CN105251052A - 软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架及其制备方法 - Google Patents

软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架及其制备方法，属于生物组织工程技术。本发明用人、猪、牛或羊关节软骨制备出软骨细胞外基质，用桑蚕丝制备丝素蛋白，按特定比例混匀后在一定温度下定向结晶，冷冻干燥后首先经紫外线交联，再经碳化二亚胺及N-羟基琥珀酰亚胺或戊二醛、京尼平交联而成。这样设计的本发明，生物相容性好，避免发生免疫排斥反应；组成结构及力学性能与人软骨细胞外基质相似；且材料来源广泛，成本低，制备工艺简单，可用于构建组织工程软骨修复软骨退变，具有良好的临床应用前景。

Description

软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架及其制备方法
技术领域
本发明属于生物组织工程技术，具体是一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架及其制备方法。
背景技术
生物组织工程方法主要包括支架材料、种子细胞和信号因子三要素，其中，支架材料是组织工程构建的关键环节。理想的组织工程软骨支架材料应具有以下特征：良好的生物相容性；适当的可降解性；足够的孔隙结构；促进细胞粘附于增殖；支架的容积应能保持不变；不易从缺损区脱落；具有一定的弹性；具有关节软骨的取向结构；成分、形状、力学性能上与人软骨细胞外基质相似等。支架材料作为种子细胞的载体，不仅影响种子细胞的增殖与分化，而且还决定移植后能否与组织有效的结合，从而发挥其修复缺损软骨组织的作用。
可用于软骨支架构建的材料主要有合成材料、天然生物材料、仿生纳米材料等。早期应用于软骨组织工程的支架材料主要为单一的合成材料，如聚羟基乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）、聚乳酸聚羟基乙酸共聚物（PLGA）等。但由于合成材料生物相容性差、容易引起机体免疫排斥反应、体内降解速率慢等缺点，后来则倾向于应用生物相容性更好、体内降解速率可调控的天然生物材料如壳聚糖、明胶、Ⅱ型胶原、透明质酸、6-硫酸软骨素、软骨细胞外基质等。而为了克服单一天然生物材料力学强度不足、体内降解速率难以控制等不足，由两种或两种以上不同材料复合来优化材料的特性已经成为目前软骨组织工程研究热点，如I型胶原/透明质酸复合支架、Ⅱ型胶原/透明质酸复合支架、Ⅱ型胶原/透明质酸/6-硫酸软骨素复合支架、软骨细胞外基质/PLGA复合支架等。
关节软骨结构复杂并有很高程度的异质性，由软骨细胞外基质包绕软骨细胞组成，形成垂直于关节面的取向结构。目前国内对于组织工程软骨支架材料的研究多停留在孔隙无规则的支架上，模拟正常关节软骨取向结构支架的研究却很少见。
发明内容
本发明就是为了解决现有的软骨组织工程支架材料的性能以及支架孔隙结构不足的问题，所提出的一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架及其制备方法。
本发明是按照以下技术方案实现的。
一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架，由软骨外基质和丝素蛋白交联而成，孔隙结构为取向结构。
一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架的制备方法，包括以下步骤：
a.制备软骨细胞外基质冻干海绵
①切取关节软骨片,用含有苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液浸泡后粉碎为匀浆；
②差速离心法取500nm-5μm左右的软骨微丝；
③0～4℃下加入含TritonX-100和苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液震荡12～24h；
④离心，蒸馏水反复冲洗；再离心，加入DNaseI与RNaseA在震荡消化12～24h；
⑤离心，超纯水反复冲洗，冷冻干燥；
b.制备丝素蛋白溶液
①蚕丝脱胶:将蚕丝扯松放于Na2CO3溶液中煮沸30～60min；冲洗，用Na2CO3溶液继续煮沸30～60min，冲洗，晾干；
