TWI389696B - 人工腎臟前驅物及其製造方法 - Google Patents

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Description

人工腎臟前驅物及其製造方法
本發明係關於人工腎臟前驅物及其製造方法。
腎臟為紅血球生成素(erythropoietin)之主要產生器官，由於腎衰竭時紅血球生成素的產生降低，因而發生腎性貧血之合併症。
近年來，做為該腎性貧血之新世代的治療方法，已有提案經由再生醫療技術製造具有紅血球生成素產生能力之人工腎臟或其前驅物，然後將該人工腎臟或其前驅物移植至腎性貧血患者的方法。例如，專利文獻1中，揭示將分取源自哺乳動物之間葉系幹細胞(mesenchymal stem cells)移植至妊娠哺乳動物宿主中的胎兒或由妊娠哺乳動物宿主所分離之胎兒，經由誘導該間葉系幹細胞的分化而產生紅血球生成素之類器官(organoid)(人工腎臟)的前驅物的製造方法，產生紅血球生成素之類器官前驅物的製造方法之特徵為該間葉系幹細胞的移植部位為胎兒的腎形成部位，移植時期為宿主免疫系統仍在免疫耐受(immune tolerance)的階段。
然而，該方法中，對患者移植人工腎臟前驅物之前，必須即時採樣妊娠哺乳動物的羊水，確認該前驅物的生物學安全性，因此該操作有繁雜的問題。再者，由於間葉系幹細胞必須注入於成為胎兒未來腎臟之適當部位，因此該操作必須熟練。由於必須斟的於宿主免疫系統仍為免疫耐受的階段對胎兒注入間葉系幹細胞，因此缺乏治療整體排程的彈性。於該方法中，必須進行全胚胎培養，難以獲得具功能性之人工腎臟前驅物，會發生經由培養之污染風險，培養後需要繁雜的精製操作。
因此，期望1)在患者移植前，可容易地檢查人工腎臟前驅物的生物學安全性，2)操作簡易，3)可確保治療整體排程的彈性，而且4)不需要培養操作之人工腎臟前驅物的製造方法的開發。
[先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]國際公開第2008/004598號公報
本發明之目的係提供1)在患者移植前，可容易地檢查人工腎臟前驅物的生物學安全性，2)操作簡易，3)可確保治療整體排程的彈性，而且4)不需要培養操作之人工腎臟前驅物的製造方法。
為達成上述目的而致力研究的結果發現，將由胎兒摘取之後腎予以凍結‧融解，於經融解之後腎中，經由移入源自患者之間葉系幹細胞，可得人工腎臟前驅物，經由使用該人工腎臟前驅物可解決上述課題，因而完成本發明。
亦即，本發明係關於下述者。
[1]一種人工腎臟前驅物，為活體外所摘取之非人類哺乳動物的後腎所成之人工腎臟前驅物，該後腎係於活體外經施行凍結及融解之處理者，且包含於活體外所移入之哺乳動物的間葉系幹細胞。
[2]該後腎為MHC的表現仍為未成熟階段之哺乳動物胚胎的後腎之[1]所記載之人工腎臟前驅物。
[3]經移植至哺乳動物的大網膜(greater omentum)時可獲得紅血球生成素產生能力之[1]所記載之人工腎臟前驅物。
[4]一種人工腎臟前驅物之製造方法，包含以下的步驟：
(I)將活體外所摘取之哺乳動物後腎予以凍結；
(II)將經凍結之哺乳動物後腎予以融解；以及
(III)於(I)之凍結前或(II)之融解後，將哺乳動物之間葉系幹細胞於活體外移入至後腎內。
[5](I)所使用之後腎，係由MHC的表現仍為未成熟階段之哺乳動物的胚胎於活體外所摘取之後腎之[4]所記載之方法。
[6]人工腎臟前驅物經移植至哺乳動物的大網膜時可獲得紅血球生成素產生能力之[4]所記載之方法。
使用本發明之方法，可於移植前容易地檢查人工腎臟前驅物之生物學安全性。另外，使用本發明之方法，可以簡易的操作製造人工腎臟前驅物。再者，使用本發明之方法，經由使用經凍結保存之後腎，可以依照所期望之時間排程製造人工腎臟之前驅物，因而可彈地設計治療整體排程。再者，由於本發明之方法實質上不需要培養操作，無污染風險，不需要培養後之繁雜的精製操作。
