JP6636956B2 - ヒト肝臓スキャフォールド - Google Patents

Description

本発明は、例えば、治療法、薬物スクリーニング、バイオマーカー同定、又は疾患モデリングにおける使用に対する、ヒト肝細胞外マトリクス（ＥＣＭ）スキャフォールドの製造に関する。

生体組織工学は、臓器の機能を回復することによって世界中の数百万の人々の生活の質を改善することを目的とする新たに発展しつつある分野である。生体組織工学は、臓器を再生するため、またｉｎ ｖｉｔｒｏで疾患を再現するため、細胞と３Ｄ構造の発生のためのスキャフォールドとを組み合わせる。臓器の機能回復に加えて、生体組織工学は、治療薬及び生物学的製剤のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験、薬物の毒性試験、新たな装置及び介入技術の評価、並びに新たなバイオマーカーの発見に対するプラットフォームを含む重要な生医学的用途を提供することができる。

ヒトの肝臓は、区域（個々の門脈及び動脈の供給、肝静脈、及び胆管ドレナージを含む８つの区域）及び領域（血管柄及び胆管柄（vascular and biliary pedicles：血管茎及び胆管茎）を共有するより多くの区域）と呼ばれる機能的サブユニットに分けられる単一の臓器である。これらの解剖学的特徴は、肝臓切除及び肝臓部分移植の実施において利用され得るいくつかの機能的サブユニットにヒト肝臓を仕切ることを可能とする。ヒト肝臓は、古典的には、門脈及び肝動脈系から順行様式で血液により灌流される（すなわち、血液は肝静脈系から排出され、胆汁は胆管系によって肝臓により排泄される）。

肝臓は、解毒、タンパク質合成、消化に必要な生化学物質の産生、並びに糖代謝及び脂質代謝における主要な役割を含む幅広い機能を有する。肝臓は生存に必要であり、長期にわたって肝機能の欠如を補償する方法は今のところ存在しない。この独特の機能は、３Ｄスキャフォールドを構成する細胞外マトリクス（ＥＣＭ）タンパク質のネットワークにおいて厳密に組織された実質細胞及び非実質細胞によって編成される。

ウイルス感染、アルコール、及び他の状態に起因する肝疾患は増加しつつあり、現在、毎年、英国で１００００名、米国で３２０００名の死亡をもたらしている。肝臓移植は進行した急性又は慢性の肝疾患に対する唯一の有効な治療であり、優れた長期生存及び生活の質と関連する。しかしながら、利用可能性は制限され、要求が増加しつつある。肝移植に適した人々の１５％〜２５％で待ち時間が増加し、順番待ちリストにある間に死亡するか、又は病状が悪くなりすぎる（becoming too unwell）。人工肝臓の開発は、肝疾患に起因する死を減少し、現在臓器移植を利用できない患者に対する解決策を提供する。

さらに、肝線維症（ＨＦ）及び肝細胞癌（ＨＣＣ）の発症を調査するために使用されるモデルはいずれも生得的な問題を有する。したがって、２Ｄ単層の単一細胞培養物又は共培養物における研究は、大半のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究の根幹をなすが、現実とは大きくかけ離れている。さらに、ヒト疾患と多くの性質を共有するものの、大半の動物モデルはヒトと同じ様式の遺伝子発現を共有せず、ｉｎ ｖｉｖｏモデルとしての妥当性は限定される。したがって、ヒト疾患の複雑性を再現するモデルを開発する必要性は満たされていない。

近年、ブタ及びヒツジ等の大型動物の肝臓を使用して、ヒト細胞との再増殖（repopulation）に対して使用される好適なスキャフォールドを得る可能性が評価されてきた。しかしながら、肝臓の代謝能力における生得的な相違以外に、細胞外ＥＣＭスキャフォールドは、異なる種において明らかに異なる巨視的及び微視的な特徴を有する。特に、ヒト肝臓の区域化及び分葉は、他の種ほど明らかではない。さらに、ヒト肝臓の微視的な小葉の解剖及び構造は独特であり、肝臓小葉間の線維性の境界はヒトには存在しないことから（また、ヒトの小葉の構造は形式上、構造境界を有しない）、ブタ等の他の哺乳動物とは異なる。ブタ肝臓に典型的な線維性の境界の存在は、ヒト細胞との再増殖後、ヒトでの移植におけるブタ肝臓から得られたスキャフォールドの使用に対して重大な問題を提示する。実際、ブタにおける異なる構造は、つなぎ目（bridging）が正常なヒト肝臓におけるフローバリヤ（flow barrier）になりやすいことから、門脈圧亢進をもたらす場合がある。

３ＤヒトＥＣＭタンパク質の組成及び機構を再現する３Ｄヒト肝臓組織のｉｎ ｖｉｔｒｏでの開発は、生体組織工学分野における主な課題の１つである。有望なアプローチは、組織の脱細胞化（decellularisation）のプロセスによる生物学的スキャフォールドの確立を含む。しかしながら、他の著者らによる以前の報告は、ヒト特有であって他の哺乳動物とは特徴的に異なるマクロ構造及びミクロ構造の固有の相違のため３Ｄヒト肝臓スキャフォールドを得ることができなかった。マウス、ラット、フェレット、ヒツジ及びブタの肝臓の脱細胞化が報告されているが、ヒト肝臓の生物学的スキャフォールドの作製の成功を記載する文献は存在しない。

本発明者らは、種々の細胞傷害剤のセットを用いる１又は複数のサイクルの処理を含むレジメン（regimes：レジーム）が、細胞外マトリクスを傷害することなく、ヒト肝臓組織を脱細胞化するために使用され得ることを認識した。これは、ヒト肝臓の細胞外マトリクスの構造及び形態を維持する無細胞スキャフォールドの再現可能な製造に有用な可能性がある。

本発明の１つの態様は、ヒト肝臓スキャフォールドを製造する方法であって、
（ｉ）ヒト肝臓組織を準備することと、
（ｉｉ）上記組織中の細胞を機械的に傷害することと、
（ｉｉｉ）上記組織中の細胞を浸透圧ストレスに供することと、
（ｉｖ）任意に、上記組織をプロテアーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅに暴露することと、
（ｖ）上記組織を洗浄剤に暴露することと、
（ｖｉ）工程（ｉｉｉ）、工程（ｉｖ）及び工程（ｖ）、任意に工程（ｉｉ）の各々を任意の順序で１回又は複数回繰り返すことと、
を含み、それによりヒト肝臓スキャフォールドを製造する、方法を提供する。

幾つかの実施形態では、上記方法は工程（ｉｖ）を含み得る。他の実施形態では、工程（ｉｖ）は省略されてもよい（すなわち、上記方法は工程（ｉｖ）を含まない）。

特許請求の範囲に記載される方法によって製造されたヒト肝臓スキャフォールドは、無細胞ヒト肝臓細胞外マトリクス（ＥＣＭ）（すなわち、該スキャフォールドは脱細胞化されている）からなり、三次元構造及び起源肝臓組織のＥＣＭの生物活性を保持する。

細胞を機械的に傷害した後、肝臓組織を種々の脱細胞化試薬（すなわち、浸透圧ストレス試薬、プロテアーゼ／ＤＮＡａｓｅ、及び洗浄剤）に順次暴露する。工程（ｉｉｉ）、工程（ｉｖ）及び工程（ｖ）、並びに任意に工程（ｉｉ）を任意の順序で１回又は複数回行って、上記スキャフォールドを脱細胞化してもよい。幾つかの実施形態では、肝臓組織を工程（ｉｉｉ）、工程（ｉｖ）及び工程（ｖ）、並びに任意に工程（ｉｉ）のいずれか１つ、２つ、又は３つ全てを任意の順序で含む複数サイクルに暴露してもよい。

幾つかの実施形態では、工程（ｉｉ）を１回又は複数回繰り返してもよい。例えば、工程（ｉｉ）を含む複数サイクルに肝臓組織を暴露してもよい。これは、例えば、超音波処理等の非凍結解凍技法を使用して細胞を機械的に傷害する場合に有用な可能性がある。

肝臓組織を工程（ｉｉｉ）〜工程（ｖｉ）の間にフローせん断応力に供することが好ましい。これは、組織内、例えば肝シヌソイドへの脱細胞化試薬の浸透を促進し、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）から細胞及び細胞片を剥離する。

灌流、撹拌又は陰圧を含む任意の簡便な技法を使用して、肝臓組織においてフローせん断応力を発生させてもよい。フローせん断応力は、灌流又は撹拌によってヒト肝臓組織において発生されることが好ましい。

フローせん断応力の発生に対する技法の選択は、肝臓組織又は用途に依存する場合がある。例えば、全肝臓、単一の肝葉領域、区域又は他の肝構造単位を脱細胞化試薬によって灌流し、フローせん断応力を発生させてもよい。肝臓細胞キューブ（ＬＴＣ）等の小さい肝臓試料を脱細胞化試薬に浸漬して撹拌し、フローせん断応力を発生させてもよい。