②取脱胶后的蚕丝溶于LiBr溶液，50～80℃下搅拌2～8h，制得丝素蛋白混合溶液；
③将丝素蛋白混合溶液装入透析袋中进行透析；
④将透析后的丝素蛋白溶液8000～12000rpm/min离心，上清液装入透析袋中再次透析，加入聚乙二醇溶液进行浓缩；
⑤将浓缩后的丝素蛋白溶液8000～12000rpm/min离心，取上清溶液保存备用；
c.支架构建和交联
将软骨细胞外基质冻干海绵溶于纯水后与丝素蛋白溶液混匀，注入模具，采用定向结晶技术在-15～-80℃下结晶12～24h，真空冷冻干燥12～24h；取出后，进行紫外线照射物理交联和化学试剂交联，烘干，灭菌。
本发明获得了如下的有益效果：本发明有效的解决了现有的软骨组织工程支架材料的性能以及支架孔隙结构不足的问题。本发明采用的人、猪、牛或羊关节软骨细胞外基质及丝素蛋白均属于天然生物材料，具有良好的生物相容性，软骨细胞外基质降解较快，丝素蛋白降解较慢，二者结合可调节降解速度使其更适于种子细胞繁殖和代谢。同时体系中丝素蛋白可提高支架生物力学强度；通过脱细胞系列处理去处抗原成分，避免发生免疫排斥反应、传播疾病；通过调节软骨细胞外基质及丝素蛋白的浓度及定向结晶时冷冻温度、降温速率等因素，控制多孔支架的微结构，制备出具有适宜孔径和孔隙率的三维取向支架；通过控制交联时间或交联剂浓度，调节支架的生物力学特性和降解速率,使组成结构及力学性能与正常软骨细胞外基质相似；可塑性好，制备工艺简单，可利用CAD设计和制造技术制备与退变软骨的形状、大小相同的复合取向支架材料，可用于构建组织工程软骨修复软骨退变，具有良好的临床应用前景。
附图说明
图1是本发明所采用的定向结晶过程示意图；
图2是本发明支架的结构示意图；
图3是本发明应力-应变曲线图；
图4是本发明HE染色放大50倍无细胞及细胞碎片残留图；
图5是本发明番红-O染色放大50倍图；
图6是本发明甲苯胺蓝染色放大50倍图；
图7是光镜下本发明横断面呈均匀三维网格状结构50倍放大图；
图8是光镜下本发明纵断面呈均匀三维管状取向结构50倍放大图；
图9是电镜下本发明横断面呈均匀三维网格状结构130倍放大图；
图10是电镜下本发明纵断面呈均匀三维管状取向结构130倍放大图；
图11是电镜下本发明内部孔壁结构8000倍放大图；
图12是CCK-8试剂盒检测支架浸提液培养下脂肪干细胞的增殖图；
图13是培养3天后Live/Dead染色脂肪干细胞在支架上分布平面图；
图14是培养3天后Live/Dead染色脂肪干细胞在支架上分布立体图；
图15是培养7天后Live/Dead染色脂肪干细胞在支架上分布平面图；
图16是培养7天后Live/Dead染色脂肪干细胞在支架上分布立体图。
图1中：1.模具；2.泡沫塑料套。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步说明。
1、制备猪软骨细胞外基质冻干海绵
切取新鲜猪关节软骨组织，操作方法如下：①用PH7.5，浓度为0.01M的Tris-Hcl缓冲液(含0.035mM苯甲基磺酰氟)浸泡软骨片后经组织粉碎机（品牌BILON；型号DS-1）粉碎为匀浆；②差速离心法取500nm-5μm左右的软骨微丝；③4℃下加入PH7.5的含1％TritonX-100的Tris-HCl缓冲液(含0.035mM苯甲基磺酰氟)震荡12h；④10000rpm/min离心后蒸馏水反复冲洗；⑤10000rpm/min离心后加入50U/mlDNaseI与1U/mlRNaseA在37℃下震荡消化12h；⑥10000rpm/min离心后超纯水反复冲洗,冷冻干燥后即得。
2、制备丝素蛋白溶液
以桑蚕丝为原料，操作方法如下：①蚕丝脱胶(碱煮):将Na2CO310.6g溶于5L纯水，将蚕丝扯松放于Na2CO3溶液中煮沸30min，时刻翻转。弃水，洗10次，用5LNa2CO3溶液继续煮沸30min，弃水，洗5-6次，拧干，通风处晾干；②40gLiBr溶于50ml纯水，取脱胶后的蚕丝10g溶于LiBr溶液，在60℃下搅拌4h，制得丝素蛋白混合溶液；③将丝素蛋白混合溶液装入截留分子量为12000～14000的透析袋中，用自来水透析两天，用蒸馏水透析一天，每天换4-5次水；④将透析后丝素蛋白溶液12000rpm/min离心15min，弃掉沉淀后装入截留分子量为3500的透析袋中，于20%聚乙二醇溶液中浓缩4-8h；⑤将浓缩后的丝素蛋白溶液12000rpm/min离心15min，弃掉沉淀后，取少量丝素蛋白溶液烘干法测浓度，剩余丝素蛋白溶液4℃保存，备用。
