CN115177788A

CN115177788A - 一种具有良好力学强度及细胞活性的pcl复合生物胶原膜及其应用

Info

Publication number: CN115177788A
Application number: CN202211106868.0A
Authority: CN
Inventors: 江东; 杜明泽; 窦赟
Original assignee: Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Current assignee: Peking University Third Hospital Peking University Third Clinical Medical College
Priority date: 2022-09-13
Filing date: 2022-09-13
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2042-09-13
Also published as: CN115177788B

Abstract

本发明提供一种良好力学强度及细胞活性的PCL复合生物胶原膜，该膜是先通过特制的培养基进行人体来源成体细胞的体外扩增培养，对于不同类型的组织损伤采用不同的不同来源的成体细胞进行扩增培养，通过3D打印技术及特制的成膜培养基，培养3‑5天后获得能够被人体细胞分泌的具有细胞活性的生物胶原膜及其包裹的PCL支架，具有兼顾力学强度及生物学功能的优点，具有良好的应用前景。

Description

一种具有良好力学强度及细胞活性的PCL复合生物胶原膜及其应用

技术领域

本发明涉及生物材料领域，更为具体的，本发明涉及一种具有良好力学强度及细胞活性的聚己内酯（PCL）复合生物胶原膜及其应用。

背景技术

目前的生物胶原膜应用广泛，又称医用组织引导再生胶原膜，该产品是从牛腱中提取、用酶消化法得到的胶原蛋白为主要原料，经特殊工艺加工，化学交联制成的一种网状结构的生物膜产品。该产品的优点就是生物相容性好，可降解吸收，无需二次手术取出材料。目前医用胶原膜主要是从牛腱等动物肌腱、异种脱细胞真皮基质中提取，采用自动固相萃取仪为主要设备，用酶消化法得到的胶原蛋白为主要原料，再经过特殊工艺加工，化学交联而制成。医用胶原膜早期主要应用于口腔科软组织浅层缺损、牙周病、人工种植牙和牙槽骨密度底等修复，近几年在骨科、整形外科、五官科、神经外科及肌腱断裂和脏器穿孔等领域均有广泛应用。

然而，目前的生物胶原膜仍具有以下不足：市场上的生物胶原膜主要由牛腱、鼠尾、猪皮等动物组织中化工提纯而来，应用到临床上属于异种异体来源，虽然已经经过脱细胞技术处理，但相较于人体来源的产品仍具有一定疾病传播的风险性，常见的疾病主要有猪流感、牛流行热、疯牛病、猪丹毒和蹄疫等，美国FDA提出后续对于含动物源性的医疗产品需要更加严格管控；同时，由于目前的生物胶原膜均来自于动物胶原，导致其主要成分单一，而对于不同的应用场景往往需要特定的细胞外基质成分发挥特定的生物学功能，因此也限制了其推广应用；目前的生物胶原膜由于其制备方法的限制，导致制备出的产品力学强度较差，对于承力的组织或器官远远无法满足力学需求，需进一步通过制备方式提升其力学强度；另外，同样由于其制备方法及应用场景的限制，制备出的产品不具有细胞活性，但活细胞的存在会加速损伤组织的修复，而这就要求产品必须来源于自体组织，否则活细胞的引入会导致机体产生严重的排异反应。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种的PCL复合生物胶原膜，该PCL复合生物胶原膜具有良好力学强度及细胞活性。为了实现上述效果，本发明具体提供如下技术方案：

本发明的第一个方面，提供一种PCL复合生物胶原膜，所述PCL复合生物胶原膜由PCL支架与附着在PCL支架上的生物胶原膜复合而成，所述生物胶原膜是由胶原成膜培养基培养附着在PCL支架上的人源软骨细胞而形成，所述胶原成膜培养基组分包括：

