CN105903079A - 半月板基质来源的三维多孔海绵状支架、制备方法及应用 - Google Patents

半月板基质来源的三维多孔海绵状支架、制备方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了半月板基质来源的三维多孔海绵状支架、制备方法及应用，以半月板为原料，通过机械粉碎处理、乙酸酶解消化以及差速离心法去除细胞获得半月板细胞外基质浆料，通过冷冻干燥构建三维多孔支架，并通过紫外以及化学法交联强化支架，所制备的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架具有可控的微细结构、适宜的降解速率和良好的生物相容性以及一定的生物力学强度，有利于细胞粘附和种子细胞均匀分布进入支架内部，并增殖迁移生长，植入体内无免疫排斥反应，可广泛地应用于半月板及软骨组织工程领域，具有良好的临床应用前景。

Description

半月板基质来源的三维多孔海绵状支架、制备方法及应用
技术领域
本发明属于医学组织工程技术领域，涉及组织工程用支架，特别涉及一种促进半月板纤维软骨、关节软骨再生的组织工程用支架的制备方法以及由该方法制备得到的支架产品。
背景技术
半月板是一种纤维软骨组织，位于膝关节股骨与胫骨之间，内外各一，具有吸收震荡、传递负荷、分布滑液、稳定膝关节、协调膝关节运动以及保护膝关节软骨等作用。半月板一旦损伤尤其是内侧区域的损伤，由于其自身修复能力非常有限，治疗方式相对单调，不得不进行半月板全切除或部分切除。但是半月板切除术后使得膝关节半月板完全或部分丢失了正常半月板的生物力学功能，远期将会引起关节软骨退变而导致严重的骨性关节炎。同种异体半月板移植可以替代缺失的半月板，是一种良好的治疗手段，但是供体来源非常有限，另外匹配困难、免疫排斥、疾病传播以及伦理等问题也制约其大规模的临床应用。随着组织工程技术的进一步发展，通过组织工程技术构建再生半月板为修复半月板损伤提供了一种具有良好应用前景的方法。组织工程半月板的关键要素包括支架材料、种子细胞、细胞因子以及培养环境，其中构建理想的组织工程半月板支架是半月板再生修复的关键。
目前用于半月板组织工程的支架材料包括天然材料和人工合成材料两种，人工合成材料主要以聚乳酸(PLA)、聚羟乙酸(PGA)、聚乳酸‐羟基乙酸共聚物(PLGA)、聚己内酯(PCL)等高分子聚合物为主。人工合成材料的缺点是：疏水性，不利于细胞的粘附，降解时产物呈酸性，在体内容易引起炎症反应等。天然支架材料主要有：I型胶原、脱钙骨基质、蚕丝蛋白、细菌纤维素以及小肠粘膜下层(SIS)等。
随着组织工程技术和材料学的进一步发展，研究人员致力于通过组织工程技术来实现半月板的再生，而在组织工程支架选择方面，由于天然材料在生物相容性、降解产物无害性等方面独特的优势，原来越多的研究人员将目光聚焦于天然细胞外基质材料。专利200680031664.8、US20090186062提供了一种用于修复半月板撕裂的胶原膜，该胶原膜主要成分为I、III型胶原，其中一面较为平滑，抑制细胞粘附；一面为纤维面，较为毛躁，允许细胞在其上生长，使用时将纤维面贴合在半月板撕裂处固定，通过引导滑膜细胞、间充质细胞、细胞因子等进入损伤位置进行修复。但该发明的胶原膜仅含有I、III型胶原，不含糖胺多糖等半月板本身含有的成分；同时胶原膜贴附在半月板上下表面，容易受到关节摩擦发生脱落，形成异物。专利US007819918B2提供了一种用于修复半月板组织修复的可植入性生物材料及其制备方法，该材料主要包含小肠粘膜下层(SIS)以及生物相容性聚合物、细胞、透明质酸、硫酸软骨素等成分，植入体内随着材料逐渐降解，被新生组织取代。但材料的胶原纤维及成分与天然半月板相差较大，且材料降解会影响损伤修复部位的微环境，不利于组织的重建与再生。专利201210224724.5提供了一种用于修复半月板撕裂的生物材料及其制备方法，该生物材料由脱细胞基质膜、具有细胞因子及纤维软骨细胞复合的双层多孔胶原结构以及表层纤维软骨细胞膜片构成，同样其生物材料构建的半月板再生微环境难以完全满足半月板再生的特殊要求。