3、软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架构建和交联
将软骨细胞外基质冻干海绵溶于纯水后与丝素蛋白溶液混匀为浆料，浆料中软骨细胞外基质和丝素蛋白浓度均为3％，将浆料加入模具后采用定向结晶技术，-20℃冷冻结晶12h，真空冷冻干燥24h后将支架从模具中取出，先行紫外线照射物理交联，紫外线波长258nm，距离光源5～10cm，交联12h，然后在浓度为0.05M的碳化二亚胺和浓度为0.02M的N-羟基琥珀酰亚胺的混合乙醇溶液中交联24h，烘干，灭菌即得软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架。如图2所示，软骨支架的为圆柱体形，底面直径约为0.5cm，高约为0.3cm。
定向结晶技术是指在模具中建立特定方向的温度梯度,使模具内材料沿着与热流相反的方向,按照要求地取向结晶凝固的技术工艺。如图1所示，将软骨细胞外基质与丝素蛋白混合液加入到圆柱形PVC模具1中，模具1外套有具有保温作用的聚苯乙烯泡沫塑料套2，将带有模具1的泡沫塑料套2漂浮于温度可控的循环冷却液中。由于模具1底部接触循环冷却液，使模具1中底部混合液的温度与冷却液相同；上部混合液的温度与室温相同，形成温度梯度差，泡沫塑料套2的设置保证了该温度梯度差的稳定存在，模具1中混合液按照图1中箭头的方向进行结晶凝固，形成定向结晶。
4、软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向支架的生物力学性能
图3是本发明应力-应变曲线图。应力-应变曲线初始升段的斜率即为压缩弹性模量。应力-应变曲线图可见软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向支架组初始升段的斜率明显大于单纯软骨细胞外基质取向支架组，说明丝素蛋白的加入明显提高了支架的生物力学性能。
5、软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向支架的组织学及镜下观察
图4是本发明HE染色放大50倍无细胞及细胞碎片残留图。HE染色可见支架均质红染，两种材料结合均匀，无细胞残留。
图5是本发明番红-O染色放大50倍图。可见支架番红-O染色呈阳性，两种材料结合均匀。
图6是本发明甲苯胺蓝染色放大50倍图。可见支架甲苯胺蓝染色呈阳性，两种材料结合均匀。
图7是光镜下本发明横断面呈均匀三维网格状结构50倍放大图，图8是光镜下本发明纵断面呈均匀三维管状取向结构50倍放大图。光镜可见软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向支架呈三维立体多孔取向结构，孔隙相互贯通。
图9是电镜下本发明横断面呈均匀三维网格状结构130倍放大图，图10是电镜下本发明纵断面呈均匀三维管状取向结构130倍放大图，电镜可见软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向支架呈三维立体多孔取向结构，孔隙相互贯通。。
图11是电镜下本发明内部孔壁结构8000倍放大图，电镜可见软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向支架内部孔壁上分布大量纳米级纤维丝。
6、软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架的生物相容性
通过CellCountingKit-8（CCK-8试剂盒）法检测支架浸提液对细胞的毒性：将脂肪干细胞（ADSCs）用支架的浸提液以及含10%胎牛血清（FBS）的培养基（对照组）培养，于第1、3、5、7天通过CCK-8试剂盒检测脂肪干细胞的生长情况。每个时间点两组间均无统计学差异，表明支架无毒性，图12是CCK-8试剂盒检测支架浸提液培养下脂肪干细胞的增殖图。
Live/Dead检测细胞在支架上的生长情况：将脂肪干细胞接种到灭菌后的支架上，分别培养3天和7天后加入Live/Dead染液，共聚焦显微镜下观察细胞在支架上黏附与生长情况。培养3天后可见细胞均匀的分布在支架孔壁上，生长状况良好，无死细胞；培养7天后可见细胞较第3天时有明显的增殖，部分孔隙被细胞填满，个别死细胞。图13、14是培养3天后Live/Dead染色脂肪干细胞在支架上分布图，图15、16是培养7天后Live/Dead染色脂肪干细胞在髓核相支架上分布图。

