CN109679891B - 一种新型人肝脏生物支架立体培养系统下乙肝病毒感染模型的建立 - Google Patents

一种新型人肝脏生物支架立体培养系统下乙肝病毒感染模型的建立 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物研究领域，具体涉及一种新型人肝脏生物支架立体培养系统下乙肝病毒感染模型的建立。本发明经过广泛而深入的研究发现，建立了一种乙肝病毒感染模型，该模型的主要特点是感染效率高，进行感染时所使用的病毒量远远低于其他模型，但是病毒在细胞内的复制水平高。另外，该模型的感染持续时间长，一般的原代肝细胞体外感染只能持续10天左右，而本发明的模型感染时间可持续近20天。此外，本发明模型中肝细胞的表达接近于体内真实状态，可用于抗乙型肝炎药物的筛选。

Description

一种新型人肝脏生物支架立体培养系统下乙肝病毒感染模型 的建立
技术领域
本发明属于生物研究领域，具体涉及一种新型人肝脏生物支架立体培养系统下乙肝病毒感染模型的建立。
背景技术
乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染呈世界范围广泛流行，是危害国民健康和造成国民经济损失最严重的疾病之一。人乙肝病毒具有明显的种属特异性，仅仅对大猩猩，恒河猴等灵长类动物易感，而细胞模型中只有人原代肝细胞能在一定程度上部分还原HBV感染过程，但原代肝细胞来源困难，伦理学要求高；体外培养容易“去分化”从而丧失正常的细胞表型与功能；同时原代肝细胞价格昂贵，因此，原代肝细胞不适合HBV感染常规研究模型。肝肿瘤细胞在组织来源上与肝组织接近，同时具备无限增殖能力，但肝肿瘤细胞无法自然感染HBV，必须借助脂质体等转染试剂将HBV病毒导入细胞内，HBV进入肝肿瘤细胞后存在时间仅为短短数天(7-10天)，随着细胞分裂即不再表达HBV相关蛋白。这类瞬时转染模型可以在一定程度上观察HBV急性感染后宿主的变化，以及一些处理手段在短期内对HBV的作用效果，对于HBV慢性化以及肿瘤发生相关研究并不合适。目前，常用的HBV体外模型主要为整合HBV基因组的肝癌细胞株(HepG2.2.15、HepAD38等)，由于将HBV基因组整合到细胞基因组中，因此HBV可稳定的复制、表达。HBV稳定整合细胞系在HBV药物筛选、宿主-病毒相互作用研究中发挥了积极作用，但由于HBV基因组已整合入细胞基因组中，因此此类模型无法模拟HBV感染过程，2012年，李文辉团队率先发现钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白(sodium taurocholate cotransporting polypeptide，NTCP)是乙型肝炎和丁型肝炎病毒功能性受体，这一发现对于乙肝领域的研究影响深远，通过构建稳定表达NTCP的肝癌细胞株，可以实现对肝肿瘤细胞对HBV的自然感染，用于HBV入侵机制的研究以及相关药物的筛选。但整合NTCP的肝肿瘤细胞仍然面临HBV感染效率普遍低下，同时肿瘤细胞的表型与正常肝细胞表型差异巨大，体内重复性差等问题。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于一种新型人肝脏生物支架立体培养系统下乙肝病毒感染模型的建立。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种乙肝病毒感染模型的建立方法，包括如下步骤：(a)将肝细胞植入到肝硬化ECM生物支架或正常肝脏ECM生物支架中，获得含有肝细胞的ECM生物支架；(b)将乙型肝炎病毒转染步骤(a)获得的含有肝细胞的ECM生物支架，获得乙肝病毒感染模型。
一种实施方式中，所述肝硬化ECM生物支架为人源性肝硬化ECM生物支架。
一种实施方式中，所述正常肝脏ECM生物支架为正常人源性肝脏ECM生物支架。
一种实施方式中，先将肝硬化ECM生物支架或正常肝脏ECM生物支架进行消毒，再将肝细胞植入。
一种实施方式中，所述肝细胞选自原代肝细胞、肝癌细胞、原代肝脏实质细胞、永生化的肝肿瘤细胞。
一般地，所述原代肝脏实质细胞包括肝脏细胞以及肝星状细胞。一般地，所述永生化的肝肿瘤细胞包括HepG2细胞、SK细胞、Huh7细胞等。
一种实施方式中，所述肝细胞为人源性肝细胞。
一种实施方式中，所述肝硬化ECM生物支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将离体的硬化肝脏组织，用抗凝剂灌洗，去除脉管中的血细胞及血凝块，清洗，切割后进行低温冷冻；
(2)将冷冻后的离体硬化肝脏组织，进行融化，切割成小块；
(3)将小块的硬化肝脏组织，去除细胞，获得肝硬化ECM生物支架。
一种实施方式中，所述肝硬化ECM生物支架为人源性肝硬化ECM生物支架。
一种实施方式中，所述硬化肝脏组织为人硬化肝脏组织。
所述人硬化肝脏组织是指患有肝硬化的人的肝脏组织。
所述步骤(1)中，所述抗凝剂选自肝素、枸橼酸钠或二乙酸二乙胺。
所述二乙酸二乙胺简称EDTA。
所述步骤(1)中，清洗的时候，可使用的清洗液选自PBS、0.9％氯化钠水溶液。
所述步骤(1)中，所述低温冷冻中的低温是-60～-100℃。优选地，所述低温为-70～-90℃。再优选地，所述低温为-80℃。
所述步骤(1)中，切割时，可按照肝组织解剖学结构将肝脏进行切割。例如，可按照肝组织解剖学结构依照Couinaud分段法将肝脏切割成八段。具体的，该切割法以门静脉，肝静脉以及镰状韧带对肝脏进行分段。按照肝组织解剖学结构依照Couinaud分段法有利于对肝脏进行良好切割。
所述步骤(1)中，所述低温冷冻的作用是低温冷冻条件下可避免组织蛋白结构变性降解，微生物污染导致组织结构变质，有利于组织长期保存。
所述步骤(2)中，融化时可将肝脏组织置于冰上、或将肝脏组织置于4℃条件下。
所述步骤(2)中，融化后的离体硬化肝脏组织，沿其长轴进一步切割为高5-6mm片状结构，并在此基础上将肝脏组织进一步切割为小块。
切割时如将肝脏组织变软不利于切割，可将其至于冰箱冷冻室冷冻，当肝脏组织变硬后，即可切割。重复该步骤直至切割完毕为止。切割时舍弃大血管周围肝脏组织。
所述步骤(2)中，所述小块的大小是(5～7)mm*(5～7)mm*(5～7)mm。
优选的实施方式中，所述步骤(2)中，切成小块的肝硬化组织再次进行低温冷冻。所述低温冷冻中的低温是-60～-100℃。优选地，所述低温为-70～-90℃。再优选地，所述低温为-80℃。
所述步骤(2)中，所述低温冷冻的作用是低温条件下冷冻有效防止蛋白质变性降解，微生物污染导致变质。
所述步骤(3)中，去除细胞的方法，包括如下步骤：1)将小块的硬化肝脏组织置于超纯水或去离子水中，静置；2)继续于超纯水或去离子水中振荡；3)转移至SDS水溶液中，进行振荡；4)转移至曲拉通水溶液中，进行振荡；5)转移至超纯水或去离子水中，进行振荡。
优选地，所述步骤1)中，在25-37℃条件下静置。
在25-37℃条件下，温度的上升使得细胞内晶体破裂，对细胞造成损伤，同时低渗透压造成细胞肿胀破裂，有助于后期清洗。
优选地，所述步骤1)中，静置60～90min。
优选地，所述步骤2)中，振荡频率为4米/秒。每次振荡的时间为15-25s。共振荡20-30次。
优选地，所述步骤3)中，所述SDS水溶液的质量体积比浓度是0.25％～0.5％。所述SDS是指十二烷基硫酸钠。
优选地，所述步骤3)中，振荡频率为4米/秒。每次振荡的时间为15-20秒。共振荡3-5次。