本明細書に記載される脱細胞化に対するヒト肝臓組織は、移植における臨床使用に適していないヒト肝臓から得られてもよい。好適な肝臓は、関連する国内法及び倫理指針に従って得られてもよい。

幾つかの実施形態では、肝臓組織は、傷害又は疾患と関連する病状を呈しない正常組織であってもよい。

他の実施形態では、肝臓組織は傷害又は疾患と関連する病状を呈する病的組織であってもよい。例えば、肝臓組織は、脂肪質、線維化、炎症性であってもよく、又は疾患若しくは傷害と関連する１若しくは複数の他の特徴を呈してもよい。幾つかの実施形態では、病的肝臓組織は、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型若しくはＥ型の肝炎等のウイルス性感染症、アルコール若しくは毒物による傷害、肝線維症（ＨＦ）、非アルコール性脂肪性肝疾患、（ＮＡＦＬＤ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、アルコール性肝疾患、虚血性肝炎（ischaemic hepatitis）、巨細胞性肝炎、及び肝細胞癌（ＨＣＣ）等の肝臓癌を含む急性又は慢性の肝炎と関連する病状を呈し得る。代替的には、病的な肝臓組織は、アミロイドーシス等の肝臓を冒す他の疾患と関連する病状を呈し得る。

病的な肝臓組織から製造される肝臓スキャフォールドは、健康な肝臓組織から製造されるスキャフォールドとは異なる構造及び組成を有する場合がある。例えば、病的なスキャフォールドの形態、又はコラーゲン、テネイシン、及びラミニン等のＥＣＭ成分の量若しくは相対量は、健康な肝臓組織と比較して病的な肝臓組織に由来するスキャフォールドにおいて変更される場合がある。これは、疾患モデリングに対して特異的な疾患修飾肝臓スキャフォールドを得るのに有用な可能性がある。

病的な肝臓組織は、肝疾患又は肝臓を冒す疾患（例えば、肝臓傷害又は肝機能の変更を特徴とする疾患）を有する個体から得られてもよい。

本明細書に記載される脱細胞化のために肝臓組織を取得及び保存する方法は当該技術分野でよく知られている。例えば、肝臓を、凝集を予防するためヘパリン処理してもよく、及び／又は解凍後の組織破壊を減少若しくは予防するため凍結保護剤で灌流してもよい。

本明細書に記載される脱細胞化に適したヒト肝臓組織として、全肝臓、又は肝臓の肝葉領域、区域若しくは亜区域、又は小さな試料若しくは切片等の肝機能単位を含む肝臓の一部が挙げられる。

肝臓の一部は、肝葉領域、区域若しくは亜区域等の１又は複数の肝機能単位を含んでもよい。好適な機能単位は、血管柄付（vascularised）であってもよく、及び／又は血管胆管柄（vasculo-biliary pedicle）を含んでもよい。例えば、肝臓組織は、ヒト肝臓のＳ８の亜区域、ヒト肝臓のＳ１〜Ｓ８の１若しくは複数の区域、又は肝臓左外側（Ｓ２＋Ｓ３±Ｓ１）、左肝（Ｓ２＋Ｓ３＋Ｓ４＋Ｓ１）、右肝（Ｓ５＋Ｓ６＋Ｓ７＋Ｓ８）、肝臓右外側（Ｓ６＋Ｓ７）、拡大右肝（Ｓ４＋Ｓ５＋Ｓ６＋Ｓ７＋Ｓ８＋Ｓ１）等の複数区域部分を含んでもよい。幾つかの好ましい実施形態では、肝臓組織はヒト肝臓の左外側（Ｓ２＋Ｓ３±Ｓ１）又は左肝（Ｓ２＋Ｓ３＋Ｓ４＋Ｓ１）の部分であってもよい。

本明細書に記載される脱細胞化される肝臓組織の量及び質量は、スキャフォールドの意図される用途に依存する場合がある。例えば、インプラントにおける使用に対して脱細胞化される肝臓組織の質量は、個体の体重、及び個体における機能性肝臓組織の量に依存する場合がある。

他の実施形態では、上記部分は幅、長さ及び／又は直径が０．２ｃｍ〜２ｃｍ、好ましくは０．２ｃｍ〜１．２５ｃｍ、より好ましくは０．２ｃｍ〜１．０ｃｍの小さな血管柄のない肝臓切片又はウェッジ（wedge）（例えば、０．００８ｃｍ^３〜２ｃｍ^３、より好ましくは０．００８ｃｍ^３〜１ｃｍ^３、例えば約０．１２５ｃｍ^３の体積を有する切片）であってもよい。上記切片はマルチウェルプレート等の標準的な実験室の容器における操作に適したサイズであることが好ましく、例えば約０．５ｃｍのサイズの略立方体であってもよい。

肝疾患モデリング、薬物スクリーニング、バイオマーカー同定及び確認、並びに疾患診断薬の開発のための小規模の３Ｄヒト微小環境の複雑性の再現において小さな血管柄のない肝臓の切片又はウェッジが有用な場合がある。好適な切片は、組織ダイサー、パンチ生検、針生検を使用して、又は実質組織のキューブ等の切片の単純外科切開（simple scalpel cleavage）によって得られてもよい。

本明細書に記載される脱細胞化のための複数の肝臓の部分を１つの肝臓から得てもよく、したがって、一人のドナーのヒト肝臓を二人以上の患者に使用してもよく、又は臨床及び疾患モデリングの両方の用途に使用してもよい。

方法は、廃棄された全ヒト肝臓又はその一部を準備することを含む。本明細書に記載される脱細胞化の前に全ヒト肝臓を１又は複数の部分に分けてもよい。

幾つかの実施形態では、工程（ｉ）の前にヒト肝臓組織を凍結保護剤で処理してもよい。例えば、該組織を凍結前に細胞内及び／又は細胞外の凍結保護剤で処理してもよい。好適な凍結保護剤として、ＤＭＳＯ、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、及びショ糖が挙げられる。

第１の脱細胞化工程では、ヒト肝臓組織中の細胞を機械的傷害に供して細胞の破壊及び除去を促進する。凍結／解凍、超音波処理、又は高密度焦点式超音波処理（ＨＩＦＵ：high intensity focused ultrasound）を含む、細胞外マトリクスに影響することなく肝臓組織の細胞を傷害する任意の好適な技法によって細胞を機械的に傷害してもよい。

幾つかの実施形態では、機械的傷害技法は、最初の処理の後繰り返されなくてもよい。例えば、他の脱細胞化試薬への暴露の後の凍結／解凍処理等は、ＥＣＭ傷害を引き起こす可能性がある。

他の実施形態では、肝臓組織中の細胞を最初の処理（例えば、上の工程（ｖｉ））の後、１回又は複数回の機械的傷害に供してもよい。例えば、上記組織をＨＩＦＵ又は超音波処理に１回又は複数回供してもよい。

ヒト肝臓組織を１回又は複数回の凍結／解凍サイクルに供することによって上記細胞を機械的に傷害することが好ましい。例えば、上記組織は、−２０℃以下、好ましくは−５０℃以下、−６０℃以下、−７０℃以下で凍結された後、１回又は複数回解凍されてもよい。凍結された組織は、簡便には４℃〜３７℃で解凍されてもよい。幾つかの好ましい実施形態では、ＥＣＭを傷害し得る組織内での温度勾配を最小化するため、上記組織を約４℃で解凍してもよい。例えば、上記組織は約−８０℃で２４時間以上凍結された後、約４℃で解凍されてもよい。

凍結／解凍に供されるヒト肝臓組織は、ＥＣＭ傷害を防止するため乾燥していることが好ましい。幾つかの実施形態では、ヒト肝臓組織は、例えば５分間〜３０分間の室温での暴露によって凍結／解凍工程の前に乾燥されてもよい。

肝臓組織を、０．９０％（重量／体積）ＮａＣｌ等の生理食塩水又はＰＢＳ等の等張緩衝液中の凍結／解凍に供してもよい。

機械的傷害に続き、ヒト肝臓組織を浸透性試薬、酵素（複数の場合がある）及び洗浄剤（すなわち、脱細胞化試薬）への一連の連続的な暴露によって脱細胞化する。これらの種々の脱細胞化試薬への連続する暴露は、細胞及び細胞片を細胞外マトリクス（ＥＣＭ）から剥離し、肝臓組織からそれらを除去する。

浸透圧ストレスは、肝臓組織における細胞の溶解を引き起こし、機械的傷害の効果を増幅する。浸透圧ストレスは、組織中の細胞に対して異なる浸透圧ストレスを有する１又は複数の浸透性試薬（すなわち、非等張性試薬）に上記組織を暴露することによって誘導され得る。組織を、細胞よりも低い浸透圧を有する１又は複数の低張性試薬に暴露して細胞を低張性環境に供してもよく、及び／又は細胞よりも高い浸透圧を有する１又は複数の高張性試薬に供して細胞を高張性環境に供してもよい。幾つかの実施形態では、低張性試薬が好ましい場合がある。