发明内容
针对上述技术问题，本发明的目的是提供一种应用于组织工程的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架，能够复合细胞从而构建组织工程半月板以及组织工程软骨，可用于临床上修复半月板损伤以及软骨缺损。
本发明的另一目的在于提供上述半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述半月板基质来源的三维多孔海绵状支架在构建组织工程半月板以及组织工程软骨中的应用。
以下对本发明进行详细描述。
本发明的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的制备方法可包括如下步骤：
1)无菌条件下剥离半月板原料周围的脂肪及滑膜组织，余下的组织用蒸馏水清洗，低渗冻融，再用蒸馏水冲洗；
2)将步骤1)处理后的组织进行乙酸酶解消化后，粉碎制成匀浆，差速离心并收集无细胞的半月板细胞外基质(meniscus extracellular matrix)；
3)将步骤2)收集的半月板细胞外基质配成浆料注入模具，应用冷冻干燥技术获得冻干支架，再釆用紫外线和碳化二亚胺方法进行交联得到三维多孔海绵状支架。
上述步骤1)中，余下的组织(即剥离脂肪和滑膜组织后的半月板组织)用蒸馏水清洗后，剪碎并置于三蒸水中，‐10～‐40℃冻融3～5次，每次4～6小时，最后一次融化后进行双氧水处理，然后再用蒸馏水冲洗，其中，双氧水与组织的体积比为1：1～3，处理时间一般为0.5～1小时。
上述步骤2)中，乙酸酶解消化包括：将组织加入蒸馏水和乙酸，以乙酸与蒸馏水混合后的pH值为1～3为宜，然后按照胃蛋白酶溶液与上述组织混合溶液(即组织+蒸馏水+乙酸)体积比2:1的比例向上述组织混合溶液中加入1～5％(重量百分比)胃蛋白酶溶液，4～8℃放置6～10小时(一般置于4℃冰箱中过夜即可)，然后放入粉碎机中粉碎10～20分钟制成匀浆。利用湿法粉碎时，为防止粉碎机温度过高破坏半月板组织中的蛋白，每次粉碎的时间不要超过1分钟，并且每次粉碎后置于4℃冰箱中降温。
上述步骤2)中，差速离心包括：将匀浆先1000～2000rpm离心5～10分钟，可见匀浆分为两层，去掉底层沉淀，收集上层匀浆，然后5000～6000rpm离心5～10分钟，可见匀浆再次分为两层，去掉底层沉淀，收集上层匀浆，此时上层匀浆为水和半月板细胞外基质的混悬液，无细胞结构，然后10000～15000rpm离心30～40分钟，弃去上清，收集沉淀。
在步骤3)中，将步骤2)收集的半月板细胞外基质用三蒸水清洗后配成重量百分比为2～3％的浆料，充分搅拌均匀后，离心去气泡(1000～2000rpm，2～3分钟)，然后将去除气泡的浆料注入任意形状的塑料模具中，‐20～‐40℃预冻2～5小时，预冻支架从模具中取出，迅速转移到冷冻干燥机中冷冻干燥24～48h，冷冻干燥时的制冷温度为‐35～‐75℃，真空度为<10Pa，然后将冻干支架置波长258nm紫外线下交联2～8h，再在碳化二亚胺(EDC)与N‐羟基琥珀酰亚胺(NHS)的95％乙醇溶液中(浓度为：EDC 50mM；NHS 20mM)4～8℃下交联24h。
步骤3)中还包括化学交联后用三蒸水漂洗，再次冷冻干燥，冷冻干燥时的制冷温度为‐35～‐75℃，真空度<10Pa，最后Co60辐照消毒后密封，于4～8℃下保存。
本发明中制备半月板基质来源的三维多孔海绵状支架用的半月板组织来源可以是人或其它哺乳动物。
本发明制备的半月板细胞外基质来源于半月板本身，其成分主要是纳米级胶原微丝和糖胺多糖颗粒。
