CN109536436A - 一种人源性肝硬化ecm生物支架的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物研究领域，具体涉及一种人源性肝硬化ECM生物支架的制备方法。本发明经过广泛而深入的研究发现，采用强力振荡+充分清洗的策略，成功制备无细胞的肝纤维化组织支架，利用DNA及组织学检测均提示无DNA及细胞残留，符合生物支架的制备要求，是一种全新的人源性肝硬化ECM生物支架制备技术。

Description

一种人源性肝硬化ECM生物支架的制备方法
技术领域
本发明属于生物研究领域，具体涉及一种人源性肝硬化ECM生物支架的制备方法。
背景技术
细胞外基质(Extra Cellular Matrix,ECM)由组织细胞分泌形成，其主要成分为胶原蛋白(collagen)、弹性蛋白(Elastin)、蛋白多糖(Proteoglycans，PGs)以及糖蛋白(glyconproteins)等。细胞外基质是细胞赖以生存的微环境，在维持组织形态、诱导组织细胞粘附生长等方面发挥重要作用。不仅如此，细胞外基质ECM通过分泌包括转化生长因子(TGF-beta)、表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)、Wnt信号蛋白等多种信号分子调节ECM的支架结构，参与调控细胞生长与分化，胚胎发育，维护组织器官生理功能。ECM成分改变及结构失衡与疾病发生息息相关，当胶原蛋白在组织大量沉积时导致组织硬度增加，进而促进组织纤维化发生；当ECM的量与质发生变化时，相应的，生长于其中的组织细胞在表型及功能上发生一系列适应性改变，并在疾病发生发展中起到重要作用。已有研究发现，在正常及疾病状态下，ECM成分、细胞表型变化均表现出较大差异。对于疾病状态下ECM及组织细胞的变化研究，有助于我们更深入的了解疾病的发病机理，为临床疾病的预防、治疗及控制提供依据。
细胞外基质生物支架(Extra Cellular Matrix bio-Scaffold，ECM bio-Scaffold)是利用理化的方法去除组织原有细胞，保留细胞外基质成分及组织支架结构。ECM生物支架组织在胞培养、组织再生等领域具有广泛的应用前景。ECM生物支架能最大限度的模拟细胞在体内的微环境，并能与细胞相互作用，相较于传统的培养皿培养细胞，利用ECM生物支架作为培养平台对组织细胞进行立体培养能够更好的模拟组织细胞在体内的形态及功能，是良好的体外研究平台。已有不少研究小组通过对ECM支架进行修饰改造后植入动物体内，以期达到组织再生及功能替代的作用。
表1：立体培养与平面培养在细胞生理功能上的差异及其机制
ECM生物支架制备的原理在于最大限度的原组去除组织结构中的细胞以及核酸，减少ECM支架的免疫源性，与此同时，尽可能保留组织结构的天然形态，以利于细胞生长。截止目前，ECM生物支架主要的制备方法是采用灌流法。该方法将组织器官部分或全部浸入灌流液中，利用组织器官原有的脉管网络，将灌流液灌入组织器官中，以此形成一个循环，洗脱组织器官中原有的细胞。灌流液的选择多种多样，从离子型去污剂、非离子型去污剂甚至部分消毒剂均被用于组织灌流法之中。利用组织灌流法已成功在鼠、猪、兔等动物模型上建立ECM生物支架，生物支架种类已涵盖肺、肝、食道、小肠、膀胱上皮、皮肤、脂肪、胰腺等几乎所有的组织脏器。
然而，源于动物的细胞外基质由于其种系及结构上的差异，在人类疾病的相关研究中仍存在缺陷与不足。能够较好的促进细胞分化，增殖以及组织修复及重塑的ECM支架应该是来自同源组织的天然生物支架。目前人脏器组织的ECM生物支架还为数不多，一方面，来源的缺乏以及伦理的限制使人源性正常组织获取困难。另一方面，采用制备动物ECM生物支架的方法，往往不能在人组织脏器上制备出合格的ECM生物支架。来自意大利的研究小组采用组织灌流法比较了其在猪肝脏组织及5例人肝脏组织中的去细胞效果。结果发现，利用组织灌流法可以完全去除猪肝脏组织中的细胞，而相对于5例正常人肝脏组织，仅仅只有1例肝脏组织中细胞被完全去除，剩余4例均含有较多细胞。这一研究证实，适合于动物的灌流法并不完全适用人类组织器官。对于来自于人体的组织进行ECM生物支架的制备应该依据组织结构特点采用不同的方法。目前全球尚无对肝硬化生物支架制备技术的相关报道。肝硬化组织支架来源广泛，伦理学争议小。同时，肝硬化是肝细胞癌最常见原因之一，约90％左右肝细胞癌来源于肝硬化组织，因此，建立肝纤维化组织支架，对于我们深入研究肿瘤发生机制，评价相关药物效果，探索新新的治疗手段均具有积极意义。人肝硬化ECM生物支架制备难点在于组织结构致密，硬度大，常规手段难以有效去除细胞及基因组DNA。