高張性試薬は、例えば、タンパク質からＤＮＡを分離するのに有用な場合がある。好適な高張性試薬は当該技術分野でよく知られており、例えばリン酸塩、ホウ酸塩又はｔｒｉｓによって緩衝されてもよい生理食塩水（例えば、０．９％（重量／体積）超のＮａＣｌ、例えば３％〜７％（重量／体積）のＮａＣｌ）、及びポリエチレングリコール溶液が挙げられる。

低張性試薬は、例えば、ＥＣＭの分子及び構造における最小の変化を伴って単純な浸透圧効果により細胞の溶解を誘導するのに有用な場合がある。好適な低張性試薬は当該技術分野でよく知られており、水、脱イオン水、及び０．９％（重量／体積）未満のＮａＣｌの生理食塩水が挙げられる。

幾つかの実施形態では、酵素を使用して肝臓組織中の細胞及び細胞内の構造を崩壊させ、ＥＣＭとの細胞結合を破壊する。例えば、組織中のタンパク質をプロテアーゼによって分解してもよい。好適なプロテアーゼは当該技術分野でよく知られており、トリプシンが挙げられる。肝臓組織を０．００２５％〜０．２５％（重量／体積）のトリプシン、例えば０．０２５％のトリプシンに暴露してもよい。幾つかの実施形態では、Ｃａ^２＋等の二価の金属イオンをキレートし、ＥＣＭへの細胞接着を妨害するＥＤＴＡ等のキレート剤を含む溶液中のプロテアーゼに肝臓組織を暴露してもよい。

一連の脱細胞化試薬への暴露において、洗浄剤に暴露する前に肝臓組織をプロテアーゼに暴露してもよい。これは、プロテアーゼによってＥＣＭから剥離される細胞又は細胞形質成分を洗浄剤によって組織から洗い流すことを可能とする。

他の実施形態では、プロテアーゼを使用せずに肝臓組織を脱細胞化してもよい。

幾つかの実施形態では、上記組織中のゲノム構造及びデオキシリボ核酸をデオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡａｓｅ）によって分解してもよい。好適なＤＮＡｓｅは当該技術分野でよく知られており、ＤＮＡｓｅＩが挙げられる。上記肝臓組織を１０００ＫＵ〜１００００ＫＵ ＤＮＡｓｅ １、例えば約２０００ＫＵ ＤＮＡｓｅ １に暴露してもよい。デオキシリボヌクレアーゼ処理は、デオキシコール酸ナトリウム等の穏やかな洗浄剤を採用する方法において特に有用な場合がある。幾つかの実施形態では、ＤＮＡｓｅは、平衡塩類溶液、例えば１Ｍ ＮａＣｌ中に存在してもよい。他の実施形態では、デオキシリボヌクレアーゼを使用せずに肝臓組織を脱細胞化してもよい。

幾つかの実施形態では、デオキシリボヌクレアーゼ又はプロテアーゼを使用せずに肝臓組織を脱細胞化してもよい。

洗浄剤は上記組織中の脂質及び脂肪を可溶化し、ＥＣＭからの細胞片の除去を促進する。

洗浄剤は、ドデシルリン酸ナトリウム（sodium dodecyl phosphate）（ＳＤＳ）、デオキシコール酸ナトリウム（ＳｄＣ）、及びＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−２００等のアニオン性洗浄剤を含んでもよい。例えば、上記肝臓組織を０．０１％〜５％のＳＤＳ、例えば０．０１％〜１％のＳＤＳ、０．０１％〜５％のデオキシコール酸ナトリウム（ＳｄＣ）、例えば約４％のデオキシコール酸ナトリウム、及び／又は０．０１％〜５％のＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−２００、例えば３％のＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−２００に暴露してもよい。

洗浄剤は、ポリエチレングリコール及びＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ１００等、例えばポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテルの非イオン性洗浄剤を含んでもよい。例えば、上記肝臓組織を０．０１％〜５％のＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００、又は１％〜３％のＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００、例えば３％のＴｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００に暴露してもよい。

洗浄剤は、ＣＨＡＰＳ（３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート）、スルホベタイン−１０（３−（デシルジメチルアンモニオ）プロパンスルホネート）、スルホベタイン−１６（ｎ−ヘキサデシル−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルホネート）、及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート等の両性イオン性洗浄剤を含んでもよい。例えば、上記肝臓組織を０．０１％〜５％の両性イオン性洗浄剤、例えば０．０１％〜１％の両性イオン性洗浄剤に暴露してもよい。

多数の他の好適な洗浄剤が当該技術分野でよく知られており、商業的供給元（例えば、米国ミズーリ州のSigma Aldrich Co LLC）から入手可能である。

幾つかの好ましい実施形態では、上記肝臓組織を別々の工程で第１の洗浄剤及び第２の洗浄剤に暴露してもよい。例えば、方法は、（ａ）ＳＤＳ等のアニオン性洗浄剤に上記組織を暴露すること、及び（ｂ）Ｔｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００等の非イオン性洗浄剤に上記組織を暴露することを含んでもよい。

幾つかの実施形態では、各処理工程において採用される脱細胞化試薬の濃度は、最大値まで次第に増加されてもよい。例えば、採用される洗浄剤の濃度は、最大値まで次第に増加されてもよい。最初の洗浄剤の濃度は、肝臓組織の血管を閉塞させる細胞形質成分の集合体又は凝集塊の形成を回避するのに十分低くてもよい。最初の洗浄剤処理の後、該洗浄剤の濃度を増して全ての細胞形質成分を効果的に除去する。

したがって、工程（ｉｉｉ）は、次第に増加する濃度の洗浄剤に上記肝臓組織を暴露することを含んでもよい。最も高い濃度は工程（ｉｉｉ）が繰り返される際に採用されることが好ましい。例えば、上記肝臓組織を、０．００５％〜０．０２％ＳＤＳ、例えば約０．０１％ＳＤＳに暴露した後、０．０５％ＳＤＳ〜０．２％ＳＤＳ、例えば約０．１％ＳＤＳに暴露し、その後０．５％ＳＤＳ〜２％ＳＤＳ、例えば約１％ＳＤＳに暴露してもよい。

後の洗浄剤処理工程（すなわち、工程ｉｉｉの繰り返し）は、０．５％ＳＤＳ〜２％ＳＤＳ、例えば約１％ＳＤＳを用いてもよい。

幾つかの好ましい実施形態では、上記肝臓組織を、試薬によって該組織を灌流することにより脱細胞化試薬に暴露してもよい。上記肝臓組織を順行性ではなく逆行性に灌流することが好ましい。

ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける組織灌流に対する好適な技術は当該技術分野でよく知られている。例えば、肝臓組織は、血管、導管又は腔、例えば大静脈又は肝静脈へのカニューレの挿入によって灌流のため準備されてもよい。その後、カニューレ挿入された組織を、カニューレ挿入により脱細胞化試薬で灌流してもよい。

好ましい実施形態では、脱細胞化試薬による肝臓組織の灌流速度は一定ではない。例えば、組織の灌流の初期速度は、肝臓組織に対する構造上の傷害を回避するため低くてもよい（例えば、０．９９ｍｌ／分／組織グラム未満）。脱細胞化の間、工程（ｉｉｉ）〜工程（ｖ）が繰り返されるにつれて、肝臓組織は灌流に対してより抵抗性が低くなり、灌流速度が増加する（例えば、１ｍｌ／分／組織グラム超）。これは、上記組織におけるフローせん断応力を増す。

灌流速度を脱細胞試薬への２以上のサイクルの暴露に亘って最大値まで次第に増加した（補償相）後、この最大値で又はその付近で維持する（安定化相）ことが好ましい。幾つかの実施形態では、最初に上記組織を０．１ｍｌ／分／組織グラム〜１．９９ｍｌ／分／組織グラム、例えば０．５ｍｌ／分／グラム〜１．５ｍｌ／分／グラムの流速で脱細胞試薬により灌流し、２ｍｌ／分／組織グラム〜２０ｍｌ／分／組織グラム、例えば２ｍｌ／分／グラム〜８ｍｌ／分／グラムまで次第に増加してもよい。他の実施形態では、最初に上記組織を０．０１ｍｌ／分／組織グラム〜０．９９ｍｌ／分／組織グラム、例えば０．５ｍｌ／分／グラム〜１．５ｍｌ／分／グラムの流速で脱細胞化試薬によって灌流し、５日間〜１０日間、好ましくは約９日間に亘って１ｍｌ／分／組織グラム〜１０ｍｌ／分／組織グラム、例えば２ｍｌ／分／グラム〜８ｍｌ／分／グラムまで次第に増加してもよい。

肝臓組織を、固形組織１グラム当たり約０．００４時間〜約５時間（４０グラム超の組織試料に対して）、又は固形組織１グラム当たり約２時間〜約１２時間（４０グラム未満の組織試料に対して）に亘り各脱細胞化試薬によって灌流してもよい。