本發明係提供人工腎臟前驅物，為活體外所摘取之非人類哺乳動物的後腎所成之人工腎臟前驅物，該後腎係於活體外經施行凍結及融解者，且包含於活體外所移入之哺乳動物的間葉系幹細胞。
本發明中，「人工腎臟」非單一細胞，而是細胞組織體，意指具有腎臟原有功能之紅血球生成素產生能力者。本發明中之「人工腎臟」可不具有過濾血液中的老舊廢物或水分而排尿之功能。人工腎臟，除其表面外，各細胞係互相呈三維的接觸，藉由鄰接細胞係藉由各種細胞間結合而進行資訊交換，不僅產生紅血球生成素，亦具有紅血球生成素產生之調整能力。
「前驅物」意指經由放置於活體內而轉換為人工腎臟之組織。「前驅物」雖具有紅血球生成素之產生能力及產生之調整能力的必需因子，但根據環境的因素，有可能成為無法發揮紅血球生成素之產生之能力及產生調整能力的狀態。將人工腎臟前驅物移植至哺乳動物的大網膜時，可獲得紅血球生成素產生能力。
「紅血球生成素產生之調整能力」意指當接受者(患者)體內需要比較多的紅血球生成素為正常狀態時(貧血時等)，可產生多量(改善貧血所需要的量)的紅血球生成素，當接受者(患者)為正常狀態時(貧血經改善等)，可產生用於保持體內正常狀態所需要量之紅血球生成素的能力。亦即，本發明之人工腎臟，與以往之紅血球生成素產生細胞相比較，於接受者(患者)可產生所需要量之紅血球生成素方面，以及可經由自大網膜中的血管攝入必須的營養而長時間持續產生紅血球生成素方面較為優異。
本發明中，「後腎」意指哺乳動物之胚胎中，腎臟發生之對應部位。本發明中所使用之後腎，較佳為腎臟的胚母細胞係處於發育開始前的萌芽狀態。後腎係位於哺乳動物胚胎之尿管芽體(ureteric buds)發芽部位的周圍，更詳而言之，係位於體節與側板之間的位置。後腎較佳為後腎形成中胚層。
作為後腎來源之哺乳動物，例如，可列舉小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等齧齒類或兔等實驗動物，豬、牛、山羊、馬、綿羊、貂等家畜，犬、貓等寵物，人、猴、紅毛猩猩、猿、猩猩、黑猩猩等靈長類等。哺乳動物較佳為大鼠或豬。
後腎係由哺乳動物之胚胎，於活體外摘取。作為該胚胎，較適合使用MHC(主要組織相容性複合體)的表現仍為未成熟者。經由使用該時期之後腎，可迴避於接受者之人工腎臟前驅物經移植時之免疫反應。胚胎為靈長類以外的哺乳動物時，較好於異種抗原(α-gal等糖鏈抗原)出現以前摘取。例如，於使用大鼠的實驗中，通常使用E(胚胎日階段)為9至16，較佳E為10至15，更佳E為11制14之胚胎。其它的哺乳動物中，可適宜地使用同樣階段的胚胎。然而，其前後的階段，亦可根據選定的條件而適用。胚胎之後腎的摘取亦可使用實體顯微鏡等進行。
後腎的凍結處理係於凍結哺乳動物之組織或細胞時通常使用之凍結保存液中進行。該凍結保存液通常包含DMSO、甘油等凍結保護劑。凍結保護劑的濃度通常為5至30重量%，較佳為10至20重量%。該保存劑亦可含有血清。血清的濃度通常為5至50重量%，較佳為10至30重量%。較佳之保存凍結液可例舉如含有DMSO及FCS之ET-KYOTO液、Cellbanker(註冊商標)等。
經由凍結後腎，可抑制接受者(患者)於人工腎臟前驅物移植時之免疫反應。
經凍結之後腎，可在凍結之狀態下半永久保存，必要時可融解、復甦而使用。凍結時的保存溫度通常為-80至-200℃，較佳為-196℃(液態氮中)。經由後腎之凍結保存，可於所期望之時期製造人工腎臟前驅物，可彈性地設計治療整體排程。
經凍結之後腎，根據常法於生理培養液中進行融解處理。融解的方法並無特別限定，例如，使凍結管浮在37℃的恆溫槽中，或對經凍結之後腎滴下生理培養液而融解。為了去除凍結保存液的混入，較好將經融解之後腎以生理培養液洗淨。
本發明之人工腎臟前驅物所使用之後腎，包含於活體外所移入之哺乳動物的間葉系幹細胞。