本发明以半月板为原料，通过机械粉碎处理、乙酸酶解消化以及差速离心法去除细胞获得半月板细胞外基质浆料，通过冷冻干燥构建三维多孔支架，并通过紫外以及化学法交联强化支架，所制备的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架具有可控的微细结构、适宜的降解速率和良好的生物相容性以及一定的生物力学强度，有利于细胞粘附和种子细胞均匀分布进入支架内部，并增殖迁移生长，植入体内无免疫排斥反应，可广泛地应用于半月板及软骨组织工程领域，具有良好的临床应用前景。具体而言，本发明制备的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架具备以下优点：
(1)以人或其它哺乳动物的半月板组织为原料，材料来源广泛，无伦理学限制，成本低；具有良好的生物相容性；并且制备流程简单易行，可重复性好，经物理、化学交联后，制备出的支架产品具有一定的生物力学强度；
(2)半月板的组织结构和生化成分与软骨细胞外基质极为相似，半月板组织主要由胶原以及糖胺多糖成分组成，其中胶原主要为I型胶原，含有少量II型胶原；软骨组织主要成分是胶原和糖胺多糖，其中胶原主要为II型胶原；半月板组织经脱细胞处理后仍然保留原有的组织成分，富含胶原和透明质酸，其中胶原占干重50％，透明质酸占50％，类似于天然关节软骨的组成成分，不仅可以为半月板纤维软骨细胞的再生提供“原生态”的细胞微环境，也可以为软骨细胞生长提供最接近的细胞外微环境，是制备半月板、软骨组织工程用支架的理想材料；
(3)现有的半月板脱细胞材料多是由整块半月板整体直接脱细胞获得，一方面获得的材料胶原结构排列紧密，细胞进入困难，不利于在体外构建细胞支架复合体，不利于体外组织工程半月板的构建，而该方法制备的三维孔隙海绵状支架可根据需要设计制备成所需均匀一致的多孔率和特定大小的孔径(如100‐200微米)，孔相互连通，有利于种子细胞分布均匀地进入支架内部，利于种子细胞粘附、增殖、迁移及代谢；另一方面，直接由整块半月板脱细胞获得的材料其外形受限于原有材料的大小及形状，而该方法制备的三维孔隙海绵状支架可根据模具形状变换外形，如结合3D打印技术制备支架模具，可获得任意外形(个性化)的三维孔隙海绵状支架。
附图说明
图1是实施例1中6000rpm离心10分钟后去上层匀浆涂片，甲苯胺蓝染色后放大100倍的显微镜下观察到的图像。
图2是实施例1制备的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的大体观。
图3是实施例1制备的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架扫描电子显微镜观察到的结构图像。
图4是实施例1制备的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架甲苯胺蓝染色后放大100倍的显微镜下观察到的图像，白色箭头为染色阳性区域。
图5是实施例1制备的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架番红O染色后放大100倍的显微镜下观察到的图像，白色箭头为染色阳性区域。
图6是实施例1制备的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架天狼猩红染色后放大100倍的显微镜下观察到的图像，白色箭头为呈黄色或红色I型胶原区域。
图7是实施例1制备的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架I型胶原免疫组织化学染色后放大100倍的显微镜下观察到的图像，白色箭头所示为染色阳性区域。
图8是实施例1制备的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架II型胶原免疫组织化学染色后放大100倍的显微镜下观察到的图像，白色箭头所示为染色阳性区域。