例えば、本明細書に記載される脱細胞化は、肝臓組織の初期の質量に応じて、１日間〜６０日間、例えば７日間〜６０日間を要する場合がある。

組織を異なる脱細胞化試薬によって灌流する順番は、脱細胞化のうちに少なくとも１回、少なくとも２回又は少なくとも３回各試薬によって灌流される肝臓組織によって変化してもよい。

種々の洗浄剤への暴露の順番は、それらの異なる作用機構に基づく。機械的傷害（第１の工程）は、強い細胞破壊を促進する。低張性溶液への暴露（第２の工程）は、細胞形質成分を洗い流しながら、細胞溶解を増幅する。その後、該肝臓組織を、任意にタンパク質分解酵素に暴露して（第３の工程）ＥＣＭに付着した細胞形質成分を除去する。最後に、肝臓を異なる洗浄剤に暴露して（第４の工程）細胞形質成分を効果的に洗い流す。第４の工程を流速に応じて繰り返すことができる。

工程（ｉ）の機械的傷害は、ヒト組織内での強い細胞破壊を促進する。典型的には、脱細胞化の開始時に工程（ｉ）を１回行うが、幾つかの実施形態では、ＨＩＦＵ又は超音波処理によって媒介される機械的傷害を脱細胞化の間に２回以上誘導してもよい。機械的傷害によって引き起こされる細胞溶解は、工程（ｉｉ）における浸透圧ストレスによって増幅される。浸透性溶液への暴露もまた、組織から細胞片を洗い流す。その後、該肝臓組織を工程（ｉｉｉ）において任意にＤＮａｓｅ又は好ましくはタンパク質分解酵素に暴露してＥＣＭに付着する細胞形質成分を除去する。最後に、肝臓を工程（ｉｖ）において１又は複数の洗浄剤に暴露して組織から細胞形質成分を洗い流す。フローせん断応力を増しながら工程（ｉｉｉ）〜工程（ｉｖ）を１回又は複数回繰り返すことができる。

幾つかの実施形態では、方法は、上記肝臓組織を通る灌流によって次の順序：（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、（ｖ）、［（ｉｉｉ）、（ｖ）］_ｎ、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、［（ｉｉｉ）、（ｖ）］_ｎ（ここで、ｎは１〜２５である）で工程（ｉｉｉ）〜工程（ｖ）を繰り返すことを含むことができる。好適な灌流による脱細胞化レジメンを表１に示す。また、任意には、上記方法において工程（ｉｉ）を１回又は複数回繰り返してもよい。

脱細胞化試薬は、起源組織のサイズ及び構造と一致するＥＣＭスキャフォールドを作製するため全肝臓又はその機能的単位を通って灌流されてもよい。幾つかの実施形態では、例えば、ヒトへの直接移植に適し得る機能性肝組織を得るため、このスキャフォールドを後に細胞を用いて再増殖させてもよい。

幾つかの実施形態では、上記肝臓組織は病的なものであってもよい。病的な肝臓組織の脱細胞化試薬による灌流は、例えば、３Ｄ疾患モデリングのため細胞により再増殖され得るＥＣＭスキャフォールドの作製において有用な可能性がある。

他の好ましい実施形態では、脱細胞化試薬中にヒト肝臓組織を浸漬し、例えば回転撹拌機上で撹拌に供することによって、該組織を該試薬に暴露してもよい。

肝疾患モデリング用に小規模で３Ｄヒト微小環境の複雑性を再現するスキャフォールドを作製するため、肝臓組織の切片又は試料を脱細胞化試薬中で撹拌してもよい。上記試料は、正常又は病的な肝臓組織であってもよい。好適な試料は、幅／長さ又は直径０．２ｃｍ〜２ｃｍ、又は０．２ｃｍ〜１．０ｃｍの範囲であってもよい。例えば、上記試料は、本明細書において「肝臓組織キューブ」（ＬＴＣ）と名付けられる、およそ５ｍｍの幅の切片又はキューブであってもよい。

撹拌レジメンによる脱細胞化のための肝臓組織試料は、標準的な技法に従って、組織ダイサー、針生検、パンチ生検を使用して、又はヒト肝臓実質組織の切片若しくはキューブの単純外科切開によって得られてもよい。

脱細胞化試薬に浸漬された肝臓組織の撹拌は、フローせん断応力に肝臓組織を供してもよい。好適な撹拌は、例えば１００ｒｐｍ〜１０００ｒｐｍ、好ましくは約９００ｒｐｍでの回転撹拌機又はマグネチックスターラーにおける回転揺動を含んでもよい。

幾つかの実施形態では、撹拌された組織を、
（ａ）上記組織を浸透圧ストレス試薬、例えば低張性試薬又は高張性試薬に暴露することと、
（ｂ）上記組織をプロテアーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅに暴露することと、
（ｃ）上記組織を洗浄剤に暴露することと、
の１又は複数のサイクル供することができ、（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は各サイクルにおいて任意の順序で行ってもよい。

例えば、上記組織を、
（ａ）低張性試薬に上記組織を暴露することと、
（ｂ）洗浄剤に上記組織を暴露することと、
（ｃ）ＤＮＡａｓｅに上記組織を暴露することと、
の１又は複数のサイクルに供してもよい。

例えば、１サイクル〜２５サイクルを行ってもよい。

上記組織を、水等の低張性試薬に１２時間〜３６時間、好ましくは約２４時間暴露してもよい。上記組織を４℃で低張性試薬に暴露してもよい。

上記組織を、ＳｄＣ等の洗浄剤、例えば４％ＳｄＣに４時間〜１２時間、好ましくは約６時間、暴露してもよい。上記組織を周囲温度で洗浄剤に暴露してもよい。

上記組織をＤＮＡｓｅに約３時間暴露してもよい。上記組織を周囲温度でＤＮＡｓｅに暴露してもよい。例えば、上記組織を１Ｍ ＮａＣｌ中２０００ＫＵ ＤＮＡｓｅ１に暴露してもよい。

方法は、上に述べられる脱細胞化試薬のいずれかに暴露した後、洗浄溶液に上記組織を暴露することを更に含んでもよい。上記組織を、１若しくは複数の上記工程の間、及び／又はサイクルの間、例えば工程（ａ）と工程（ｂ）との間、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間、及び／又は工程（ｃ）の後、並びに任意のサイクル反復の前に洗浄してもよい。例えば、周囲温度で５分間〜３０分間、好ましくは約５分間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は抗生物質−抗真菌剤で補足されたＰＢＳで上記組織を洗浄してもよい。好適な抗生物質−抗真菌剤は当該技術分野でよく知られている。

他の実施形態では、上記組織を、
（ａ）水等の低張性試薬に上記組織を暴露することと、
（ｂ）好ましくはｄＨ_２Ｏ（脱イオン水）中のトリプシン等のプロテアーゼに上記組織を暴露することと、
（ｃ）第１の洗浄剤、例えばＳＤＳ等のアニオン性洗浄剤に上記組織を暴露することと、
（ｄ）第２の洗浄剤、例えばＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００等のイオン性洗浄剤に上記組織を暴露することと、
の１又は複数のサイクルに供してもよい。

上記組織を周囲温度で１５分間〜３０分間、水等の低張性試薬に暴露してもよい。

上記組織を、周囲温度で１２時間〜３６時間、ｄＨ_２Ｏ（脱イオン水）中のプロテアーゼ、例えば０．０２５％トリプシン又はＥＤＴＡに暴露してもよい。

上記組織を、周囲温度で１２時間〜９６時間、第１の洗浄剤、例えば０．０１％〜１％ＳＤＳに暴露してもよい。

上記組織を、周囲温度で１２時間〜７２時間、第２の洗浄剤、例えば０．０１％〜３％Ｔｒｉｔｏｎ（商標） Ｘ−１００に暴露してもよい。

１又は複数の上の工程の間及び／又はサイクルの間に上記組織を洗浄してもよい。１又は複数の上の工程の間、及び／又はサイクルの間、例えば工程（ａ）と工程（ｂ）との間、工程（ｂ）と工程（ｃ）との間、工程（ｃ）と工程（ｄ）との間、及び／又は工程（ｄ）の後、並びに任意のサイクル反復の前に上記組織を洗浄してもよい。例えば、周囲温度で５分間〜３時間、例えば３０分間〜１時間、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は抗生物質−抗真菌剤で補足されたＰＢＳで上記組織を洗浄してもよい。

例えば、方法は、撹拌した組織を、
（ａ）上記組織を脱イオン水に暴露することと、
（ｂ）上記組織をＰＢＳ中で洗浄することと、
（ｃ）上記組織をＳｄＣに暴露することと、
（ｄ）上記組織をＰＢＳ中で洗浄することと、
（ｅ）上記組織をＤＮＡａｓｅに暴露することと、
（ｆ）上記組織をＰＢＳ中で洗浄することと、
の１又は複数のサイクルに供することを含んでもよい。