优选地，所述步骤4)中，所述曲拉通水溶液的质量百分浓度是1％-3％。所述曲拉通也可用Triton-100表示。
优选地，所述步骤4)中，所述曲拉通水溶液可以用吐温水溶液代替。
所述吐温水溶液可以是吐温20水溶液，所述吐温20水溶液的质量体积比浓度为0.25％-0.5％。
优选地，所述步骤4)中，振荡频率为4米/秒。每次振荡的时间为15～20秒。共振荡3～5次。
优选地，所述步骤5)中，振荡频率为4米/秒。每次振荡的时间为15-20秒。共振荡3-5次。
一种实施方式中，所述正常肝脏ECM生物支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将离体的正常肝脏组织，用抗凝剂灌洗，去除脉管中的血细胞及血凝块，清洗，切割成小块后进行低温冷冻；
(2)将冷冻后的小块的正常肝脏组织，去除细胞，获得正常肝脏ECM生物支架。
一种实施方式中，所述正常肝脏ECM生物支架为正常人源性肝脏ECM生物支架。
所述正常肝脏组织为人正常肝脏组织。
所述步骤(1)中，所述抗凝剂选自肝素、枸橼酸钠或二乙酸二乙胺。
所述二乙酸二乙胺简称EDTA。
所述步骤(1)中，清洗的时候，可使用的清洗液选自PBS、0.9％氯化钠水溶液。
所述步骤(1)中，所述低温冷冻中的低温是-60～-100℃。优选地，所述低温为-70～-90℃。再优选地，所述低温为-80℃。
切割时如将肝脏组织变软不利于切割，可将其至于冰箱冷冻室冷冻，当肝脏组织变硬后，即可切割。重复该步骤直至切割完毕为止。切割时舍弃大血管周围肝脏组织。
所述步骤(1)中，所述低温冷冻的作用是低温冷冻条件下可避免组织蛋白结构变性降解，微生物污染导致组织结构变质，有利于组织长期保存。
所述步骤(1)中，所述小块的大小是(5～7)mm*(5～7)mm*(5～7)mm。
所述步骤(2)中，去除细胞的方法，包括如下步骤：1)将小块的正常肝脏组织置于超纯水或去离子水中，静置；2)继续于超纯水或去离子水中振荡；3)转移至SDS水溶液中，进行振荡；4)转移至曲拉通水溶液中，进行振荡；5)转移至超纯水或去离子水中，进行振荡。
优选地，所述步骤1)中，在25-37℃条件下静置。
在25-37℃条件下，温度的上升使得细胞内晶体破裂，对细胞造成损伤，同时低渗透压造成细胞肿胀破裂，有助于后期清洗。
优选地，所述步骤1)中，静置60～90min。
优选地，所述步骤2)中，振荡频率为35～45HZ。每次振荡的时间为2～3min。共振荡10～15次。
优选地，所述步骤3)中，所述SDS水溶液的质量体积比浓度是0.25％～0.5％。所述SDS是指十二烷基硫酸钠。
优选地，所述步骤3)中，振荡频率为30～40HZ。每次振荡的时间为2～3min。共振荡3～5次。
优选地，所述步骤4)中，所述曲拉通水溶液的质量百分浓度是1％～3％。所述曲拉通也可用Triton-100表示。
优选地，所述步骤4)中，所述曲拉通水溶液可以用吐温水溶液代替。
所述吐温水溶液可以是吐温20水溶液，所述吐温20水溶液的质量体积比浓度为0.25％-0.5％。
优选地，所述步骤4)中，振荡频率为30～40HZ。每次振荡的时间为2～3min。共振荡3～5次。
优选地，所述步骤5)中，振荡频率为30～40HZ。每次振荡的时间为2～3min。共振荡3～5次。
本发明的第二方面，提供一种由第一方面所述方法获得的乙肝病毒感染模型。
本发明的第三方面，提供前述第二方面所述乙肝病毒感染模型在筛选乙型肝炎治疗药物或抗乙型肝炎药物中的用途。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究，建立了一种乙肝病毒感染模型，该模型的主要特点是感染效率高，进行感染时所使用的病毒量远远低于其他模型，但是病毒在细胞内的复制水平高。另外，该模型的感染持续时间长，一般的原代肝细胞体外感染只能持续10天左右，而本发明的模型感染时间可持续近20天。此外，本发明模型中肝细胞的表达接近于体内真实状态，可用于抗乙型肝炎药物的筛选。
附图说明
图1：人肝硬化组织去细胞前后大体图。
图2：肝硬化组织去细胞前后DNA残留鉴定(Decellularized liver:去细胞肝脏，Freshliver：新鲜肝组织)。
图3：人源性肝硬化ECM生物支架组织学染色，左上图：苏木精-伊红染色，仅有细胞外基质着色(图中红色)，未见细胞；左下图：未处理肝硬化组织苏木精-伊红染色，可见肝小叶丧失正常结构，可见大量细胞核；右上图：人源性肝硬化ECM支架天狼星红染色，支架结构中可见大量胶原蛋白沉积；右下图：未处理肝硬化组织天狼星红染色；图中胶原蛋白染色呈红色，细胞核染成黄色。
图4：人源性肝硬化ECM生物支架扫面电镜图，上图：肝硬化组织去除细胞后获得的人源性肝硬化ECM生物支架保留原有组织结构，可见较多纤维结构，未见细胞核残留；下图：未经处理肝硬化支架可见大量细胞核结构。
图5：正常人源性肝组织及正常人源性肝脏ECMS生物支架大体图。
图6：正常人源性肝脏ECM生物支架DNA残留。
图7：正常人源性肝脏ECM生物支架组织学染色。
图8：人原代肝细胞植入正常人源性肝脏ECM生物支架，其中，1-1：人原代肝细胞植入正常人源性肝脏ECM生物支架H&E染色；1-2：人原代肝细胞在2D及3D培养条件下细胞基因表达水平变化。
图9：人原代肝细胞植入人源性肝硬化ECM生物支架，2-1：人原代肝细胞植入人源性肝硬化ECM生物支架后H&E染色，2-2：人原代肝细胞在正常人源性肝脏ECM生物支架及人源性肝硬化ECM生物支架培养下细胞基因表达水平变化。
图10：人原代肝细胞在正常人源性肝脏ECM生物支架上立体培养后感染HBV病毒，3-1：原代肝细胞在正常人源性肝脏ECM生物支架立体培养与传统培养条件下感染HBV研究示意图；3-2：正常人源性肝脏ECM生物支架立体培养模型(3D)与传统平面培养模型(2D)HBV病毒复制中间体差异；3-3：正常人源性肝脏ECM生物支架立体培养模型(3D)与传统平面培养模型(2D)HBV病毒前基因组RNA(pgRNA)与总RNA(total RNA)表达差异；3-4：正常人源性肝脏ECM生物支架立体培养模型(3D)与传统平面培养模型(2D)HBV表面抗原分泌差异。
图11：人原代肝细胞在人源性肝硬化ECM生物支架培养并感染HBV病毒，4-1：人原代肝细胞在人源性肝硬化ECM生物支架及正常人源性肝脏ECM生物支架下HBV病毒复制水平变化；4-2：两种立体培养模式下HBV pgRNA及总RNA变化；4-3：两种立体培养模式下HBV表面抗原分泌。
图12：肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架立体培养并感染HBV病毒，5-1：HepG2-NTCP立体培养下HBV DNA水平动态变化；5-2：HepG2-NTCP立体培养下HBV表面抗原分泌变化；5-3：HepG2-NTCP立体培养下细胞活性动态变化。
图13：抗HBV药物恩替卡韦抑制立体模型下HBV感染，6-1：恩替卡韦抑制HepG2-NTCP立体培养模型下HBV DNA表达；6-2：恩替卡韦对HepG2-NTCP立体培养模型下HBV表面抗原表达无影响。
具体实施方式
理想的体外感染模型应具有如下特征：
1、细胞表型及功能接近体内状态，具有较高肝细胞特异性基因表达；2、支持高水平长时间HBV复制及表达；3、稳定性好，同时来源广泛，易于取材。近年来，细胞立体培养技术的开展，为HBV感染模型的建立提供了思路。细胞立体培养主要是利用合成材料(例如：多聚体，水凝胶)以及天然材料替代传统塑料及玻璃平板，用于细胞培养。通过立体培养，细胞肝细胞能够在体外维持细胞极性，保持分化状态，维持细胞正常生理功能。