图9是实施例1制备的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架种植纤维软骨细胞后培养72小时，扫描电子显微镜观察到的图像。
具体实施方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证目的，绝不限制本发明的范围。
实施例1
一、半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的制备：
1、取猪的半月板，无菌条件下，剥离脂肪及滑膜组织，余下组织剪碎(5mm×5mm×5mm)，蒸馏水冲洗3次，然后浸泡在三蒸水中置‐20℃，低渗冻融5次，每次5小时，融化后将三蒸水去掉，再用双氧水浸泡搅动半小时，随后蒸馏水冲洗3次，其中双氧水与组织的体积比为1：1，处理时间0.5小时，目的是去除红细胞等抗原，使组织变白、膨松，有利于组织中细胞破碎脱出。
2、加乙酸和蒸馏水于组织中，利用溶液的PH值(PH值调至1‐3)调控乙酸和蒸馏水的配比，然后加入体积比为2:1的加入1％(重量百分比)胃蛋白酶溶液，然后倒入粉碎机中，低温层析柜中粉碎20分钟，制成匀浆，其中每次粉碎的时间勿超过一分钟，并且每次粉碎后置于4℃冰箱中降温，防止粉碎机温度过高破坏半月板组织中的蛋白。
3、顺序进行下述步骤a～c的差速离心：
a.将步骤2制成的匀浆放入50ml离心管中，2000rpm离心5分钟，取上层匀浆涂片、甲苯胺兰染色，显微镜下观察为毫米、微米级毛球、细胞、纳米微丝等混悬匀浆；
b.收集步骤a后的上层匀浆6000rpm离心10分钟，取上层匀浆涂片、奥辛兰染色，显微镜下观察见微米级颗粒、纳米级，无细胞，如图1所示，有大量酸性粘多糖(甲苯胺蓝染色呈紫色)及丝状物；
c.收集步骤b后的上层匀浆10000rpm离心30分钟，弃上清，收集沉淀，冰冻切片进行甲苯胺蓝染色鏡下观察：呈蓝紫色、无细胞，沉淀物用三蒸水混匀洗三次(pH7)后置4℃保存备用。
4、将步骤3收集的收集的沉淀物配成2～3％重量百分比浓度的浆料，充分搅拌均匀后，1000rpm离心2～3分钟去气泡，然后将去除气泡的浆料注入圆柱形型塑料模具中，‐20℃预冻5小时，预冻支架从模具中取出，迅速转移到冷冻干燥机中升华干燥36h，冷冻干燥时的制冷温度为‐50℃，真空度<10Pa。将冻干后支架置于波长258nm紫外线下交联4～8h。再在碳化二亚胺(EDC)与N‐羟基琥珀酰亚胺(NHS)的95％乙醇溶液中(浓度为：EDC和NHS各20mM)4℃下交联24h，三蒸水漂洗6次(pH7)，冷冻干燥，密封、Co60消毒后，4℃下保存。其中，EDC、NHS用95％乙醇配成交联溶液，利于支架增加强度，减小降解速度过快的不足，交联后用三蒸水漂洗6次利于去除支架中残留的交联液。
二、性能检测
(一)理化性能检测：
本发明制备的去细胞半月板细胞外基质三维多孔支架外观如图2所示，用扫描电镜观察，可见所制备的支架孔径大小及分布较均匀，并且空隙相互贯通，孔径多为100‐200微米，支架多孔率为94％(见图3)。
(二)组织化学染色观察：
所制备的支架甲苯胺蓝染色呈阳性(如图4，白色箭头所示相似区域为阳性区域)、番红O呈染色阳性(见图5，箭头所示类似区域为阳性区域)，天狼猩红染色可见大量呈红色或黄色的强折光性胶原纤维(见图6，白色箭头指示相似区域为阳性区域)，Ⅰ型胶原免疫组织化学染色呈阳性(见图7，箭头所示相似区域为阳性区域)，支架网状结构呈棕黄色；Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈弱阳性(见图8，白色箭头指示区域为阳性区域)，支架网状结构棕黄色显色较弱。
(三)支架的生物相容性：