工程（ａ）〜工程（ｆ）を、４回〜８回、好ましくは約４回繰り返してもよい。

好適な撹拌は、６００ｒｐｍ〜１２００ｒｐｍ、例えば約９００ｒｐｍでのオービタルシェーカー、又は１５０ｒｐｍ〜６００ｒｐｍ、例えば３００ｒｐｍ〜４００ｒｐｍでのマグネチックスターラーによって提供され得る。

幾つかの実施形態では、代替的には工程（ａ）の前に４時間〜１２時間、例えば８時間、上記組織を水及びデキストロース溶液に暴露してもよい。

他の実施形態では、上に記載される方法は、
（ｆ）９％生理食塩水等の高張性剤に上記組織を暴露すること、
を更に含んでもよい。

脱細胞化試薬への暴露の各サイクルの期間は、２日間〜３日間であってもよい。撹拌レジメンを使用するスキャフォールドの脱細胞化のための合計時間は、２．５日間〜２５日間、例えば約８日間であってもよい。

脱細胞化に続き、例えば殺菌剤に暴露することにより上記スキャフォールドを滅菌してもよい。好適な殺菌剤として、γ線照射、電解水、及び過酢酸等の化学薬剤が挙げられる。上記スキャフォールドを、例えば３０分間〜２時間、０．０１％過酢酸及び４％エタノールに暴露してもよい。

上記スキャフォールドを、本明細書に記載されるように殺菌剤で灌流してもよく、又は殺菌剤に浸漬して撹拌に供してもよい。

脱細胞化及び滅菌に続き、例えば、細胞の不在について、及び／又はコラーゲン、ラミニン、エラスチン、プロテオグリカン、ヒアルロン酸、フィブロネクチン、成長因子、及び細胞外プロテアーゼ等のＥＣＭ成分の存在について、上記肝臓スキャフォールドを試験してもよい。

好適な技法として、巨視的な可視化、顕微鏡、及び免疫組織化学の技法が挙げられ、当該技術分野でよく知られている。

脱細胞化されたヒト肝臓スキャフォールドは、標準的な組織学的染色の手法を使用して組織学的切片中に検出可能な筋フィラメント、内皮細胞、平滑筋細胞、並びに細胞片及び核を欠く場合がある。

本明細書に記載されるように製造された脱細胞化されたヒト肝臓スキャフォールドは、３Ｄの臓器形態及び構造、並びに起源肝臓組織のＥＣＭ生物活性を保存する。

幾つかの実施形態では、上に記載される方法によって製造された脱細胞化肝臓スキャフォールドの構造及び形態は電子顕微鏡検査によって確認することができる。

起源組織に応じて、肝臓スキャフォールドは正常ＥＣＭを含んでもよく、又は疾患により修飾されたＥＣＭであってもよい。例えば、肝臓スキャフォールドは、肝疾患又は病態の特徴である１又は複数の構造変化を含んでもよい。

ヒト肝細胞スキャフォールドは、該スキャフォールド中で培養される細胞の効果的な付着、遊走、増殖及び三次元組織化を可能とする。また、脱細胞化されたヒト肝臓スキャフォールドは、細胞表現型及び機能特性を維持する生物活性分子及び生体誘導（bioinductive）特性を提供し、組織特異的マトリクスの産生を促進し得る。

本明細書に記載される脱細胞化されたヒト肝細胞スキャフォールドの製造の後、方法は、人工肝臓組織を製造するため細胞によって該スキャフォールドを再増殖することを含んでもよい。

好適な細胞として、ヒト初代及び細胞株の肝臓細胞（例えば肝星細胞、Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞、肝臓シヌソイド細胞）、初代肝細胞、内皮細胞、ｉＰＳＣ又は患者特異的ｉＰＳＣ由来細胞、胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）、肝細胞由来間葉系幹細胞（ＨＤＭＳＣ）、胎生幹細胞（例えば、羊水幹細胞及び胎児肝臓細胞）、癌細胞及び内皮前駆細胞（ＥＰＣ）が挙げられる。

幾つかの実施形態では、例えば、患者への移植用の人工肝臓組織を製造するため、脱細胞化されたヒト肝臓スキャフォールドを患者から得られた自己ヒト細胞によって再増殖させてもよい。他の実施形態では、例えば、患者への移植用の人工肝臓組織を製造するため、脱細胞化されたヒト肝臓スキャフォールドを同種ヒト細胞、すなわち異なるヒト個体に由来する細胞によって再増殖させてもよい。幾つかの実施形態では、移植前に患者との免疫適合性について同種のヒト細胞をスクリーニングしてもよい。

脱細胞化スキャフォールドは、該スキャフォールドへの細胞によるスキャフォールドの播種及び好適な条件下での培養によって再増殖されてもよい。例えば、該細胞は、脱細胞化されたスキャフォールドの実質組織へと直接注入されてもよく、主要な血管アクセスによって灌流されてもよく、及び／又は脱細胞化されたスキャフォールドの表面に滴下されてもよい。

本発明の他の態様は、非ヒト肝臓スキャフォールドを製造するため、上に記載される方法に必要な変更を加えて使用することで、非ヒト霊長類、ブタ、ヒツジ、ウマ、又はウシ等の非ヒト動物に由来する肝臓組織の脱細胞化を提供する。上に記載されるヒト細胞を用いて非ヒトスキャフォールドを再増殖させ、非ヒトスキャフォールド内にヒト細胞を含む人工肝臓組織を作製することができる。これは、患者への移植用の人工肝臓組織の製造に有用な可能性がある。

幾つかの実施形態では、本明細書に記載されるように製造された脱細胞化されたヒト肝臓スキャフォールド又は人工肝臓組織は、導管及び血管等の１又は複数の肝臓組織構造を除去するため解剖されてもよい。脱細胞化されたヒト肝臓スキャフォールドから除去された構造を、上に記載される細胞を用いて再増殖させてもよい。肝臓スキャフォールド又は組織から除去された構造は、例えば、以下に記載される疾患の治療のための移植又は疾患モデリングに有用な可能性がある。

本発明の他の態様は、上に記載される方法によって製造されたヒト肝臓スキャフォールド又は人工肝臓組織を提供する。

本明細書に記載されるように製造されたヒト肝臓スキャフォールドは無細胞性であり、起源肝臓組織の細胞外マトリクス孔構造及び形態を呈する。脂肪質の起源肝臓組織から製造されたヒト肝臓スキャフォールドは、起源組織に特徴的な増加した脂質含有量を呈する。線維性の起源肝臓組織から製造されたヒト肝臓スキャフォールドは、起源組織に特徴的なＥＣＭ成分の増加を呈する。

上記スキャフォールド又は組織は、疾患モデリングに有用な可能性がある。好適なスキャフォールドは、上に記載される正常な肝臓組織又は病的な肝臓組織に由来し得る。

疾患モデリングの方法は、
上記のように製造されたヒト肝臓スキャフォールド又は人工ヒト肝臓組織を準備することと、
上記スキャフォールド若しくは上記組織、又はその中の細胞に対する化合物、薬物、生物学的製剤、装置又は治療的介入の効果を特定することと、
を含むことができる。

本明細書に記載される方法は、肝線維症、肝臓癌及び転移、肝臓薬物毒性、移植後免疫応答、並びに自己免疫性肝炎等の肝疾患又は肝臓を冒す疾患のモデリングにおいて有用な可能性がある。

生物学的製剤として、ＨＢＶ及びＨＣＶ等のウイルスが挙げられ得る。

脱細胞化された肝臓スキャフォールドは肝疾患の診断に有用な可能性がある。好適なスキャフォールドは、肝疾患を有することが疑われる個体からの肝臓組織に由来してもよい。

ヒト個体において肝疾患を診断する方法は、
上記のように製造された上記個体に由来する肝臓スキャフォールドの試料を提供することと、
上記試料中の１又は複数の肝臓スキャフォールドタンパク質の存在及びその量を特定することと、
を含むことができる。

試料中の肝臓スキャフォールドタンパク質の存在及び量は、個体における肝疾患の存在の指標となり得る。

上記スキャフォールド又は組織は、例えば、個体における肝臓組織の置換又は補足に対する治療法において有用な可能性がある。

肝疾患の治療方法は、
上記のように製造されたヒト肝臓スキャフォールド又は人工ヒト肝臓組織を、それを必要とする個体に移植することを含むことができる。

移植されたスキャフォールド又は組織は、その個体に既存の肝臓と置き換えられてもよく、又はそれを補足してもよい。

本発明の別の態様は、個体における肝疾患又は肝機能障害の治療における使用に対する、上記のように製造されたヒト肝臓スキャフォールド又は人工ヒト肝臓組織を提供する。

例えば、ヒト肝臓スキャフォールド又は人工ヒト肝臓組織を個体に移植して、完全に新しい肝臓を再生する若しくは傷害された肝臓の修復を改善してもよく、又は体外から個体の肝機能を支持してもよい。