DMEM基础培养基；

Glutmax，添加浓度为0.01ml/ml；

非必需氨基酸（NEAA），添加浓度为0.01ml/ml；

双抗（PS），添加浓度为0.01ml/ml；

地塞米松（Dexamethasone），添加浓度为100nM；

ITS (Insulin-Transferrin-Selenium，胰岛素-转铁蛋白-硒)，添加浓度为0.01ml/ml,；

脯氨酸（Proline），添加浓度为40μg/ml。

本发明的第二个方面，提供一种制备PCL复合生物胶原膜的方法，所述方法包括如下步骤：

1）人体来源软骨细胞培养；

2）将人体来源软骨细胞高浓度的滴加到PCL支架上：

3）待人体来源软骨细胞吸附在PCL支架上后，添加培养基没过PCL支架，继续培养；

4）待人体来源软骨细胞在PCL支架上均匀的黏附之后，更换胶原成膜培养基继续培养直至获得PCL复合生物胶原膜；

其中，所述胶原成膜培养基组分包括：

DMEM基础培养基；

Glutmax，添加浓度为0.01ml/ml；

NEAA，添加浓度为0.01ml/ml；

PS，添加浓度为0.01ml/ml；

Dexamethasone，添加浓度为100nM；

ITS，添加浓度为0.01ml/ml,；

Proline，添加浓度为40μg/ml。

在一种实施方式中，所述人源软骨细胞可来自人半月板组织或软骨组织。

本发明的第三个方面，提供一种PCL复合生物胶原膜在制备治疗半月板损伤的产品中的应用。

本发明的第四个方面，提供一种PCL复合生物胶原膜在制备用于促进半月板血管化的产品中的应用。

本发明的第五个方面，提供一种PCL复合生物胶原膜在制备用于促进半月板再生的产品中的应用。

本发明相对于现有技术获得了如下显著的技术效果：

1.本产品来源于人源的成体细胞，可通过一期取出、二期植入的方式应用于自体移植，人体来源的生物胶原膜规避了动物来源的疾病传播风险，更加具有临床转化的潜力。

2.我们通过前期制备的特殊培养基对不同的组织进行培养，可以制备出含有特定成分的生物胶原膜，因此对于不同的器官组织损伤，我们可以通过培养不同组织来源的成体细胞进行生物胶原膜的制备，同时我们研究发现，本产品中具有促血管再生及促细胞迁移的特定成分，而目前市售的生物胶原膜成分单一、来源单一、相关组织修复功能欠缺。

3.本产品可制备成包裹PCL支架的生物胶原膜形式，对于不同的组织器官，例如半月板、软骨以及韧带等，我们可以设计不同的PCL支架模型，以满足不同的器官组织对不同力学性质的需求，而目前市售的生物胶原膜力学强度很差，限制了其推广应用。

4、本产品通过体外细胞自分泌的方式分泌生物胶原膜，因此这种特殊的制备方式可以很好的保留细胞活性，而目前的生物胶原膜由于其制备方式导致细胞活性不可保留，但活细胞对于组织的损伤修复具有非常重要的促进作用。对于接受一期取材、二期植入的患者，我们在体外进行自体来源的细胞扩增及成膜后进行移植。这种保留细胞活性，同时具有力学强度及良好生物相容性及生物学功能的损伤修复材料，仍是目前临床上很难达到的方式，因此具有成为理想的临床治疗手段的潜力。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1 人体来源成体细胞原代培养。左侧：软骨细胞；右侧：半月板细胞。

图2 人体来源成体细胞与支架共培养后死/活染色分析。左侧：活细胞；右侧：死细胞。

图3a 大体观察1；图3b大体观察2；图3c显微镜下观察。

图4 PCL复合胶原膜扫描电镜检测。

图5 PCL复合胶原膜支架细胞相容性死/活检测。

图6a 生物胶原膜组体外血管内皮细胞迁移实验结果；图6b TGF-β组体外血管内皮细胞迁移实验结果; 图6c 空白对照组体外血管内皮细胞迁移实验结果; 图6d 统计学分析结果。

图7a生物胶原膜组体外成管结果、图7b Col Ⅳ组体外成管结果、图7c阳性对照组体外成管结果、图7d空白对照组体外成管结果；图7e统计学分析。

图8 PCL复合胶原膜细胞支架植入以及新生半月板血管长入情况。

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

具体实施方式

实施例1 PCL复合生物胶原膜的制备

一、人体来源成体软骨细胞培养：

首先收集手术中切除的软骨废弃组织，如半月板组织或者软骨组织均可，将组织使用PBS冲洗三遍后剪成1*1*1mm的颗粒，0.25%的胰蛋白酶37℃处理，半小时后弃去胰酶，更换成胶原酶（半月板组织：0.2%的一型胶原酶：0.2%的二型胶原酶=1：1，软骨组织：0.2%的二型胶原酶）37℃过夜，待组织颗粒全部被消化后加入胎牛血清终止消化，轻柔吹打后利用含10%胎牛血清的DMEM重悬细胞，并保证细胞浓度为6*10^5/ml，每三天更换一侧培养基（图1中为细胞原代培养图）。