通过倒置显微镜观察看到，纤维软骨细胞接种于支架后，培养3小时后细胞大部分贴壁，黏附于多孔支架空隙中。经扫描电镜观察，培养后72h细胞在支架空隙中分布均匀，生长良好，并可见基质分泌(图9)。
实施例2
1、取牛的半月板，无菌条件下，剥离脂肪及滑膜组织，余下组织剪碎(5mm×5mm×5mm)，蒸馏水冲洗3次，然后浸泡在三蒸水中置‐10℃，低渗冻融4次，每次6小时，融化后将三蒸水去掉，再用双氧水浸泡搅动1小时，随后蒸馏水冲洗3次，其中双氧水与组织的体积比为1：2，处理时间1小时。
2、加乙酸和蒸馏水于组织中，利用溶液的PH值(PH值调至1‐3)调控乙酸和蒸馏水的配比，然后加入体积比为2:1的加入3％(重量百分比)胃蛋白酶溶液，然后倒入粉碎机中，低温层析柜中粉碎10分钟，制成匀浆，其中每次粉碎的时间勿超过一分钟，并且每次粉碎后置于4℃冰箱中降温，防止粉碎机温度过高破坏半月板组织中的蛋白。
3、顺序进行下述步骤a～c的差速离心：
a.将步骤2制成的匀浆放入50ml离心管中，1000rpm离心10分钟，取上层匀浆涂片、甲苯胺兰染色，显微镜下观察为毫米、微米级毛球、细胞、纳米微丝等混悬匀浆；
b.收集步骤a后的上层匀浆5000rpm离心8分钟，取上层匀浆涂片、奥辛兰染色，显微镜下观察见微米级颗粒、纳米级，无细胞，有大量酸性粘多糖(甲苯胺蓝染色呈紫色)及丝状物；
c.收集步骤b后的上层匀浆15000rpm离心35分钟，弃上清，收集沉淀，冰冻切片进行甲苯胺蓝染色鏡下观察：呈蓝紫色、无细胞，沉淀物用三蒸水混匀洗三次(pH7)后置4℃保存备用。
4、将步骤3收集的收集的沉淀物配成2～3％重量百分比浓度的浆料，充分搅拌均匀后，1000rpm离心2～3分钟去气泡，然后将去除气泡的浆料注入圆柱形型塑料模具中，-30℃预冻4小时，预冻支架从模具中取出，迅速转移到冷冻干燥机中升华干燥48h，冷冻干燥时的制冷温度为-35℃，真空度<10Pa。将冻干后支架置于波长258nm紫外线下交联4～8h。再在碳化二亚胺(EDC)与N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的95％乙醇溶液中(浓度为：EDC和NHS各20mM)4℃下交联24h，三蒸水漂洗6次(pH7)，冷冻干燥，密封、Co60消毒后，4℃下保存。
实施例3
1、取羊的半月板，无菌条件下，剥离脂肪及滑膜组织，余下组织剪碎(5mm×5mm×5mm)，蒸馏水冲洗3次，然后浸泡在三蒸水中置‐40℃，低渗冻融3次，每次4小时，融化后将三蒸水去掉，再用双氧水浸泡搅动半小时，随后蒸馏水冲洗3次，其中双氧水与组织的体积比为1：3，处理时间45分钟。
2、加乙酸和蒸馏水于组织中，利用溶液的PH值(PH值调至1‐3)调控乙酸和蒸馏水的配比，然后加入体积比为2:1的加入5％(重量百分比)胃蛋白酶溶液，然后倒入粉碎机中，低温层析柜中粉碎15分钟，制成匀浆，其中每次粉碎的时间勿超过一分钟，并且每次粉碎后置于4℃冰箱中降温，防止粉碎机温度过高破坏半月板组织中的蛋白。
3、顺序进行下述步骤a～c的差速离心：
a.将步骤2制成的匀浆放入50ml离心管中，1500rpm离心8分钟，取上层匀浆涂片、甲苯胺兰染色，显微镜下观察为毫米、微米级毛球、细胞、纳米微丝等混悬匀浆；
b.收集步骤a后的上层匀浆5500rpm离心9分钟，取上层匀浆涂片、奥辛兰染色，显微镜下观察见微米级颗粒、纳米级，无细胞，有大量酸性粘多糖(甲苯胺蓝染色呈紫色)及丝状物；
c.收集步骤b后的上层匀浆12000rpm离心40分钟，弃上清，收集沉淀，冰冻切片进行甲苯胺蓝染色鏡下观察：呈蓝紫色、无细胞，沉淀物用三蒸水混匀洗三次(pH7)后置4℃保存备用。