本发明利用来源于肝肿瘤患者癌旁健康或人肝硬化肝组织，经过处理后得到肝生物肝脏生物支架，通过生物支架对人原代肝细胞及肝肿瘤细胞(例如，HepG2-NTCP)进行立体培养，建立HBV感染模型。该模型具有以下优势：1、支架组织来源于人，成分与人肝脏组织接近，人原代肝细胞及HepG2-NTCP细胞在支架培养下具有较高活性，较传统平面培养相比，能够维持部分肝脏特异基因表达。2、利用肝硬化生物支架对细胞进行立体培养，大幅提高HBV感染效率。相同感染条件下，立体培养肝源性细胞在病毒DNA、RNA水平以及蛋白表达较传统平面培养下高数倍甚至数十倍。3、该系统的建立支持抗HBV药物筛选，具有良好的应用前景。
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1人源性肝硬化ECM生物支架的制备及鉴定
一、实验方法
(一)人硬化肝脏组织的获取
收集重庆医科大学附属儿童医院肝移植患者硬化肝脏组织，通过重庆医科大学附属儿童医院伦理委员会审核通过，与患者及家属签署知情同意书，术中硬化肝脏组织离体后，予以肝素灌洗所述硬化肝脏组织2-3次，去除脉管中的血细胞及血凝块，采用PBS清洗后，按照肝组织解剖学结构依照Couinaud分段法将肝脏切割成八段，该切割法以门静脉，肝静脉以及镰状韧带对肝脏进行分段，切割后置于-80℃冰箱中进行低温冷冻、保存。
(二)人源性肝硬化ECM生物支架的制备
1、切割及保存
将冷冻后的离体人肝硬化组织放于冰上或4℃条件，待其缓慢融化，而后沿着肝脏组织的长轴将其切割为高5-6mm片状结构，在此基础上将所述人肝硬化组织进一步切割成大小约(5～7)mm*(5～7)mm*(5～7)mm的小块，切割时如将肝脏组织变软不利于切割，可将其至于冰箱冷冻室冷冻30min，当肝脏组织变硬后，即可切割。重复该步骤直至切割完毕为止。切割时舍弃大血管周围肝脏组织。小块的人肝硬化组织应尽量避开较大的血管。切割好后的小块的人肝硬化组织再次放于-80℃冰箱进行低温冷冻、备用。低温冷冻条件下可避免组织蛋白结构变性降解，微生物污染导致组织结构变质，有利于组织长期保存。
2、去细胞
所需设备：ALLSHENG-Bioprep-24Homogenizer
试剂及配方(以1L计)：
表1
Figure BDA0001910606140000091
步骤：
表2
Figure BDA0001910606140000092
3、去细胞后，获得人源性肝硬化ECM生物支架。
(三)人源性肝硬化ECM生物支架残余DNA鉴定
分别将初始的肝硬化组织及上述第(二)部分制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架放于液氮研磨成粉末状，并于微量电子秤上称量重量，后将组织粉末溶于1000ul去离子水中，室温10000g离心1min，蛋白酶K消化，酚氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于去离子水中。取上清1ul，Nanodrop定量检测样本中双链DNA含量。
(四)组织学染色
将上述第(二)部分制备成功的无细胞的人源性肝硬化ECM生物支架以及新鲜肝纤维化组织，放于4％多聚甲醛固定，经过石蜡包埋处理，制备5um切片，经脱蜡固定，苏木精-伊红染色，观察组织结构及细胞残留情况。
(五)扫描电镜检测
将上述第(二)部分制备获得的无细胞的人源性肝硬化生物ECM生物支架及新鲜肝硬化组织放于戊二醛中固定，样本送至重庆医科大学电子显微镜室进行扫描电镜检测(日立S3000N)。
(六)结果
1、人源性肝硬化ECM生物支架外观
将收集的人肝硬化组织，将其切割为大小约125mm3大小后冷冻保存于-80℃低温冰箱中，待使用时迅速复温至室温，并将其置入超纯水或去离子水中，组织细胞在低渗透压环境中出现肿胀破碎，通过机械振荡及反复洗涤，最终洗脱掉组织中原有的细胞结构。由于支架结构致密，依靠超纯水能够去除细胞，但对于核酸及蛋白质的残留去除较差，因此为了进一步去除附着于支架中的核酸和蛋白，在后期加入0.5％SDS及1％Triton-100，其中SDS为离子型剂去污剂，裂解细胞能力强，能有效去除细胞残存的蛋白及核酸，但其缺点在于对蛋白质结构破坏较大。单纯使用SDS作为制备支架试剂最后所得支架蛋白质，糖氨聚糖含量明显低于正常。因此，在制备过程中不主张单独使用或者使用较高浓度的SDS。Triton-100为非离子型去垢剂，其作用温和，对蛋白结构影响不大，但缺点在于对核酸去除效果差，容易导致核酸残留。在本发明制备方法中，结合两种类型去垢剂作用特点，通过试验，最后选定SDS以及Triton的浓度，制备，例如，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(20次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 5次后，可以看见肝硬化组织由之前的黄绿色转为白色半透明状(如图1所示)。
2、DNA残留鉴定
合格的ECM生物支架要求每毫克干重的组织中双链DNA含量不能超50ng。本发明将上述(二)中制备好的人源性肝硬化ECM生物支架首先通过液氮研磨成粉末状并称取其重量，将组织粉末溶解于水中，10000g室温离心1min，取上清进行DNA含量检测。将新鲜的肝硬化组织样本经过同样处理作为对照。结果如图2表明，利用本发明方法制备的人源性肝硬化ECM生物支架其DNA残留在10ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的肝硬化组织其DNA量高达7000ng/mg左右。这一结果也证实，利用本法去除肝硬化组织中的DNA是可行的。
3、细胞残留鉴定
为了进一步评估应用本发明方法所制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架制备效果，本发明将上述(二)中制备的人肝硬化生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，同时利用天狼星红染色评估组织胶原沉积情况。结果如图3显示，与新鲜肝硬化组织样本相比较，采用本发明方法制备的人源性肝硬化ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备人源性肝硬化ECM生物支架。天狼星红颜色也证实生物支架中胶原蛋白含量多，与新鲜肝硬化组织结构相类似。
4、扫描电镜染色了解人源性肝硬化ECM生物支架的组织结构
最后，本发明采用扫描电镜观察了上述(二)中制备的人肝硬化生物支架的超微结构，通过与新鲜肝硬化组织行比较，如图4所示，无细胞的人源性肝硬化ECM生物支架在超微结构上与新鲜肝硬化组织接近，但无细胞残留。
实施例2
本实施例中制备了正常人源性肝脏ECM生物支架。
一、实验方法
(一)正常人源性肝脏组织的获取
收集重庆医科大学附属儿童医院肝脏肿瘤切除术癌旁正常组织及肝移植术供体废弃组织，通过重庆医科大学附属儿童医院伦理委员会审核通过，与患者及家属签署知情同意书，术中正常肝脏组织离体后，予以肝素溶液灌洗2次，去除脉管系统中的血细胞以及血凝块，切割成大小约(5～7)mm*(5～7)mm*(5～7)mm的小块，置于-80℃冰箱中进行低温冷冻、保存。
(二)正常人源性肝脏ECM生物支架的制备方法，包括如下步骤：
1、去细胞