「間葉系幹細胞」係以未分化的狀態增生，廣義地意指可分化成為成骨細胞(osteoblast)、軟骨原細胞(chondroblast)以及脂肪母細胞(adipoblast)等之全部或部分之幹細胞或其前驅細胞之群組。本發明所使用之間葉系幹細胞具有分化為腎臟之紅血球生成素產生細胞的分化能力。
間葉系幹細胞來源之哺乳動物，例如，可列舉小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等齧齒類或兔等實驗動物，豬、牛、山羊、馬、綿羊、貂等家畜，犬、貓等寵物，人、猴、紅毛猩猩、猿、猩猩、黑猩猩等靈長類等。哺乳動物較佳為大鼠或人類。
間葉系幹細胞來源之哺乳動物較佳為與本發明之人工腎臟前驅物移植之接受者為相同動物種。最佳為使用接受者本身的間葉系幹細胞。
間葉系幹細胞可使用公知的一般方法自哺乳動物之骨髓液、末梢血液、臍帶血等採樣。例如，經由骨髓穿刺後之造血幹細胞等的培養、繼代，可單離人類間葉系幹細胞(Journal of Autoimmunity,30(2008)163-171)。
由活體所單離之間葉系幹細胞，經由於適當的培養基中貼壁培養(attachemnt culture)，在維持其分化能力下，可於活體外擴增。此方式之於活體外所擴增之間葉系幹細胞亦屬本發明之範圍。培養基可使用例如DMEM、EMEM、RPMI-1640、F-12、α-MEM、MSC growth medium(Bio Whittaker)等。培養溫度通常約30至40℃的範圍，較佳為約37℃。CO2 濃度通常為約1至10%的範圍，較佳為約5%。濕度通常為約70至100%的範圍，較佳為約95至100%。為了維持高分化能力，培養較佳不為2至5繼代以上。
對後腎之間葉系幹細胞的移入，係於後腎之凍結前或融解後進行。例如，於實體顯微鏡下使用微量吸管(micropipette)，將間葉系幹細胞注入後腎內。移入之細胞數可根據後腎的大小為基準而適宜設定，關於1個後腎，通常注入約104 至106 個(例如5×104 個)左右的間葉系幹細胞。
移入時，雖亦可使用懸濁於生理培養液之間葉系幹細胞，但從凍結保存後之穿刺時細胞內液漏出防止的觀點而言，較好是使用經封入於含有細胞外基質成份(層黏連蛋白(laminin)、膠原蛋白IV型、內動素(entacin)、硫酸乙醯肝素蛋白多醣(Heparan Sulfate Proteoglycans)、Matrigel(註冊商標)等)之凝膠中的間葉系幹細胞。
本發明之人工腎臟前驅物的大小，不需要與紅血球生成素產生器官之腎臟的大小相近，為腎臟整體的1/50至1/10的大小就足夠。
本發明之人工腎臟前驅物，可經由進行以下的操作而製造：
(I)將活體外所摘取之哺乳動物後腎予以凍結；
(II)將經凍結之哺乳動物後腎予以融解；以及
(III)於(I)之凍結前或(II)之融解後，將間葉系幹細胞於活體外移入至後腎內。
各用語的定義及操作的詳細說明係如前文所述。
根據上述操作所得本發明之人工腎臟前驅物亦可進行器官培養，但從無污染風險、不需要培養後之繁雜的精製操作而言，較好是不進行器官培養。本發明之人工腎臟前驅物，即使不進行該方式之器官培養的操作，在移植於哺乳動物內時，亦可獲得充分的紅血球生成素產生能力及產生調整能力，此方面相當優異。又，器官培養時，可將人工腎臟前驅物置於過濾器上，於其下之碟盤中加入適當培養基，經由將碟盤靜置於培養箱內而進行。
本發明之人工腎臟前驅物移植至接受者哺乳動物活體內時，該前驅物即於接受者活體內著生，包含於該前驅物內之間葉系幹細胞增生，分化為腎臟之紅血球生成素產生細胞。其結果，人工腎臟前驅物分化為具有紅血球生成素產生能力及產生調整能力之人工腎臟，經由自血管攝入必須營養，可長時間持續於活體內產生紅血球生成素。因此，本發明之人工腎臟前驅物可用於紅血球生成素相關疾患的治療用。經由將本發明之人工腎臟前驅物移植至哺乳動物，於該哺乳動物中可治療紅血球生成素相關疾患。