本発明の他の態様は、上に記載される方法に必要な変更を加えて使用することで、ヒト膵臓スキャフォールドを製造するためのヒト膵臓組織の脱細胞化を提供する。ヒト膵臓スキャフォールドは、ヒトＥＣＭスキャフォールド内にヒト細胞を含む人工膵臓組織を製造するための上に記載されるヒト細胞による再増殖であってもよい。これは、患者への移植用人工膵臓組織の製造に有用な可能性がある。

例えば、本発明の別の態様は、ヒト膵臓スキャフォールドを製造する方法であって、
（ｉ）ヒト膵臓組織を準備することと、
（ｉｉ）上記組織中の細胞を機械的に傷害することと、
（ｉｉｉ）上記組織中の細胞を浸透圧ストレスに供することと、
（ｉｖ）上記組織をプロテアーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅに暴露することと、
（ｖ）上記組織を洗浄剤に暴露することと、
（ｖｉ）工程（ｉｉｉ）、工程（ｉｖ）、及び工程（ｖ）、並びに任意に工程（ｉｉ）の各々を１回又は複数回繰り返すことと、
を含み、それによってヒト膵臓スキャフォールドを製造する、方法を提供する。

ヒト膵臓スキャフォールドは、「肝臓（liver）」及び「肝臓の（hepatic）」の用語を「膵臓」及び「膵臓の」に置き換える以外は、肝臓スキャフォールドに関して上に記載される方法のいずれかに従って製造され得る。

上に記載される方法によって製造された脱細胞化ヒト膵臓スキャフォールドを、細胞によって再増殖し、人工膵臓組織を生じてもよい。

本発明の態様は、本明細書に記載される方法によって製造された脱細胞化されたヒト膵臓スキャフォールド及び人工膵臓組織を提供する。

ヒト膵臓スキャフォールド及び人工膵臓組織は、肝臓のスキャフォールド及び組織について上に記載される疾患モデリング、診断及び治療方法に必要な変更を加えて使用され得る。

本発明の別の態様は、
上記のように製造されたヒト肝臓スキャフォールドと、
上記スキャフォールドへの培養培地の導入のための入力導管と、
上記スキャフォールドからの培養培地の排出のための出力導管と、
を備える、バイオリアクターを提供する。

肝臓スキャフォールドは、該スキャフォールドの再増殖のためヒト細胞により播種されることが好ましい。これは、人工肝臓組織の製造において有用な場合がある。

スキャフォールドの播種に適した細胞は上に記載される。

バイオリアクターは、培養培地貯蔵器を更に備えてもよい。入力導管は、バイオリアクター内のスキャフォールドが貯蔵器からの培養培地によって灌流されてスキャフォールドへと播種された細胞によってスキャフォールドの再細胞化を可能とするように、貯蔵器に接続可能であってもよく、又は貯蔵器への接続に対して適合されてもよい。

バイオリアクターは、肝臓スキャフォールドを順応させるための組織チャンバーを更に備えてもよい。

上記スキャフォールドは、バイオリアクター内の好適な培養培地中に含まれる。

組織チャンバー内の肝臓スキャフォールド及び貯蔵器内の培養培地は、再増殖を可能とするため正常酸素圧条件下、３７℃で維持されてもよい。

バイオリアクターは、播種された細胞によって再増殖されるに従い、上記スキャフォールドにおける肝臓機能の存在又は量を特定又はモニタリングするための１又は複数のセンサを更に備えてもよい。

本発明の別の態様は、
上記のように製造された人工ヒト肝臓組織と、
上記人工ヒト肝臓組織への血液の導入のための入力導管と、
上記人工ヒト肝臓組織からの血液の排出のための出力導管と、
を備える、バイオリアクターを提供する。

バイオリアクターは、体外にあることが好ましい。

入力導管及び出力導管は、バイオリアクター内の人工ヒト肝臓組織を個体の血液で灌流して個体に肝臓機能を提供するように、例えば、内因性の肝臓機能の喪失によって引き起こされる毒物の蓄積を減少するように、個体の血管系に接続可能であるか、又は個体の血管系への接続に対して適合されてもよい。

バイオリアクターは、人工ヒト肝臓組織を適合させるための組織チャンバーを更に備えてもよい。

人工ヒト肝臓組織は、バイオリアクター内の好適な培養培地中に含まれてもよい。

本発明の別の態様は、上の記載される方法を使用してヒト肝臓スキャフォールドを製造するために適合された脱細胞化システム及び器具を提供する。

脱細胞化システムは、
脱細胞化に対してヒト肝臓組織を順応させるための組織チャンバーと、
上記組織チャンバーへの導入に対して脱細胞化試薬を適合させるための３以上の試薬貯蔵器と、
を備える脱細胞化装置を備えてもよい。

上記試薬貯蔵器は、該貯蔵器からの試薬を上記チャンバーへと導入することができるように組織チャンバーに制御可能に連結されてもよい。

上記試薬貯蔵器は、低張性試薬、プロテアーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅ、並びに洗浄剤を含んでもよい。

組織チャンバーは肝臓組織を含んでもよい。

幾つかの実施形態では、上記システムは、ヒト肝臓試料から肝臓組織切片を作製して脱細胞化機器（decellulariser）の組織チャンバーへと切片を載せるように適合されたサンプラーを更に備えてもよい。

脱細胞化装置は、試薬貯蔵器から組織チャンバーへと脱細胞化試薬を移動するため、また任意に組織チャンバーから脱細胞化試薬を除去するための１又は複数のポンプを更に備えてもよい。

上記チャンバーは、脱細胞化試薬の導入のための注入口及び試薬の除去のための排出口を備えてもよい。

幾つかの実施形態では、組織チャンバー内のヒト肝臓組織は、注入口を通って貯蔵器からチャンバーへと導入された脱細胞化試薬又は生理学的溶液に浸漬されてもよい。脱細胞化試薬への暴露の後、本明細書に記載される脱細胞化レジメンに従って、排出口を通して該試薬を除去し、更なる脱細胞化試薬を該チャンバーに導入してもよい。上記システムは、組織チャンバーにおいて脱細胞化試薬中に浸漬されたヒト肝臓組織を撹拌するための撹拌機を更に備えてもよい。

他の実施形態では、組織チャンバー内のヒト肝臓組織を試薬貯蔵器からの脱細胞試薬を用いて逆行性に灌流してもよい。本明細書に記載される脱細胞化レジメンに従って、複数の脱細胞化試薬を連続して該組織に通して灌流してもよい。灌流の間、生理学的溶液又は培養培地中に肝臓組織を浸漬してもよい。

脱細胞化装置は、逆行性の灌流を可能とするため、組織チャンバーにおいて肝臓組織にカニューレ挿入するための少なくとも１つのカニューレ挿入装置を備えてもよい。好適なカニューレ挿入装置は、ヒト肝臓組織の血管、導管及び／又は腔への導入のための適切なサイズの中空の配管を備えてもよい。典型的には、組織チャンバー内の組織において１又は複数の血管、導管及び／又は腔にカニューレ挿入を行う。幾つかの実施形態では、上記装置は、肝臓組織への脱細胞化試薬の導入のための注入口カニューレ挿入装置と、肝臓組織からの脱細胞化試薬の排出用の排出口カニューレ挿入装置を備えてもよい。

脱細胞化装置は、カニューレ（複数の場合がある）によって肝臓組織を灌流するための灌流器具を更に備えてもよい。灌流器具は、１又は複数のカニューレを介してヒト肝臓組織を通る貯蔵器からの脱細胞化試薬の移動のための機構（例えば、ポンプ、気圧、重力）、また同様に試薬貯蔵器からの脱細胞化試薬による組織チャンバー内のカニューレ挿入された肝臓組織の灌流のための管、アダプタ及び／又はコネクタを備えることができる。

カニューレ挿入及び灌流は、当該技術分野でよく知られている技法である。

上記脱細胞化装置は、組織チャンバー内の肝臓組織に対して無菌環境を維持するように適合されてもよい。気流の制御及び濾過及び／又は望ましくない微生物の成長を予防するため例えば抗生物質、抗真菌剤若しくは他の抗菌剤を用いる灌流等、当該技術分野で知られている様々な技法を使用して脱細胞化の間、無菌状態を維持してもよい。好適な抗菌化合物は当該技術分野でよく知られている。

脱細胞化装置は、或る特定の灌流特性（例えば、圧力、容量、フローパターン、温度、気体、ｐＨ）、機械力（例えば、心室壁運動及び応力）をモニターするように適合されてもよい。例えば、上記システムは、該システム（例えばバイオリアクター）及び／又は肝臓組織をモニターするセンサを備えてもよい。センサは、カニューレ挿入された肝臓組織を通り抜ける液体の圧力、上記システムの周囲温度及び／又は肝臓組織の温度、カニューレ挿入された肝臓組織を通り抜ける液体のｐＨ及び／又は流速、及び／又は再細胞化している肝臓組織の生物活性をモニターするため使用されてもよい。かかる特徴をモニターするためのセンサを有することに加え、肝臓組織の脱細胞化及び／又は再細胞化に対するシステムは、かかる特徴を維持又は調整するためのコントロールを備えてもよい。