待使用时，将大小约(5～7)mm*(5～7)mm*(5～7)mm的小块置于超纯水或去离子水中静置60min后，使用组织研磨仪(上海般若生物科技有限公司)进行反复振荡清洗，去除组织原有细胞，制备正常人源性肝脏ECM生物支架。具体的制备方案参照表3。
表3：正常人源性肝脏ECM生物支架制备流程
Figure BDA0001910606140000121
2、去细胞后，获得正常人源性肝脏ECM生物支架。
(三)正常人源性肝脏ECM生物支架残余DNA鉴定
将获得的正常人源性肝脏ECM生物支架放于液氮研磨成粉末状，并于微量电子秤上称量重量，后将组织粉末溶于1000ul去离子水中，室温10000g离心1min，蛋白酶K消化，酚氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于去离子水中。取上清1ul，Nanodrop定量检测样本中双链DNA含量。
(四)组织学染色
将获得的正常人源性肝脏ECM生物支架以及新鲜肝纤维化组织，放于4％多聚甲醛固定，经过石蜡包埋处理，制备5um切片，经脱蜡固定，苏木精-伊红染色，观察组织结构及细胞残留情况。
(五)结果
1、正常人源性肝脏ECM生物支架外观
正常肝组织较为柔软，因此在制备正常人源性肝脏ECM生物支架时，振荡强度不可过大，避免因此导致组织结构的破坏。切割好的正常人源性ECM支架首先于低温保存，待使用时迅速复温至室温，并将其置入超纯水或去离子水中，组织细胞在低渗透压环境中出现肿胀破碎，通过机械振荡及反复洗涤，最终洗脱掉组织中原有的细胞结构，在后期加入0.5％SDS及1％Triton-100，其中SDS为离子型剂去污剂，裂解细胞能力强，能有效去除细胞残存的蛋白及核酸，但其缺点在于对蛋白质结构破坏较大。单纯使用SDS作为制备支架试剂最后所得支架蛋白质，糖氨聚糖含量明显低于正常。因此，在制备过程中不主张单独使用或者使用较高浓度的SDS。Triton-100为非离子型去垢剂，其作用温和，对蛋白结构影响不大，但缺点在于对核酸去除效果差，容易导致核酸残留。在本发明制备方法中，结合两种类型去垢剂作用特点，通过试验，最后选定SDS以及Triton的浓度，制备，例如，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 3次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状(如图5所示)。
2、DNA残留鉴定
合格的ECM生物支架要求每毫克干重的组织中双链DNA含量不能超50ng。本发明将制备好的正常人源性肝脏ECM生物支架首先通过液氮研磨成粉末状并称取其重量，将组织粉末溶解于水中，10000g室温离心1min，取上清进行DNA含量检测。将新鲜的离体的正常肝脏组织样本经过同样处理作为对照。结果如图6表明，利用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右。这一结果也证实，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。
3、细胞残留鉴定
组织学证实无细胞核残留是支架制备成功的另一标准，为了进一步评估应用本发明方法所制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架制备效果，本发明将制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色，以了解组织中是否存在细胞残留。结果如图7显示，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。
实施例3乙肝病毒感染模型的建立
一、试验方法
1细胞立体培养
1.1、人源性肝硬化ECM生物支架及正常人源性肝脏ECM生物支架的消毒
将实施例1中制备合格的人源性肝硬化ECM生物支架及实施例2中制备合格的正常人源性肝脏ECM生物支架分别置于0.1％过氧乙酸溶液中，摇床轻摇30min后更换新的0.1％过氧乙酸，轻摇15min后，无菌PBS溶液10min清洗2次。最后置于紫外线下消毒2h。
1.2、细胞立体培养
1.2.1、原代肝细胞立体培养
人原代肝细胞(Primary Human Hepatocyte,PHH)培养于肝细胞培养基(Sciencell公司，货号5210)，接种前将细胞重悬于培养基中并计数，将已消毒的人源性肝硬化ECM生物支架及正常人源性肝脏ECM生物支架分别转移至96孔板中，将混合的细胞悬液以悬滴的形式分别滴于人源性肝硬化ECM生物支架及正常人源性肝脏ECM生物支架表面，细胞接种密度为5*105cell/支架，37℃孵育1.5h后，将细胞悬液再次滴入人源性肝硬化ECM生物支架及正常人源性肝脏ECM生物支架上，37℃继续孵育30min，后加入140ul细胞培养基过夜，并于细胞接种后第二天将含有细胞的人源性肝硬化ECM生物支架及含有细胞的正常人源性肝脏ECM生物支架转移至含1.4ml培养基的48孔板中。
1.2.2、肝肿瘤细胞HepG2-NTCP立体培养
取对数期生长的HepG2-NTCP细胞，0.25％胰酶消化计数，将细胞重悬于培养基中，将已消毒的人源性肝硬化ECM生物支架及正常人源性肝脏ECM生物支架分别转移至96孔板中，将混合的细胞悬液以悬滴的形式分别滴于人源性肝硬化ECM生物支架及正常人源性肝脏ECM生物支架表面，细胞密度为1*106cell/支架，37℃孵育1.5h后加入140ul细胞培养基过夜，并于细胞接种后第二天将含有细胞的人源性肝硬化ECM生物支架及含有细胞的正常人源性肝脏ECM生物支架转移至含1.4ml培养基的48孔板中。
1.3、细胞换液
接种于人源性肝硬化ECM生物支架上的细胞及接种于正常人源性肝脏ECM生物支架上的细胞每2-3天更换细胞培养基，操作时用镊子将含有细胞的人源性肝硬化ECM生物支架及含有细胞的正常人源性肝脏ECM生物支架轻轻夹住，并迅速转移至含有新鲜培养基的48孔板中。
2 HBV感染立体培养细胞
2.1、HBV病毒颗粒富集
将整合有HBV基因组的HepAD38细胞接种于10cm2培养皿中，收集细胞培养基，在培养基中加入35％PEG8000使其终浓度为5％，4℃混合过夜，次日予以酚氯仿抽提，乙醇沉淀后，qPCR检测病毒滴度，-80℃保存备用。
2.2、HBV病毒感染
在感染前24h，将进行立体培养的HepG2-NTCP细胞或者原代肝细胞的培养基更换为感染培养基(William’s E培养基，10％FBS，1％PS双抗，2mM L-谷氨酰胺，2％DMSO)。于感染当天，将含有原代肝细胞或者HepG2-NTCP细胞转移至96孔板，将HBV病毒悬液溶于150ul感染培养基中，使最终感染细胞的病毒量为每个细胞1000HBV基因当量(1000GE/cell)，感染后24h将支架在PBS溶液中清洗1-2次，后转入48孔板中，继续培养。每3-4天更换培养基。
3 HBsAg检测
收集细胞上清1ml，700g离心3min，将上清转移至新的EP管中，利用乙肝表面抗原ELISA检测试剂盒(上海科华)检测上清HBsAg表达。
4 HBV复制中间体检测