本發明中，「紅血球生成素相關疾患」包含相關於腎衰竭、糖尿病、潰瘍、癌、感染、透析、手術以及化學療法之貧血，為相關於紅血球生成素產生量降低的疾患。特別是在因慢性腎衰竭所致之貧血的情況中，由於進行性的腎實質及肝功能破壞而無法產生紅血球生成素，使循環中的紅血球生成素濃度無法增加而造成大問題。
作為接受者哺乳動物，例如，可列舉小鼠、大鼠、倉鼠、豚鼠等齧齒類或兔等實驗動物，豬、牛、山羊、馬、綿羊、貂等家畜，犬、貓等寵物，人、猴、紅毛猩猩、猿、猩猩、黑猩猩等靈長類等。接受者哺乳動物較佳為大鼠或人類。
關於本發明之人工腎臟前驅物移植至哺乳動物的方法，只要能使該前驅物著生於接受者活體內，該前驅物可獲得紅血球生成素產生能力及產生調整能力即可，並無特別限制，較佳為將本發明之人工腎臟前驅物移植至接受者哺乳動物的大網。移植至大網的方法可採用一般的外科處方進行，例如，可列舉以銳利的鑷子抓取移植組織，以鑷子的尖端於大網的脂肪組織表面稍微製作切口，於其中埋入組織的方法。再者，可利用內視鏡移植至大網。
本發明之人工腎臟前驅物的投予量，雖根據投予對象、對象疾患、症狀等而有差異，通常，於成人之腎性貧血患者(體重為60kg)移植由豬的後腎所製造之人工腎臟前驅物時，於1次手術中移植10個左右的後腎，必要時一邊觀察患者的貧血程度而階段性的增加移植個數較適宜。其他動物的情況中，可移植相當於60kg換算的移植量。
以下，經由揭示實施例具體說明本發明，但本發明不因以下所揭示之實施例而有任何限定。
[實施例]
自妊娠第14日之大鼠胚胎摘取後腎後，於ET-Kyoto+10%DMSO+20%FCS中凍結保存。直徑為2mm左右。
凍結保存2日後，將凍結之後腎融解。將大鼠間葉系幹細胞以基質凝膠包覆，於1個後腎中打入1×104 個。之後，將後腎移植至相同大鼠系之大網。
移植7日後，自移植後腎之大鼠摘取已成長之後腎。移植個體為2隻，各別成長之後腎於7個中分別為3個及6個。後腎直徑成長為6至8mm。將經過發育之人工腎臟前驅物，依照Transplantation Vol 85,No 11,June 15,2008相同的方法進行分析，亦即藉由紅血球生成素產生細胞的免疫染色及基因解析，確認有紅血球生成素的產生。
 [產業上可利用性]
使用本發明之方法，可於移植前容易地檢查人工腎臟前驅物之生理學安全性。使用本發明之方法，可藉簡易的操作製造人工腎臟前驅物。再者，使用本發明之方法，經由使用經凍結保存之後腎，可依照所期望之時程製造人工腎臟前驅物，因而可彈性地設計治療整體排程。進一步地，本發明的方法由於實質上不需要培養操作，因而無污染風險，且不需要培養後之繁雜的精製操作。
本申請案係以於日本所申請之特願2008-173935(申請日：2008年7月2日)為基礎，其內容全部包含於本說明書中。

Claims (6)

  1. 一種人工腎臟前驅物，為由非人類哺乳動物之胚胎，於活體外所摘取之非人類哺乳動物的後腎所成之人工腎臟前驅物，該後腎係於活體外經施行凍結及融解之處理者，且包含於該胚胎之活體外所移入之哺乳動物的間葉系幹細胞。
  2. 如申請專利範圍第1項之人工腎臟前驅物，其中，該後腎為MHC的表現仍為未成熟階段之非人類哺乳動物胚胎的後腎。
  3. 如申請專利範圍第1項之人工腎臟前驅物，其中，經移植至哺乳動物的大網膜(greater omentum)時可獲得紅血球生成素產生能力。
  4. 一種人工腎臟前驅物之製造方法，包含以下的步驟：(I)將由非人類哺乳動物之胚胎，於活體外所摘取之非人類哺乳動物後腎予以凍結；(II)將經凍結之非人類哺乳動物後腎予以融解；以及(III)於(I)之凍結前或(II)之融解後，將哺乳動物之間葉系幹細胞於該胚胎之活體外移入至後腎內。
  5. 如申請專利範圍第4項之方法，其中，(I)所使用之後腎係由MHC的表現仍為未成熟階段之非人類哺乳動物的胚胎於活體外所摘取之後腎。
  6. 如申請專利範圍第4項之方法，其中，該人工腎臟前驅物經移植至哺乳動物的大網膜時可獲得紅血球生成素產生能力。
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