发明内容
为了克服现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于一种人源性肝硬化ECM生物支架的制备方法。
为了实现上述目的以及其他相关目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种人源性肝硬化ECM生物支架的制备方法，包括以下步骤：
(1)将离体的人硬化肝脏组织，用抗凝剂灌洗，去除脉管中的血细胞及血凝块，清洗，切割后进行低温冷冻；
(2)将冷冻后的离体人硬化肝脏组织，进行融化，切割成小块；
(3)将小块的人硬化肝脏组织，去除细胞，获得人源性肝硬化ECM生物支架。
所述步骤(1)中，所述人硬化肝脏组织是指患有肝硬化的人的肝脏组织。
所述步骤(1)中，所述抗凝剂选自肝素、枸橼酸钠或二乙酸二乙胺。
所述二乙酸二乙胺简称EDTA。
所述步骤(1)中，清洗的时候，可使用的清洗液选自PBS、0.9％氯化钠水溶液。
所述步骤(1)中，所述低温冷冻中的低温是-60～-100℃。优选地，所述低温为-70～-90℃。再优选地，所述低温为-80℃。
所述步骤(1)中，切割时，可按照肝组织解剖学结构将肝脏进行切割。例如，可按照肝组织解剖学结构依照Couinaud分段法将肝脏切割成八段。具体的，该切割法以门静脉，肝静脉以及镰状韧带对肝脏进行分段。按照肝组织解剖学结构依照Couinaud分段法有利于对肝脏进行良好切割。
所述步骤(1)中，所述低温冷冻的作用是低温冷冻条件下可避免组织蛋白结构变性降解，微生物污染导致组织结构变质，有利于组织长期保存。
所述步骤(2)中，融化时可将肝脏组织置于冰上、或将肝脏组织置于4℃条件下。
所述步骤(2)中，融化后的离体人硬化肝脏组织，沿其长轴进一步切割为高5-6mm片状结构，并在此基础上将肝脏组织进一步切割为小块。
切割时如将肝脏组织变软不利于切割，可将其至于冰箱冷冻室冷冻，当肝脏组织变硬后，即可切割。重复该步骤直至切割完毕为止。切割时舍弃大血管周围肝脏组织。
所述步骤(2)中，所述小块的大小是(5～7)mm*(5～7)mm*(5～7)mm。
优选的实施方式中，所述步骤(2)中，切成小块的人肝硬化组织再次进行低温冷冻。所述低温冷冻中的低温是-60～-100℃。优选地，所述低温为-70～-90℃。再优选地，所述低温为-80℃。
所述步骤(2)中，所述低温冷冻的作用是低温条件下冷冻有效防止蛋白质变性降解，微生物污染导致变质。
所述步骤(3)中，去除细胞的方法，包括如下步骤：1)将小块的人硬化肝脏组织置于超纯水或去离子水中，静置；2)继续于超纯水或去离子水中振荡；3)转移至SDS水溶液中，进行振荡；4)转移至曲拉通水溶液中，进行振荡；5)转移至超纯水或去离子水中，进行振荡。
优选地，所述步骤1)中，在25-37℃条件下静置。
在25-37℃条件下，温度的上升使得细胞内晶体破裂，对细胞造成损伤，同时低渗透压造成细胞肿胀破裂，有助于后期清洗。
优选地，所述步骤1)中，静置60～90min。
优选地，所述步骤2)中，振荡频率为4米/秒。每次振荡的时间为15-25s。共振荡20-30次。
优选地，所述步骤3)中，所述SDS水溶液的质量体积比浓度是0.25％～0.5％。所述SDS是指十二烷基硫酸钠。
优选地，所述步骤3)中，振荡频率为4米/秒。每次振荡的时间为15-20秒。共振荡3-5次。
优选地，所述步骤4)中，所述曲拉通水溶液的质量百分浓度是1％-3％。所述曲拉通也可用Triton-100表示。
优选地，所述步骤4)中，所述曲拉通水溶液可以用吐温水溶液代替。
所述吐温水溶液可以是吐温20水溶液，所述吐温20水溶液的质量体积比浓度为0.25％-0.5％。
优选地，所述步骤4)中，振荡频率为4米/秒。每次振荡的时间为15～20秒。共振荡3～5次。
优选地，所述步骤5)中，振荡频率为4米/秒。每次振荡的时间为15-20秒。共振荡3-5次。
本发明的第二方面，提供一种由前述制备方法获得的人源性肝硬化ECM生物支架。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明经过广泛而深入的研究发现，采用强力振荡+充分清洗的策略，成功制备无细胞的肝纤维化组织支架，利用DNA及组织学检测均提示无DNA及细胞残留，符合生物支架的制备要求，是一种全新的人源性肝硬化ECM生物支架制备技术。
附图说明
图1：人肝硬化组织去细胞前后大体图。
图2：肝硬化组织去细胞前后DNA残留鉴定(Decellularized liver:去细胞肝脏，Fresh liver：新鲜肝组织)。