1xPBS清洗细胞支架3次，转移至含500ul DNA裂解液(10mM Tris-HCl，PH8.0,1mMEDTA,1％NP-40,2％蔗糖)的EP管中，组织匀浆机充分裂解破碎，37℃孵育15min，16000g离心5min，将上清转移至新的EP管，加入5ul 1M MgCl2，4ul DNA酶(5U/ul)，37℃水浴4h，9000g离心1min，收集上清加入35％PEG8000 200ul冰浴1h，4℃11000g离心5min弃上清，加入500ul消化液和10ul蛋白酶K，45℃消化过夜。次日，等体积苯酚-氯仿抽提2次后加入70％体积异丙醇，1ul糖原，4℃，20000g离心30min，弃上清，加入1ml 70％乙醇，4℃，20000g离心10min，弃上清，风干后加入10ul去离子水。利用荧光定量PCR检测HBV复制中间体表达，引物序列:上游：5’-CCTAGTAGTCAGTTATGTCAAC-3’(SEQIDNO.1),下游:5’-TCTATAAGCTGGAGGAGTGCGA-3’(SEQIDNO.2)；
5 HBV cccDNA检测
将感染HBV的细胞支架用1xPBS清洗3次，转移至EP管中，加入500ul cccDNA裂解液(20mM Tris-HCl PH8.0，5mM EDTA，0.4M NaCl，1％SDS)充分匀浆，加入10ul蛋白酶K裂解液，56℃孵育4h，等体积苯酚-氯仿抽提2次后加入等体积异丙醇，-80℃1h沉淀DNA，4℃，10000rpm，离心20min，弃上清，加入70％乙醇，4℃，6000rpm，离心5min，弃上清，风干后加入50ul去离子水，检测总DNA量取入500ng DNA，加入0.5ul PSAD(plasmid safe ATP-dependent DNase)酶，37℃孵育8h后70℃30min灭活酶活性。
取1ul样本，qPCR检测cccDNA表达，引物序列：
上游5’-CTCCCCGTCTGTGCCTTCT-3’(SEQIDNO.3)；
下游5’-GCCCCAAAGCCACCCAAG-3’(SEQIDNO.4)；
FAM探针5’-ACGTCGCATGGAGACCACCGTGAACGCC-3’(SEQIDNO.5)；
6 HBV RNA检测
将感染HBV的细胞支架用1xPBS清洗3次，转移至EP管中，加入1ml Trizol充分匀浆后加入200ul三氯甲烷，剧烈振荡混匀，室温静置5min，4℃，13000rpm离心10min，将上层清夜转移至新的EP管中，加入70％体积异丙醇，剧烈颠倒混匀4℃，13000rpm离心10min，弃上清，加入1ml 75％乙醇，4℃，13000rpm离心10min，弃上清，风干后加入30ul DEPC水溶解后定量。去1000ng RNA进行逆转录，qPCR检测HBV基因组及前基因组表达水平，采用相对定量法，以β-actin作为内参基因。
8组织学染色
将组织支架用固定于多聚甲醛中，采用石蜡包埋固定，切片。先后经过二甲苯，乙醇脱蜡，苏木精染色10分钟后，自来水冲洗后伊红染色2min，后于乙醇，二甲苯固定。盖上盖片，显微镜下观察。
9恩替卡韦处理
HepG2-NTCP细胞接种于人源性肝硬化ECM生物支架或正常人源性ECM生物支架并感染HBV，感染后24h后加入恩替卡韦悬液，终浓度30nM，每48h换液，感染后5天提取复制中间体，qPCR检测HBV-DNA水平，收集上清，ELISA检测HBsAg水平。
二、试验结果
1、人原代肝细胞植入人源性肝硬化ECM生物支架或正常人源性肝脏ECM生物支架情况
1.1、原代肝细胞在正常人源性肝脏ECM生物支架上生长情况
传统的平面培养(2D)所采用的支持支撑材料为坚硬的塑料及玻璃材质，具体的，此处所指的二维(2D)培养方法是指：将原代细胞复苏后重悬并接种于10cm2塑料培养皿上，待细胞贴壁后观察细胞生长及融合情况，并给予相应的处理。
三维(3D)培养是将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好(图8中的1-1)。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞(图8中的1-2)。
1.2、原代肝细胞在肝硬化支架上生长情况
多项研究表明，传统的平面培养(2D)由于支撑材料为坚硬的塑料及玻璃材质，因此细胞在体外培养过程中往往丧失原有特性。而本发明的人源性肝硬化ECM生物支架最大可能的模拟了细胞生活的内环境，使细胞在体外培养下及功能、表型及极性更接近体内真实情况。利用本发明实施例1所制作的人源性肝硬化ECM生物支架，我们对人原代肝细胞(Primary Human Hepatocytes,PHH)进行三维(3D)培养，通过苏木精-伊红染色进一步证实PHH细胞能够顺利植入ECM生物支架。
具体的，此处所指的二维(2D)培养方法是指：原代肝细胞经复苏后，600g，2min离心重悬，将细胞重悬液接种于10cm2细胞培养皿，于复苏后第二天换液，观察细胞生长情况，待细胞生长至95-100％融合时进行传代并给予相应操作。(传代过程：用PBS清洗细胞2次，0.25％胰蛋白酶37℃消化1-2min后，轻柔吹打培养皿，让细胞从培养皿上脱离下来，收集细胞悬液600g离心2min，利用培养基重悬细胞，接种于新的培养皿上或细胞培养板上，根据实验需求进行相应操作)。
三维(3D)培养是指将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好(图9中的2-1)。提取细胞总RNA检测肝组织相关基因表达，结果显示在人源性肝硬化ECM生物支架立体培养下，除甲胎蛋白外明显升高外，肝特异性基因表达与肝脏正常人源性肝脏ECM支架表达类似(图9中的2-2)。
最后，还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。
2、人原代肝细胞立体培养支持高效HBV感染
2.1、人原代肝细胞在正常人源性肝脏ECM生物支架上感染HBV
将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达(图10的3-1：原代肝细胞立体培养HBV病毒感染系统示意图；图10的3-2：HBV-DNA检测结果；图10的3-3：HBV RNA检测结果；图10的3-4：HBV表面抗原检测结果)。
2.2、人原代肝细胞在人源性肝硬化ECM生物支架上感染HBV
将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达(图11中4-1：HBV-DNA检测结果；图11中4-2：HBV RNA检测结果；图11中4-3：HBV表面抗原检测结果)。
慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是肝硬化及肝癌的主要病因之一。研究表明，HBV携带者肝癌的发病机率较非HBV携带者高100倍。由于HBV病毒严格的种属特异性以及嗜肝性，目前尚无理想的体外模型能够高效感染HBV病毒，同时支持高水平及长时间复制。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBVreplicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
3、肝癌细胞(HepG2-NTCP)植入正常人源性肝脏ECM生物支架并支持HBV感染
将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达(图12中5-1：HBV-DNA检测结果，图12中5-2：HBV蛋白检测结果，图12中5-3：HepG2-NTCP细胞活性检测)。
4、肝癌细胞(HepG2-NTCP)立体培养与抗HBV药物