4、将步骤3收集的收集的沉淀物配成2～3％重量百分比浓度的浆料，充分搅拌均匀后，1000rpm离心2～3分钟去气泡，然后将去除气泡的浆料注入圆柱形型塑料模具中，‐40℃预冻2小时，预冻支架从模具中取出，迅速转移到冷冻干燥机中升华干燥24h，冷冻干燥时的制冷温度为‐75℃，真空度<10Pa。将冻干后支架置于波长258nm紫外线下交联4～8h。再在碳化二亚胺(EDC)与N‐羟基琥珀酰亚胺(NHS)的95％乙醇溶液中(浓度为：EDC和NHS各20mM)4℃下交联24h，三蒸水漂洗6次(pH7)，冷冻干燥，密封、Co60消毒后，4℃下保存。

Claims (10)

1.半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的制备方法，包括如下步骤：
1)无菌条件下剥离半月板原料周围的脂肪及滑膜组织，余下的组织用蒸馏水清洗，低渗冻融，再用蒸馏水冲洗；
2)将步骤1)处理后的组织进行乙酸酶解消化后，粉碎制成匀浆，差速离心并收集无细胞的半月板细胞外基质；
3)将步骤2)收集的半月板细胞外基质配成浆料注入模具，应用冷冻干燥技术获得冻干支架，再釆用紫外线和碳化二亚胺方法进行交联得到三维多孔海绵状支架。
2.如权利要求1所述的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，步骤1)中余下的组织用蒸馏水清洗后，剪碎并置于三蒸水中，-10～-40℃冻融3～5次，每次4～6小时，最后一次融化后进行双氧水处理，然后再用蒸馏水冲洗，双氧水与组织的体积比为1：1～3，处理时间为0.5～1小时。
3.如权利要求1所述的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，步骤2)中乙酸酶解消化包括：将组织加入蒸馏水和乙酸，乙酸与蒸馏水混合后的pH值为1～3，然后按照体积比2:1加入重量百分比1～5％的胃蛋白酶溶液，4～8℃放置6～10小时。
4.如权利要求1所述的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，步骤2)中差速离心包括：将匀浆先1000～2000rpm离心5～10分钟，去掉底层沉淀，收集上层匀浆，然后5000～6000rpm离心5～10分钟，去掉底层沉淀，收集上层匀浆，然后10000～15000rpm离心30～40分钟，弃去上清，收集沉淀。
5.如权利要求1所述的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，步骤3)中，将步骤2)收集的半月板细胞外基质用三蒸水清洗后配成重量百分比为2～3％的浆料，充分搅拌均匀后，离心去气泡，然后将去除气泡的浆料注入模具中。
6.如权利要求1所述的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述冷冻干燥技术包括：-20～-40℃预冻2～5小时，预冻支架从模具中取出，迅速冷冻干燥24～48h，冷冻干燥时的制冷温度为-35～-75℃，真空度为<10Pa。
7.如权利要求1所述的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，步骤3)中，将冻干支架置波长258nm紫外线下交联2h～8h，再在碳化二亚胺与N-羟基琥珀酰亚胺的95％乙醇溶液中4～8℃下交联24h。
8.如权利要求1所述的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的制备方法，其特征在于，步骤3)中还包括碳化二亚胺方法交联后用三蒸水漂洗，再次冷冻干燥，冷冻干燥时的制冷温度为-35～-75℃，真空度<10Pa，最后Co60辐照消毒后密封。
9.根据权利要求1-8任意一项所述的半月板基质来源的三维多孔海绵状支架的制备方法制备的三维多孔海绵状支架。
10.如权利要求9所述的三维多孔海绵状支架在构建组织工程半月板以及组织工程软骨中的应用。
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