Claims (10)

1.一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架，其特征在于：该支架由软骨细胞外基质和丝素蛋白交联而成，孔隙结构为取向结构。
2.根据权利要求1所述的一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架，其特征在于：所述软骨外基质来源于猪、或牛、或羊、或人的关节软骨。
3.根据权利要求1所述的一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架，其特征在于：所述丝素蛋白为桑蚕丝蛋白。
4.一种权利要求1所述的软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.制备软骨细胞外基质冻干海绵
①切取关节软骨片,用含有苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液浸泡后粉碎为匀浆；
②差速离心法取500nm-5μm左右的软骨微丝；
③0～4℃下加入含TritonX-100和苯甲基磺酰氟的Tris-HCl缓冲液震荡12～24h；
④离心，蒸馏水反复冲洗；再离心，加入DNaseI与RNaseA在震荡消化12～24h；
⑤离心，超纯水反复冲洗，冷冻干燥；
b.制备丝素蛋白溶液
①蚕丝脱胶:将蚕丝扯松放于Na2CO3溶液中煮沸30～60min；冲洗，用Na2CO3溶液继续煮沸30～60min，冲洗，晾干；
②取脱胶后的蚕丝溶于LiBr溶液，50～80℃下搅拌2～8h，制得丝素蛋白混合溶液；
③将丝素蛋白混合溶液装入透析袋中进行透析；
④将透析后的丝素蛋白溶液8000～12000rpm/min离心，上清液装入透析袋中再次透析，加入聚乙二醇溶液进行浓缩；
⑤将浓缩后的丝素蛋白溶液8000～12000rpm/min离心，取上清溶液保存备用；
c.支架构建和交联
将软骨细胞外基质冻干海绵溶于纯水后与丝素蛋白溶液混匀为浆料，注入模具，采用定向结晶技术在-15～-80℃下结晶12～24h，真空冷冻干燥12～24h；取出后，进行紫外线照射物理交联和化学试剂交联，烘干，灭菌。
5.根据权利要求4所述的一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架的制备方法，其特征在于：所述步骤a①中Tris-HCl的浓度为0.01～0.1M，pH7.4～7.5；步骤a①、③中苯甲基磺酰氟的浓度为0.035～0.35mM。
6.根据权利要求4所述的一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架的制备方法，其特征在于：所述步骤a④中DNaseI和RNaseA的浓度分别为10～50U/ml、1～5U/ml。
7.根据权利要求4所述的一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架的制备方法，其特征在于：所述步骤b①中Na2CO3的浓度为1.06～5.30g/L；步骤b②中LiBr的浓度为1.25～2.5g/mL。
8.根据权利要求4所述的一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架的制备方法，其特征在于：所述步骤b③中透析袋的截留分子量为12000～14000；步骤b④中透析袋的截留分子量为3500。
9.根据权利要求4所述的一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架的制备方法，其特征在于：所述步骤c浆料中软骨细胞外基质和丝素蛋白浓度为0.5％～5％。
10.根据权利要求4所述的一种软骨细胞外基质与丝素蛋白复合取向软骨支架的制备方法，其特征在于：步骤c中紫外线照射物理交联的紫外线波长为250～260nm，距离光源5～10cm，交联时间为12～48h；化学交联试剂是浓度为0.001～1M的碳化二亚胺与浓度为0.001～1M的N-羟基琥珀酰亚胺的混合乙醇溶液、浓度为0.01％～10％的戊二醛乙醇溶液或浓度为0.01％～10％的京尼平乙醇溶液；交联时间1h～48h。
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