同本实施例第3部分中，立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大(图13中6-1：恩替卡韦处理对HBV DNA水平影响；图13中6-2：恩替卡韦处理对HBsAg水平影响)。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
实施例4
4-1、实验发现，采用枸橼酸钠代替实施例1中第(一)部分中的肝素，灌洗所述硬化肝脏组织，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(20次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 5次后，可以看见肝硬化组织由之前的黄绿色转为白色半透明状。最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架其DNA残留在10ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的肝硬化组织其DNA量高达7000ng/mg左右，说明，利用本法去除肝硬化组织中的DNA是可行的。最终制备的人肝硬化生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，同时利用天狼星红染色评估组织胶原沉积情况，与新鲜肝硬化组织样本相比较，采用本发明方法制备的人源性肝硬化ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备人源性肝硬化ECM生物支架。天狼星红颜色也证实生物支架中胶原蛋白含量多，与新鲜肝硬化组织结构相类似。采用扫描电镜观察最终制备的人肝硬化生物支架的超微结构，通过与新鲜肝硬化组织行比较，无细胞的人源性肝硬化ECM生物支架在超微结构上与新鲜肝硬化组织接近，但无细胞残留。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-2、实验发现，采用二乙酸二乙胺代替代替实施例1中第(一)部分中的肝素，灌洗所述硬化肝脏组织，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(20次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 5次后，可以看见肝硬化组织由之前的黄绿色转为白色半透明状。最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架其DNA残留在10ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的肝硬化组织其DNA量高达7000ng/mg左右，说明，利用本法去除肝硬化组织中的DNA是可行的。最终制备的人肝硬化生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，同时利用天狼星红染色评估组织胶原沉积情况，与新鲜肝硬化组织样本相比较，采用本发明方法制备的人源性肝硬化ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备人源性肝硬化ECM生物支架。天狼星红颜色也证实生物支架中胶原蛋白含量多，与新鲜肝硬化组织结构相类似。采用扫描电镜观察最终制备的人肝硬化生物支架的超微结构，通过与新鲜肝硬化组织行比较，无细胞的人源性肝硬化ECM生物支架在超微结构上与新鲜肝硬化组织接近，但无细胞残留。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-3、实验发现，采用0.9％氯化钠水溶液，也就是生理盐水来代替实施例1第(一)部分的PBS清洗，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(20次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 5次后，可以看见肝硬化组织由之前的黄绿色转为白色半透明状。最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架其DNA残留在10ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的肝硬化组织其DNA量高达7000ng/mg左右，说明，利用本法去除肝硬化组织中的DNA是可行的。最终制备的人肝硬化生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，同时利用天狼星红染色评估组织胶原沉积情况，与新鲜肝硬化组织样本相比较，采用本发明方法制备的人源性肝硬化ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备人源性肝硬化ECM生物支架。天狼星红颜色也证实生物支架中胶原蛋白含量多，与新鲜肝硬化组织结构相类似。采用扫描电镜观察最终制备的人肝硬化生物支架的超微结构，通过与新鲜肝硬化组织行比较，无细胞的人源性肝硬化ECM生物支架在超微结构上与新鲜肝硬化组织接近，但无细胞残留。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-4、实验发现，实施例1第(一)部分中，低温冷冻时的温度可以是-60℃、-70℃、-90℃、或-100℃，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-5、实验发现，实施例1第(一)部分中，融化时，将肝脏组织置于4℃条件下，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-6、实验发现，实施例1第(二)部分中，低温冷冻时的温度可以是-60℃、-70℃、-90℃、或-100℃，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-7、实验发现，实施例1第(二)部分步骤1)中，静置60min或90min，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-8、实验发现，实施例1第(二)部分步骤2)中，每次振荡的时间为15s或25s，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-9、实验发现，实施例1第(二)部分步骤2)中，共振荡30次，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-10、实验发现，实施例1第(二)部分步骤3)中，SDS水溶液的质量体积比浓度为0.25％，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-11、实验发现，实施例1第(二)部分步骤3)中，每次振荡的时间为15s，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-12、实验发现，实施例1第(二)部分步骤3)中，共振荡3次，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-13、实验发现，实施例1第(二)部分步骤4)中，每次振荡的时间为15s，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-14、实验发现，实施例1第(二)部分步骤4)中，共振荡3次，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-15、实验发现，实施例1第(二)部分步骤4)中，曲拉通水溶液的质量百分浓度是为3％，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-16、实验发现，实施例1第(二)部分步骤4)中，曲拉通水溶液用吐温水溶液代替，吐温水溶液的质量体积比浓度为0.25％或0.5％，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBVreplicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-17、实验发现，实施例1第(二)部分步骤5)中，每次振荡15s，其他均与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