コントロールとして、温度計、サーモスタット、電極、圧力センサ、溢出弁、脱細胞化試薬への流体接続の開閉、及び流体の速度及び方向の変更に対する弁等の構成要素が挙げられ得る。

安定な条件（例えば温度）を確実にすることを補助するため、チャンバー、貯蔵器、及び配管は、ウォータージャケット化（water-jacketed）されてもよい。

ヒト肝臓スキャフォールドを作製するためのシステムは、プログラム可能なプロセッサーによって制御されてもよい。例えば、該プロセッサーは１又は複数のセンサからの情報を受け取り、処理してもよい。該プロセッサーは、バイオリアクター及び／又は肝臓組織へと情報及び指示を送り返してもよい。

肝臓組織の重量及び内部抵抗に基づいて、その特定の肝臓組織に対し、本明細書に記載される脱細胞化方法に従う各脱細胞化試薬に対する暴露時間及び灌流圧力を計算するため、上記プロセッサーを適合してもよく、又はプログラムしてもよい。プロセッサーは、脱細胞試薬を変更して、上記システムの１若しくは複数のポンプ及び／又はバルブ制御によって還流圧力を変化してもよい。プロセッサーは、各脱細胞化工程及び流速に対して前負荷及び後負荷（それぞれ灌流の前及び後の圧力）を記録してもよい。

上記システムを、生物活性について脱細胞化を経る肝臓組織をモニターするため適合してもよい。例えば、肝臓組織の機械的活性、機械的圧力及び／又は壁応力をモニターしてもよい。

本発明の様々な更なる態様及び実施形態が、本開示を考慮して当業者に明らかとなる。

本発明の他の態様及び実施形態は、「からなる（consisting of）」の用語によって置き換えられる「含む、含んでいる（comprising）」の用語を有する上に記載される態様及び実施形態、並びに「本質的にからなる（consisting essentially of）」の用語によって置き換えられる「含む、含んでいる（comprising）」の用語を有する上に記載される態様及び実施形態を提供する。

本出願は、別段の指示がない限り、あらゆる上の態様及び上に記載される実施形態の互いとの全ての組み合わせを開示することが理解される。同様に、本出願は、別段の指示がない限り、好ましい及び／又は任意の特徴の単独の又はあらゆる他の態様とのいずれかの全ての組み合わせを開示する。

上の実施形態の修飾、更なる実施形態及びそれらの修飾は、本開示を読むことによって当業者に明らかとなり、それら自体が本発明の範囲に含まれる。

本明細書で言及される全ての文書及び配列データベースエントリは、全ての目的に対してそれらの全体が引用することにより本明細書の一部をなす。

本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、２つの明示される特徴又は成分の各々の他方を含む又は他方を含まない具体的な開示として理解される。例えば、「Ａ及び／又はＢ」は、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、並びに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的な開示として、それぞれが本明細書において個別に述べられているかのように理解される。

ここで、本発明の特定の態様及び実施形態を例として、また以下に記載される図面を参照して解説する。

１４日間の脱細胞化プロセスに亘る異なる相の灌流に関連する流速（ｍｌ／分の単位）を示す図である。 脱細胞化前の１２５ｍｍ^３の肝臓組織キューブ（ＬＴＣ：Liver Tissue Cube）を示す図である。 生得組織と４回の脱細胞化サイクル後の脱細胞化ＬＴＣ（ｄＬＴＣ）の組織学的比較を示す図である。Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリン及びエオシン）染色は、ＬＴＣ脱細胞化後の細胞の除去を示し、ＳＲ（シリウスレッド）染色はコラーゲン（赤色）の保存及び細胞形質成分（黄色）の除去を示した。 脱細胞化後のコラーゲン（上）及びＤＮＡ（下）の定量的測定を示す図である。種々の撹拌速度（９００Ｃ１〜９００Ｃ４）の後のコラーゲンの定量は、新鮮な組織と比較した場合の保存されたコラーゲン量を示す。脱細胞化は、１回の処理サイクルの後、既にＤＮＡ含有量における有意な減少（ｐ＜０．０１）に効率的であった（下）。 ヒト肝星細胞株ＬＸ２によるヒト肝臓スキャフォールドの再増殖を示す図である。（上部パネル）Ｈ＆Ｅ染色は、再細胞化（recellularisation）後１日と２１日とを比較した場合のＬＴＣスキャフォールドへの漸進的なＬＸ２細胞遊走を実証する。（下部パネル）再増殖のプロセスは、増殖マーカーＫｉ６７に対する免疫染色によって検出される顕著な細胞増殖を特徴とする。 ＬＸ２による再増殖後１４日の総細胞数の増加を示す図である。重要なことに、ヒト肝臓スキャフォールドにおける総細胞数は、１４日〜２１日の間に有意に増加した（ＬＨパネル）。ＫＩ６７免疫組織化学は、８５％超の細胞が全ての異なる時間点において増殖していたことを示す（ＲＨパネル）。 ヒト肝細胞癌細胞株ＳＫ−Ｈｅｐによる脱細胞化されたヒト肝臓スキャフォールドの再増殖を示す図である。Ｈ＆Ｅ染色及びＨＶＧ（ヘマトキシリン−ワンギーソン）染色は、生体工学処理（bioengineering）後１日における細胞付着、及び再細胞化後１日と１４日とを比較した場合のヒト肝臓スキャフォールドへの漸進的な細胞遊走を実証する。 抗ヒトＮａｎｏｇ（右）及びアイソタイプ対照（左）によＳＫ−ＨｅｐのＦＡＣＳ染色を示す図である。 １日後及び７日後のヒト肝細胞癌細胞株ＳＫ−Ｈｅｐによる脱細胞化されたヒト肝臓スキャフォールドの再増殖を示す図である。Ｎａｎｏｇ発現を免疫組織化学によって分析した。１日目にＥＣＭに付着した細胞及び７日目にスキャフォールドで遊走する細胞はＮａｎｏｇ陽性細胞であることが明らかである。 １４日後のヒト肝細胞癌細胞株ＳＫ−Ｈｅｐによる脱細胞化されたヒト肝臓スキャフォールドの再増殖を示す図である。Ｎａｎｏｇ発現を免疫組織化学（茶色）により分析し、細胞をヘマトキシリン（青色）で対比染色した。１４日後の再増殖のプロセスは、Ｎａｎｏｇ陽性及びＮａｎｏｇ陰性の細胞の両方を特徴とする（下）。この段階で、ヒト肝細胞癌の発症に似た特徴と共に、Ｎａｎｏｇ陽性細胞が再増殖したスキャフォールドを囲む（上）ことは注目すべきことである。 血管樹の保存を強調するため２つの異なる背景光を使用する脱細胞化ヒト肝臓左葉の肉眼で見える外観を示す。 脱細胞化された血管（門脈、肝動脈及び肝門板）及び胆樹の組織学的切片を示す図である。Ｈ＆Ｅは、脱細胞化された組織における細胞の不在を示す。ＳＲ染色及びＥＶＧ染色はコラーゲン（赤色）及びエラスチン（青色）の保存をそれぞれ示す。 新鮮な肝臓組織と脱細胞化された肝臓組織の左葉区域（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ４）の組織学的比較を示す図である。Ｈ＆Ｅ染色は脱細胞化後の細胞の除去を示し、ＳＲ染色及びＥＶＧ（エラスチカ−ワンギーソン）染色はコラーゲン（赤色）及びエラスチン（青色）の保存をそれぞれ示す。 ヒト肝星細胞株ＬＸ２によるヒト肝臓スキャフォールドの再増殖を示す図である。Ｈ＆Ｅ染色及びＨＶＧ染色は、生体工学処理後１日の細胞の付着、及び再細胞化の後１４日と１日とを比較した場合のヒト肝臓スキャフォールドへの漸進的な細胞遊走を実証する。 典型的な小葉性構造によって囲まれる門脈路を含む低倍率（９０倍）のＳＥＭ画像を示す図である。 スキャフォールドの無細胞状態を確認し、一旦は肝細胞によって占拠された空間（すなわち、肝細胞不含空間）を明確に規定する３００倍のＳＥＭ画像を示す図である。 肝細胞不含空間を組織する結合組織線維の非常に保存された三次元網目構造を実証する、高倍率（２５００倍）ＳＥＭ画像を示す図である。

略語：ＳｄＣ デオキシコール酸ナトリウム；ＰＢＳ／ＡＡ ＰＢＳ＋抗生物質性抗真菌薬；Ｔ／Ｅ ０．０２５％トリプシン／ＥＤＴＡ０．０２５％；ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム；ＴＸ１００ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ １００；ＲＴ 室温；ＰＡＡ 過酢酸；ＥｔＯＨ エタノール。