图3：人源性肝硬化ECM生物支架组织学染色，左上图：苏木精-伊红染色，仅有细胞外基质着色(图中红色)，未见细胞；左下图：未处理肝硬化组织苏木精-伊红染色，可见肝小叶丧失正常结构，可见大量细胞核；右上图：人源性肝硬化ECM支架天狼星红染色，支架结构中可见大量胶原蛋白沉积；右下图：未处理肝硬化组织天狼星红染色；图中胶原蛋白染色呈红色，细胞核染成黄色。
图4：人源性肝硬化ECM生物支架扫面电镜图，上图：肝硬化组织去除细胞后获得的人源性肝硬化ECM生物支架保留原有组织结构，可见较多纤维结构，未见细胞核残留；下图：未经处理肝硬化支架可见大量细胞核结构。
图5：对人原代肝细胞(Primary Human Hepatocytes,PHH)进行三维培养，通过苏木精-伊红染色进一步证实PHH细胞能够顺利植入ECM生物支架。
图6：生物支架三维培养下PHH相关基因表达水平更高。
图7：PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养。
图8：三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBV replicativeintermediates)亦显著升高。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。
当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；theseries METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS INENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，AcademicPress，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，ChromatinProtocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。
实施例1人源性肝硬化ECM生物支架的制备及鉴定
一、实验方法
(一)人硬化肝脏组织的获取
收集重庆医科大学附属儿童医院肝移植患者硬化肝脏组织，通过重庆医科大学附属儿童医院伦理委员会审核通过，与患者及家属签署知情同意书，术中硬化肝脏组织离体后，予以肝素灌洗所述硬化肝脏组织2-3次，去除脉管中的血细胞及血凝块，采用PBS清洗后，按照肝组织解剖学结构依照Couinaud分段法将肝脏切割成八段，该切割法以门静脉，肝静脉以及镰状韧带对肝脏进行分段，切割后置于-80℃冰箱中进行低温冷冻、保存。
(二)人源性肝硬化ECM生物支架的制备
1、切割及保存
将冷冻后的离体人肝硬化组织放于冰上或4℃条件，待其缓慢融化，而后沿着肝脏组织的长轴将其切割为高5-6mm片状结构，在此基础上将所述人肝硬化组织进一步切割成大小约(5～7)mm*(5～7)mm*(5～7)mm的小块，切割时如将肝脏组织变软不利于切割，可将其至于冰箱冷冻室冷冻30min，当肝脏组织变硬后，即可切割。重复该步骤直至切割完毕为止。切割时舍弃大血管周围肝脏组织。小块的人肝硬化组织应尽量避开较大的血管。切割好后的小块的人肝硬化组织再次放于-80℃冰箱进行低温冷冻、备用。低温冷冻条件下可避免组织蛋白结构变性降解，微生物污染导致组织结构变质，有利于组织长期保存。
2、去细胞
所需设备：ALLSHENG-Bioprep-24Homogenizer
试剂及配方(以1L计)：
表2
步骤：
表3
3、去细胞后，获得人源性肝硬化ECM生物支架。
(三)人源性肝硬化ECM生物支架残余DNA鉴定
分别将初始的肝硬化组织及上述第(二)部分制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架放于液氮研磨成粉末状，并于微量电子秤上称量重量，后将组织粉末溶于1000ul去离子水中，室温10000g离心1min，蛋白酶K消化，酚氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于去离子水中。取上清1ul，Nanodrop定量检测样本中双链DNA含量。
(四)组织学染色
将上述第(二)部分制备成功的无细胞的人源性肝硬化ECM生物支架以及新鲜肝纤维化组织，放于4％多聚甲醛固定，经过石蜡包埋处理，制备5um切片，经脱蜡固定，苏木精-伊红染色，观察组织结构及细胞残留情况。
(五)扫描电镜检测