4-18、实验发现，实施例1第(二)部分步骤5)中，共振荡5次，其他均与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例3相同的方法，将原代肝细胞植入此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架、然后感染乙型肝炎病毒。具体的，将原代肝细胞接种入人源性肝硬化ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，发现PHH(原代肝细胞)能够植入人源性肝硬化ECM生物支架中并生长良好。还发现，原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养时间可长达2周以上，当原代肝细胞(PHH)在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下(在人源性肝硬化ECM生物支架上培养)原代肝细胞(PHH)的细胞活性更高。将原代肝细胞(PHH)在人源性肝硬化ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，正常人源性肝脏ECM生物支架相比，人原代肝细胞在人源性人源性肝硬化ECM生物支架立体培养条件下，能较好维持HBV复制，转录及表达。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicative intermediates)亦显著升高。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人源性肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
实施例5
5-1、实验发现，采用枸橼酸钠代替实施例2中第(一)部分中的肝素，灌洗所述离体后的正常肝脏组织，其他与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 3次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-2、实验发现，采用二乙酸二乙胺代替代替实施例2中第(一)部分中的肝素，灌洗所述离体后的正常肝脏组织，其他与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 3次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-3、实验发现，采用0.9％氯化钠水溶液，也就是生理盐水来代替实施例2第(一)部分的PBS清洗，其他与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 3次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-4、实验发现，实施例1第(一)部分中，低温冷冻时的温度可以是-60℃、-70℃、-90℃、或-100℃，其他与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 3次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-5、实验发现，实施例2第(二)部分步骤1)中，静置90min，其他与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 3次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-6、实验发现，实施例2第(二)部分步骤2)中，每次振荡的时间为3min，其他与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 3次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-7、实验发现，实施例2第(二)部分步骤3)中，SDS水溶液的质量体积比浓度为0.25％，其他与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 3次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-8、实验发现，实施例2第(二)部分步骤3)中，每次振荡的时间为3min，其他与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 3次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-9、实验发现，实施例2第(二)部分步骤3)中，每次振荡的时间为3min，其他与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 3次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-10、实验发现，实施例2第(二)部分步骤4)中，每次振荡3min，其他与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-1003次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-11、实验发现，实施例2第(二)部分步骤4)中，曲拉通水溶液的质量百分浓度是为3％，其他与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 3次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-12、实验发现，实施例2第(二)部分步骤4)中，曲拉通水溶液用吐温水溶液代替，吐温水溶液的质量体积比浓度为0.25％或0.5％，其他与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 3次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-13、实验发现，实施例2第(二)部分步骤5)中，每次振荡3min，其他均与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-1003次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