１．方法
１．１ ヒト肝臓の採取及びカニューレ挿入
肝臓移植に適していない廃棄されたヒト肝臓臓器（ＤＨＬＯ）を移植に対する標準的な手順に従ってヘパリン化した。０．２ｃｍ〜１．０ｃｍの小さい血管柄のない肝臓単位（肝臓組織キューブ、ＬＴＣ）の複数ブロックの細区画によって、及び／又は血管−胆管柄が与えられた単位の区域若しくは亜区域の作製により、ＤＨＬＯを適切に作製した。全ヒト肝臓又は代替的には左葉（区域２−区域３−区域４±区域１）、右葉（区域５〜区域８）、又は左外側の肝臓（区域２−区域３±区域１）、また同様に肝臓組織キューブ（ＬＴＣ）を−８０℃で少なくとも２４時間凍結して細胞溶解を促進した。

１．２ 全ヒト肝臓左葉の灌流による脱細胞化
最初に、全ヒト肝葉を４℃にてＰＢＳ中で一晩解凍した。次に、大静脈又は肝静脈にカニューレ挿入を行い、逆行性灌流系を開始した。

最後に、表１、表２及び図１に示されるように５ＣＤＦを適用して臓器全体の脱細胞化を達成した。２相の灌流は、ａ）抵抗を補償するための急激に上昇する流速、ｂ）脱細胞化の進行に伴った流速の安定化を採用した。２相の流速を図１に示す。

１．３ ヒトＬＴＣの撹拌による脱細胞化
ＬＴＣを３７℃で１時間〜１．５時間解凍した。ＬＴＣの脱細胞化に関するプロトコルを表３〜表５に示す。

２．結果
生得の肝臓組織及び脱細胞化されたＬＴＣ（ｄＬＴＣ）を４サイクルの脱細胞化の後に組織学的に比較した。脱細胞化サイクルは、ＬＴＣから細胞及び細胞形質成分を除去したのに対し、コラーゲンを保存することが分かった（図３）。

脱細胞化後のｄＬＴＣ中のコラーゲン及びＤＮＡを定量した。ｄＬＴＣ中のコラーゲン量は、新鮮な組織（９００Ｃ１〜９００Ｃ４）と比較した場合に種々の撹拌速度で保存されたことが分かった（図４上）。脱細胞化は、わずか１サイクルの処理の後にＤＮＡ含有量の有意な減少（ｐ＜０．０１）に有効であった（図４下）。

脱細胞化されたヒトＬＴＣをヒト肝星細胞株ＬＸ２により再増殖させた。ＬＸ２細胞は、再細胞化後２１日に亘ってＬＴＣスキャフォールドへと次第に遊走したことが分かった（図５上部パネル）。ヒト肝臓スキャフォールド中の総細胞数は、ＬＸ２による再増殖後１４日に増加し、１４日〜２１日の間に顕著に増加したことが分かった（図６のＬＨパネル）。増殖マーカーであるＫｉ６７に対する免疫染色は、再増殖のプロセスが著しい細胞増殖を特徴とし（図５下部パネル）、全ての異なる時間点において８５％超細胞が増殖していた（図６のＲＨパネル）ことを示した。

脱細胞化されたヒト肝臓スキャフォールドをヒト肝細胞癌細胞株ＳＫ−Ｈｅｐにより再増殖した。細胞付着が生体工学処理の１日後に観察され、ＳＫ−Ｈｅｐ細胞は再細胞化後１４日においてヒト肝臓スキャフォールドへと次第に遊走した（図７）。１日目にＥＣＭに付着した細胞及び７日目にスキャフォールド内に遊走する細胞は、Ｎａｎｏｇ陽性細胞であることが示された（図８及び図９）。１４日後の再増殖のプロセスは、Ｎａｎｏｇ陽性細胞及びＮａｎｏｇ陰性細胞の両方を特徴としていた（図１０）。注目すべきことに、１４日後、Ｎａｎｏｇ陽性細胞は、ヒト肝細胞癌の発症に似た特徴を伴って再増殖されたスキャフォールドを囲むことが分かった（図１０、上部パネル）。

ヒト肝臓左葉の血管樹は、脱細胞化後に観察されるように保存されたことが分かった（図１１）。細胞は脱細胞化された組織に存在しないが、コラーゲン及びエラスチンは保存されたことが分かった（図１２）。

新鮮な肝臓組織と脱細胞化されたヒト肝臓の左葉区域（Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３及びＳ４）の比較は、脱細胞化の後の細胞の除去、並びにコラーゲン及びエラスチンの保存を確認した（図１３）。

脱細胞化されたヒト肝臓の左葉区域をヒト肝星細胞株ＬＸ２により再増殖した。ＬＸ１細胞は、１日後に脱細胞化されたスキャフォールドに付着し、１４日に亘ってスキャフォールドへと次第に遊走することが分かった（図１４）。

脱細胞化されたヒト肝臓スキャフォールドを、走査型電子顕微鏡検査により分析した。ＳＥＭ画像は、スキャフォールドの無細胞性を確認し、肝細胞によって一旦占拠された明確に規定される空間（すなわち、肝細胞不含空間）の存在を示した。門脈路及び小葉構造と同様に、肝細胞不含空間を組織する結合組織線維の三次元網目構造が非常に保存されていることが分かった（図１５〜図１７）。

Claims (14)

1. ヒト肝臓スキャフォールドを製造する方法であって、
   （ｉ）全肝臓又はその機能的単位を含む健康な又は病的なヒト肝臓組織中の細胞を機械的に傷害することと、
   （ｉｉ）前記肝臓組織を低張性試薬又は高張性試薬に暴露することによって前記組織中の細胞を浸透圧ストレスに供することと、
   （ｉｉｉ）任意に、前記組織をプロテアーゼ及び／又はＤＮＡａｓｅに暴露することと、
   （ｉｖ）前記組織を洗浄剤に暴露することと、
   （ｖ）工程（ｉｉ）、工程（ｉｉｉ）及び工程（ｉｖ）の各々を任意の順序で１回又は複数回繰り返すことと、
   を含み、それによりヒト肝臓スキャフォールドを製造し、
   前記ヒト肝臓組織を工程（ｉｉ）〜（ｖ）の間に、工程（ｉｉ）〜（ｉｖ）の２以上の繰返しに亘って最大値まで次第に増加した後に維持する速度で前記ヒト肝臓組織を逆行性に灌流することによって発生させられるフローせん断応力に供する、
   方法。
2. （ｉ）前記組織を１巡又は複数巡回（round）の凍結及び解凍に供することによって、又は（ｉｉ）前記組織をＨＩＦＵ又は超音波処理に供することによって、前記細胞を機械的に傷害する、請求項１に記載の方法。
3. 前記低張性剤が脱イオン水である、及び／又は前記高張性剤が水又は生理食塩水である、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記組織を工程（ｉｉｉ）においてプロテアーゼ、任意にトリプシン又はプロナーゼに暴露する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記洗浄剤がアニオン性洗浄剤、任意にドデシルリン酸ナトリウム（ＳＤＳ）又はデオキシコール酸ナトリウム（ＳｄＣ）である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記洗浄剤がイオン性洗浄剤、任意にポリエチレングリコールｐ−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェニルエーテル（Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（商標））である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
7. 初期灌流速度が０．１ｍｌ／分／組織グラム〜１．９９ｍｌ／分／組織グラムである、及び／又は前記標的灌流速度が２ｍｌ／分／組織グラム〜２０ｍｌ／分／組織グラムである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 工程（ｖ）が、
   ａ）前記肝臓組織を通る灌流によって次の順序：（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）、［（ｉｉ）、（ｉｖ）］ｎ、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、［（ｉｉ）、（ｉｖ）］ｎ（ここで、ｎは１〜２５である）で工程（ｉｉ）〜工程（ｉｖ）を繰り返すこと、又は
   ｂ）前記肝臓組織を通る灌流によって工程（ｉｉ）及び工程（ｉｖ）を１回〜２５回繰り返すこと、
   を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記肝臓組織を表１に示される灌流レジメンに供する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記スキャフォールドを脱細胞化の後に滅菌することを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 前記スキャフォールドを細胞により再増殖させて人工肝臓組織を製造することを含み、任意に、前記細胞が、ヒト初代肝臓細胞及び細胞株肝臓細胞、ヒト初代肝細胞、内皮細胞、ヒトｉＰＳＣ又は患者特異的ｉＰＳＣ由来細胞、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）、ヒト胎生幹細胞、ヒト癌細胞、及びヒト内皮前駆細胞（ＥＰＣ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
12. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって製造されたヒト肝臓スキャフォールド、又は請求項１１に記載の方法によって製造された人工肝臓組織。
13. ヒト肝臓スキャフォールドをそれを必要とする個体に移植することを含む肝疾患又は肝機能障害の治療方法における使用のための、
    請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって製造されたヒト肝臓スキャフォールド。
14. ヒト人工肝臓組織をそれを必要とする個体に移植すること、又は
    人工ヒト肝臓組織を、それを必要とする個体の血管系に、前記個体からの循環血が前記組織を通過して前記個体へと戻るように、前期組織が個体に肝臓機能を提供するように、体外で接続すること
    を含む肝疾患又は肝機能障害の治療方法における使用のための、
    請求項１１に記載の方法によって製造されたヒト人工肝臓組織。