将上述第(二)部分制备获得的无细胞的人源性肝硬化生物ECM生物支架及新鲜肝硬化组织放于戊二醛中固定，样本送至重庆医科大学电子显微镜室进行扫描电镜检测(日立S3000N)
(六)结果
1、人源性肝硬化ECM生物支架外观
将收集的人肝硬化组织，将其切割为大小约125mm3大小后冷冻保存于-80℃低温冰箱中，待使用时迅速复温至室温，并将其置入超纯水或去离子水中，组织细胞在低渗透压环境中出现肿胀破碎，通过机械振荡及反复洗涤，最终洗脱掉组织中原有的细胞结构。由于支架结构致密，依靠超纯水能够去除细胞，但对于核酸及蛋白质的残留去除较差，因此为了进一步去除附着于支架中的核酸和蛋白，在后期加入0.5％SDS及1％Triton-100，其中SDS为离子型剂去污剂，裂解细胞能力强，能有效去除细胞残存的蛋白及核酸，但其缺点在于对蛋白质结构破坏较大。单纯使用SDS作为制备支架试剂最后所得支架蛋白质，糖氨聚糖含量明显低于正常。因此，在制备过程中不主张单独使用或者使用较高浓度的SDS。Triton-100为非离子型去垢剂，其作用温和，对蛋白结构影响不大，但缺点在于对核酸去除效果差，容易导致核酸残留。在本发明制备方法中，结合两种类型去垢剂作用特点，通过试验，最后选定SDS以及Triton的浓度，制备，例如，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(20次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 5次后，可以看见肝硬化组织由之前的黄绿色转为白色半透明状(如图1所示)。
2、DNA残留鉴定
合格的ECM生物支架要求每毫克干重的组织中双链DNA含量不能超50ng。本发明将上述(二)中制备好的人源性肝硬化生物支架首先通过液氮研磨成粉末状并称取其重量，将组织粉末溶解于水中，10000g室温离心1min，取上清进行DNA含量检测。将新鲜的肝硬化组织样本经过同样处理作为对照。结果如图2表明，利用本发明方法制备的人源性肝硬化生物支架其DNA残留在10ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的肝硬化组织其DNA量高达7000ng/mg左右。这一结果也证实，利用本法去除肝硬化组织中的DNA是可行的。
3、细胞残留鉴定
为了进一步评估应用本发明方法所制备获得的人源性肝硬化生物支架制备效果，本发明将上述(二)中制备的人肝硬化生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，同时利用吉姆萨染色评估组织胶原沉积情况。结果如图3显示，与新鲜肝硬化组织样本相比较，采用本发明方法制备的人源性肝硬化生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备人源性肝硬化生物支架。天狼星红颜色也证实生物支架中胶原蛋白含量多，与新鲜肝硬化组织结构相类似。
4、扫描电镜染色了解人源性肝硬化生物支架的组织结构
最后，本发明采用扫描电镜观察了上述(二)中制备的人肝硬化生物支架的超微结构，通过与新鲜肝硬化组织行比较，如图4所示，无细胞的人源性肝硬化生物支架在超微结构上与新鲜肝硬化组织接近，但无细胞残留。
实施例2人源性肝硬化ECM生物支架的应用
一、人原代肝细胞在人源性肝硬化ECM生物支架生长及表达情况
多项研究表明，传统的平面培养由于支撑材料为坚硬的塑料及玻璃材质，因此细胞在体外培养过程中往往丧失原有特性。而本发明的人源性肝硬化ECM生物支架最大可能的模拟了细胞生活的内环境，使细胞在体外培养下及功能、表型及极性更接近体内真实情况。利用本发明实施例1所制作的人源性肝硬化ECM生物支架，我们对人原代肝细胞(Primary Human Hepatocytes,PHH)进行三维培养，通过苏木精-伊红染色进一步证实PHH细胞能够顺利植入ECM生物支架(图5)。为了进一步比较三维及二维培养条件下PHH基因表达水平的差异，提取PHH细胞总RNA，通过qPCR检测白蛋白(ALB)，甲胎蛋白(AFP)，肝细胞核因子4-ɑ(HNF4A)，细胞色素酶(CYP1A2,CYP3A4)基因表达差异，结果显示，生物支架三维培养下PHH相关基因表达水平更高(图6)。最后，PHH在生物支架上培养时间可长达2周以上，当PHH在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下PHH细胞活性更高。
二、人肝硬化ECM生物支架促进乙肝病毒感染