5-14、实验发现，实施例2第(二)部分步骤5)中，共振荡5次，其他均与实施例2相同，最终制备获得的正常人源性肝脏组织，与实施例2中制备获得的正常人源性肝脏组织类似。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏组织进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(10-15次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-1003次后，可以看见正常肝脏组织由之前的黄红色转为白色半透明状。最终制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架其DNA残留在20ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的正常肝脏组织其DNA量高达10000ng/mg左右，说明，利用本法去除正常肝脏组织中的DNA是可行的。最终制备的正常人源性肝脏ECM生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，与新鲜肝脏组织样本相比较，采用本发明方法制备的正常人源性肝脏ECM生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备正常人源性肝脏ECM生物支架。采用与实施例3相同的方法，对此处制备获得的正常人源性肝脏ECM生物支架进行原代肝细胞/肝癌细胞植入然后进行乙型肝炎病毒感染。具体的，将PHH(原代肝细胞)接种入正常人源性肝脏ECM生物支架。7天后，H&E染色观察细胞植入情况，结果显示，PHH(原代肝细胞)能够植入正常人源性肝脏ECM生物支架中并生长良好。为了进一步比较三维(3D)及二维(2D)培养条件下PHH(原代肝细胞)基因表达水平的差异，提取PHH(原代肝细胞)总RNA，通过qPCR检测肝组织相关甲胎蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)、胆汁酸代谢相关基因表达(UTG1A1)，细胞色素450系统基因表达，结果显示，通过立体培养(3D)细胞其基因表达水平明显高于传统平面(2D)培养细胞。将原代肝细胞(PHH)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养7天后感染HBV病毒，再连续培养7天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg、HBV前基因组RNA(pgRNA)和总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养原代肝细胞(PHH)HBV感染维持时间更长，能够更好支持HBV复制，转录及表达。将肝癌细胞(HepG2-NTCP)在正常人源性肝脏ECM生物支架上培养，7天后感染HBV病毒，在连续培养5,10,15，20,25天后，检测细胞中HBV复制中间体，HBsAg以及HBcAg、总RNA水平，结果显示，同传统平面培养相比较，立体培养HepG2-NTCP细胞HBV感染维持时间更长，并支持HBV复制及表达。立体培养肝癌细胞(HepG2-NTCP)感染HBV后加入恩替卡韦混悬液，5天后提取HBV复制中间体检测HBV-DNA水平，结果显示在感染HBV的立体培养系统中，加入抗HBV抑制药物恩替卡韦能够明显抑制病毒DNA水平，而其蛋白表达水平影响不大。说明，本发明建立的乙肝病毒感染模型可用于筛选乙肝治疗药物。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (3)

1.一种乙肝病毒感染模型的建立方法，包括如下步骤： （a）将肝细胞植入到肝硬化ECM 生物支架或正常肝脏 ECM 生物支架中，获得 含有肝细胞的 ECM 生物支架；所述正常肝脏 ECM 生物支架为正常人源性肝脏 ECM 生物支架；所述正常肝脏组织为人正常肝脏组织；所述肝硬化 ECM 生物 支架为人源性肝硬化 ECM 生物支架； 先将肝硬化 ECM 生物支架或正常肝脏 ECM 生物支架进行消毒，再将肝细胞植 入；所述肝细胞选自原代肝细胞、肝癌细胞； 所述肝硬化 ECM 生物支架的制备方法，包括以下步骤： （1）将离体的人硬化肝脏组织，用抗凝剂灌洗，去除脉管中的血细胞及血凝块， 清洗，切割后于-60~-100℃温度下进行低温冷冻；所述抗凝剂选自肝素、枸橼 酸钠或二乙酸二乙胺；清洗的时候，使用的清洗液选自 PBS、0.9%氯化钠水溶 液； （ 2 ） 将 冷 冻 后 的 离 体 人 硬 化 肝 脏 组 织 ，进 行 融 化 ， 切 割 成 （5~7）mm*（5~7）mm*（5~7）mm 的小块；切成小块的人肝硬化组织于-60~-100℃温度下进行低温冷冻；融化时可将肝脏组织置于冰上、或将肝脏 组织置于 4℃条件下； （3）将冷冻后的小块人硬化肝脏组织，去除细胞，获得人源性肝硬化 ECM 生 物支架； 所述去除细胞的方法，包括如下步骤： 1）将小块的人硬化肝脏组织置于超纯水或去离子水中，静置 60~90min； 2）继续于超纯水或去离子水中振荡； 3）转移至质量体积比浓度 0.25%~0.5%的 SDS 水溶液中，进行振荡，振荡频率 为 4 米/秒，每次振荡的时间为15-25s，共振荡 20-30 次； 4）转移至质量体积比 0.25%的吐温水溶液、质量百分浓度 1%-3%的曲拉通水溶 液或质量百分浓度 1%Triton 溶液中，进行振荡，振荡频率为 4 米/秒，每次振荡 的时间为 15-25s，共振荡 20-30 次； 5）转移至超纯水或去离子水中，进行振荡，振荡频率为 4 米/秒，每次振荡的 时间为 15-20 秒，共振荡 3-5 次； 所述正常肝脏ECM 生物支架的制备方法，包括以下步骤： （1）将离体的人正常肝脏组织，用抗凝剂灌洗，去除脉管中的血细胞及血凝块， 清洗，切割后于-60~-100℃温度下进行低温冷冻；所述抗凝剂选自肝素、枸橼 酸钠或二乙酸二乙胺；清洗的时候，使用的清洗液选自 PBS、0.9%氯化钠水溶 液；所述离体的人正常肝脏组织来自于肝脏肿瘤切除术癌旁正常组织及肝移植 术供体废弃组织； （2）将冷冻后的小块人正常肝脏组织，去除细胞，获得人源性正常 ECM 生物 支架； 所述去除细胞的方法，包括如下步骤： 1）将小块的人正常肝脏组织置于超纯水或去离子水中，静置 60~90min； 2）继续于超纯水或去离子水中振荡； 3）转移至质量体积比浓度 0.5%的 SDS 水溶液中，进行振荡，振荡频率为 30-40Hz，每次振荡的时间为 2min，共振荡 3-5 次； 3）转移至质量体积比 0.25%的吐温水溶液、质量百分浓度 1%-3%的曲拉通水溶 液或质量百分浓度 1%Triton 溶液中，进行振荡，振荡频率为 30-40Hz，每次振 荡的时间为 2min，共振荡 3-5 次； 4）转移至超纯水或去离子水中，进行振荡，振荡频率为30-40Hz，每次振荡的 时间为 2min，共振荡 3 次； （b）将乙型肝炎病毒转染步骤（a）获得的含有肝细胞的 ECM 生物支架，获得 乙肝病毒感染模型。
2. 如权利要求 1 所述方法获得的乙肝病毒感染模型。
3. 如权利要求 2 所述的乙肝病毒感染模型在筛选乙型肝炎治疗药物或抗乙型肝 炎药物中的用途。
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