠肌肉内，经特定时间后，处死实验大鼠，取出植入材料以及周围肌肉组织，用4wt.％多聚甲醛固定液固定，进行HE染色。
结果如图6所示：HE染色表明，经过1个月大鼠肌肉植入，实施例3样品和周围肌肉组织完全融合，细胞进入样品生长，而对比例3样品和周围肌肉组织有明显界限，说明实施例3样品的生物活性更好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种血管材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、繁育基因编辑动物；
步骤2、采集步骤1动物的血管作为原料；
步骤3、取步骤2制得的所述原料脱细胞；
步骤4、取步骤3制得的材料交联化；
其中，步骤3具体为：
浸没于0.001～5wt.％中性蛋白酶溶液中，温度为0～40℃，振荡频率为500～1000rpm，处理时间为2～12h；酶活为800～10000U/g；
超声波清洗，20～120KHz处理2～12h，功率4～10KW，温度为0～40℃；
浸没于0.001～5wt.％SDS溶液中2～24h，振荡频率为100～1000rpm，温度为0～40℃；
超声波清洗，40～120KHz处理2～12h，功率4～10KW，温度为0～40℃；
浸没于0.0001～1wt.％SDS溶液中2～12h，振荡频率为100～1000rpm，温度为10～40℃；
超声波清洗，60～120KHz处理2～12h，功率4～10KW，温度为0～40℃；
步骤4具体为：
浸没于0.00001～2wt.％京尼平溶液中1～12h，浸没温度为25～40℃，重复浸没1～10次；
浸没于0.005～5wt.％戊二醛溶液中1～12h，浸没温度为25～40℃，重复浸没1～5次。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述基因编辑包括巨型核酸酶(Meganuclease)、锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活样效应因子核酸酶(TALEN)或成簇规律间隔短回文重复(CRISPR/Cas)系统中的至少一种。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述基因编辑包括基因敲除和/或基因转入；
所述基因敲除中敲除的基因包括GGTA1、CMAH、β4GalNT2或PERV中的至少一种；
基因转入中转入的基因包括hCD46、hCD55、hCD47、LEA29Y、hTBM、hTFPI或EPCR中的至少一种。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，所述动物包括猪、牛、羊、马、猴、狗、兔、鸡、鼠、蚕、鱼、海洋生物、驴中的至少一种；所述动物为基因编辑后稳定传代3代以上的动物；优选的，选用基因编辑后稳定传代6代的动物。
5.如权利要求1至4任一项所述的方法制得的动物源性血管材料。
6.如权利要求5所述的动物源性血管材料在制备组织工程材料、再生医学材料、转化医学材料中的应用。
7.组合物，其特征在于，包括如权利要求5所述的动物源性血管材料以及医学上可接受的辅料。
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