慢性乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是肝硬化及肝癌的主要病因之一。研究表明，HBV携带者肝癌的发病机率较非HBV携带者高100倍。由于HBV病毒严格的种属特异性以及嗜肝性，目前尚无理想的体外模型能够高效感染HBV病毒，同时支持高水平及长时间复制。采用本发明制备的人源性肝硬化ECM生物支架培养PHH并感染HBV病毒，利用qPCR检测PHH中其乙肝病毒RNA表达及HBV复制中间体水平，结果显示，PHH三维培养条件下，乙肝病毒总RNA(total RNA)及前基因组RNA(pgRNA，乙肝病毒DNA聚合酶，参与HBV病毒复制)表达明显高于二维培养(图7)。类似的，三维培养条件下，PHH细胞内乙肝病毒复制中间体(HBVreplicative intermediates)亦显著升高(图8)。上述结果表明，ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
实施例3
3-1、实验发现，采用枸橼酸钠代替实施例1中第(一)部分中的肝素，灌洗所述硬化肝脏组织，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(20次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 5次后，可以看见肝硬化组织由之前的黄绿色转为白色半透明状。最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架其DNA残留在10ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的肝硬化组织其DNA量高达7000ng/mg左右，说明，利用本法去除肝硬化组织中的DNA是可行的。最终制备的人肝硬化生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，同时利用吉姆萨染色评估组织胶原沉积情况，与新鲜肝硬化组织样本相比较，采用本发明方法制备的人源性肝硬化生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备人源性肝硬化生物支架。天狼星红颜色也证实生物支架中胶原蛋白含量多，与新鲜肝硬化组织结构相类似。采用扫描电镜观察最终制备的人肝硬化生物支架的超微结构，通过与新鲜肝硬化组织行比较，无细胞的人源性肝硬化生物支架在超微结构上与新鲜肝硬化组织接近，但无细胞残留。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估。具体的，结果显示，生物支架三维培养下PHH相关基因表达水平更高。PHH在生物支架上培养时间可长达2周以上，当PHH在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下PHH细胞活性更高。ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
3-2、实验发现，采用二乙酸二乙胺代替代替实施例1中第(一)部分中的肝素，灌洗所述硬化肝脏组织，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(20次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 5次后，可以看见肝硬化组织由之前的黄绿色转为白色半透明状。最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架其DNA残留在10ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的肝硬化组织其DNA量高达7000ng/mg左右，说明，利用本法去除肝硬化组织中的DNA是可行的。最终制备的人肝硬化生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，同时利用吉姆萨染色评估组织胶原沉积情况，与新鲜肝硬化组织样本相比较，采用本发明方法制备的人源性肝硬化生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备人源性肝硬化生物支架。天狼星红颜色也证实生物支架中胶原蛋白含量多，与新鲜肝硬化组织结构相类似。采用扫描电镜观察最终制备的人肝硬化生物支架的超微结构，通过与新鲜肝硬化组织行比较，无细胞的人源性肝硬化生物支架在超微结构上与新鲜肝硬化组织接近，但无细胞残留。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估。具体的，结果显示，生物支架三维培养下PHH相关基因表达水平更高。PHH在生物支架上培养时间可长达2周以上，当PHH在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下PHH细胞活性更高。ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
3-3、实验发现，采用0.9％氯化钠水溶液，也就是生理盐水来代替实施例1第(一)部分的PBS清洗，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估。具体的，经过超纯水或去离子水多次机械振荡(20次)，后继以0.5％SDS 5次及1％Triton-100 5次后，可以看见肝硬化组织由之前的黄绿色转为白色半透明状。最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架其DNA残留在10ng/mg组织干重左右，而未去除细胞的肝硬化组织其DNA量高达7000ng/mg左右，说明，利用本法去除肝硬化组织中的DNA是可行的。最终制备的人肝硬化生物支架进行苏木精-伊红染色了解组织中是否存在细胞残留，同时利用吉姆萨染色评估组织胶原沉积情况，与新鲜肝硬化组织样本相比较，采用本发明方法制备的人源性肝硬化生物支架，能够保持组织结构完整，无细胞残留。进一步证实，应用本发明方法可成功制备人源性肝硬化生物支架。天狼星红颜色也证实生物支架中胶原蛋白含量多，与新鲜肝硬化组织结构相类似。采用扫描电镜观察最终制备的人肝硬化生物支架的超微结构，通过与新鲜肝硬化组织行比较，无细胞的人源性肝硬化生物支架在超微结构上与新鲜肝硬化组织接近，但无细胞残留。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估。具体的，结果显示，生物支架三维培养下PHH相关基因表达水平更高。PHH在生物支架上培养时间可长达2周以上，当PHH在传统培养皿上培养至第10天时，往往丧失肝脏特异性基因表达，出现去分化现象。以上结果表明，三维培养下PHH细胞活性更高。ECM生物支架三维培养下HBV病毒感染效率明显高于传统二维培养，提示人肝硬化ECM生物支架在研究HBV感染方面具有良好的应用前景。
3-4、实验发现，实施例1第(一)部分中，低温冷冻时的温度可以是-60℃、-70℃、-90℃、或-100℃，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-5、实验发现，实施例1第(一)部分中，融化时，将肝脏组织置于4℃条件下，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-6、实验发现，实施例1第(二)部分中，低温冷冻时的温度可以是-60℃、-70℃、-90℃、或-100℃，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-7、实验发现，实施例1第(二)部分步骤1)中，静置90min，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-8、实验发现，实施例1第(二)部分步骤2)中，每次振荡的时间为15s或25s，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-9、实验发现，实施例1第(二)部分步骤2)中，共振荡30次，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-10、实验发现，实施例1第(二)部分步骤3)中，SDS水溶液的质量体积比浓度为0.25％，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-11、实验发现，实施例1第(二)部分步骤3)中，每次振荡的时间为15s，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-12、实验发现，实施例1第(二)部分步骤3)中，共振荡3次，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-13、实验发现，实施例1第(二)部分步骤4)中，每次振荡的时间为15s，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-14、实验发现，实施例1第(二)部分步骤4)中，共振荡3次，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-15、实验发现，实施例1第(二)部分步骤4)中，曲拉通水溶液的质量百分浓度是为3％，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-16、实验发现，实施例1第(二)部分步骤4)中，曲拉通水溶液用吐温水溶液代替，吐温水溶液的质量体积比浓度为0.25％或0.5％，其他与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-17、实验发现，实施例1第(二)部分步骤5)中，每次振荡15s，其他均与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
3-18、实验发现，实施例1第(二)部分步骤5)中，共振荡5次，其他均与实施例1相同，最终制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架，与实施例1中制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架类似。采用与实施例1相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例1类似的结论。采用与实施例2相同的方法，对此处制备获得的人源性肝硬化ECM生物支架进行评估，得出与实施例2一致的结论。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (12)

1.一种人源性肝硬化ECM生物支架的制备方法，包括以下步骤：(1)将离体的人硬化肝脏组织，用抗凝剂灌洗，去除脉管中的血细胞及血凝块，清洗，切割后进行低温冷冻；(2)将冷冻后的离体人硬化肝脏组织，进行融化，切割成小块；(3)将小块的人硬化肝脏组织，去除细胞，获得人源性肝硬化ECM生物支架。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述抗凝剂选自肝素、枸橼酸钠或二乙酸二乙胺。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述低温冷冻中的低温是-60～-100℃。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，融化时可将肝脏组织置于冰上、或将肝脏组织置于4℃条件下。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述小块的大小是(5～7)mm*(5～7)mm*(5～7)mm。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，切成小块的人肝硬化组织再次进行低温冷冻，所述低温冷冻中的低温是-60～-100℃。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，去除细胞的方法，包括如下步骤：1)将小块的人硬化肝脏组织置于超纯水或去离子水中，静置；2)继续于超纯水或去离子水中振荡；3)转移至SDS水溶液中，进行振荡；4)转移至曲拉通水溶液中，进行振荡；5)转移至超纯水或去离子水中，进行振荡。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，静置60～90min。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述SDS水溶液的质量体积比浓度是0.25％～0.5％。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述曲拉通水溶液的质量百分浓度是1％-3％。
11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项，a)所述步骤2)中，振荡频率为4米/秒，每次振荡的时间为15-25s，共振荡20-30次；b)所述步骤3)中，振荡频率为4米/秒，每次振荡的时间为15-20秒，共振荡3-5次；c)所述步骤4)中，所述曲拉通水溶液可以用吐温水溶液代替；d)所述步骤4)中，振荡频率为4米/秒，每次振荡的时间为15～20秒，共振荡3～5次；e)所述步骤5)中，振荡频率为4米/秒，每次振荡的时间为15-20秒，共振荡3-5次。
12.如权利要求1-11之任一项所述制备方法获得的人源性肝硬化ECM生物支架。
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