二、细胞与PCL支架共培养：

将上述原代软骨细胞稳定传代至P2或P3后消化重悬，并将高浓度的细胞悬液（3*10^5/ml）滴加到打印好的PCL支架上（PCL支架制备方法同申请人在先专利CN216091592U），待细胞吸附半小时后添加培养基没过PCL支架，随后每三天更换培养基，通过荧光染色观察细胞活性（图2），可以看出细胞活性被良好的保留。

三、PCL复合生物胶原膜制备：

细胞在支架上均匀的黏附之后，更换特制的成膜培养基继续培养，特制的成膜培养基组分为：

DMEM基础培养基（低糖，Sigma Adrich, USA）；

Glutmax（Sigma Adrich, USA），添加浓度为0.01ml/ml；

NEAA（Sigma Adrich, USA），添加浓度为0.01ml/ml；

PS( Sigma Adrich, USA)，添加浓度为0.01ml/ml；

Dexamethasone( Sigma Adrich, USA) ，添加浓度为100nM；

ITS(Sigma Adrich, USA)，添加浓度为0.01ml/ml,；

Proline ( Sigma Adrich, USA)），添加浓度为40μg/ml；

3-7天后观察支架与胶原膜的复合情况。

大体观察及显微镜结果如图3a、图3b、图3c所示，扫描电镜结果结果由图4可见，PCL丝表面被胶原膜均匀覆盖，且生物胶原膜与PCL支架紧密覆盖。

实施例2 PCL复合生物胶原膜细胞相容性与生物学功能验证

一、PCL复合生物胶原膜与细胞相容性检测：

PCL复合胶原膜制备完成后，首先将其与细胞体外共培养检测其细胞相容性，具体操作步骤为：

将预先消化、离心的骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs）以3*10^5的浓度滴加到PCL胶原膜复合支架上，每次滴加50微升，共滴加三次，每次间隔半小时，置于37℃细胞孵育箱（5% CO2）培养。将支架与BMSCs共培养72小时后取出，PBS洗涤3次，使用细胞活力（活死细胞染色）检测试剂盒（Calcein AM/PI法，凯基生物，江苏）进行荧光标记。按照试剂盒说明书的提示，首先将Calcein AM及PI室温平衡30分钟备用。在避光条件下，首先将5微升的Calcein AM加入10ml的PBS中，振荡混匀。加入5微升的PI，混匀，备用。将负载细胞的PCL支架配置好的工作也中孵育2小时。随后用PBS清洗支架，LeicaTCS-SP8共焦显微镜（Leica, Germany）观察。所有荧光图像均通过Image Pro Plus软件（v.6.0，Media Cybernetics）进行分析。根据活（波长488 nm）/死（波长594 nm）染色进行计数，活细胞数除以细胞总数，计算细胞活力的定量数据。

结果如图5所示，共培养后PCL复合胶原膜的细胞相容性良好。

二、体外血管内皮细胞迁移、体外成管实验结果：

1、利用transwell细胞共培养系统验证生物胶原膜对MFCs的迁移作用，对生物胶原膜组（图6a）、TGF-β组（图6b）及空白对照组（图6c）的结果统计学分析显示：生物胶原膜组与空白对照组相比具有显著性差异，表明生物胶原膜可促进MFCs迁移；生物胶原膜组与ColⅠ组对比有显著性差异，结合生物胶原膜质谱分析结果，是由于生物胶原膜中存在除Col Ⅰ外的可协同促进MECs迁移的其它相关蛋白（图6d）。

因此，ECs促进MFCs的迁移也是生物胶原膜促进MFCs迁移的路径之一。

2、体外成管实验（验证生物胶原膜对ECs体外血管形成的促进作用）：

将ECs悬液接种在预先铺满基质凝胶的96孔培养板中。8h后测量各组成管率。通过测量移行和导管形成在体外进行评估。

对生物胶原膜组（图7a）、Col Ⅳ组（图7b）、阳性对照组（图7c）、空白对照组（图7d）的小管成型率进行统计学分析，结果显示：生物胶原膜组与空白对照组有显著性差异，表明生物胶原膜可促进ECs体外血管形成；生物胶原膜组与Col Ⅳ组有显著性差异，结合生物胶原膜质谱分析结果，提示生物胶原膜中具有除Col Ⅳ外其它可协同促进ECs体外血管形成的相关蛋白成分（图7e）。

三、PCL复合生物胶原膜支架兔子体内植入生物学功能验证：

首先兔子耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠1.5ml/Kg，进行麻醉前的诱导，肌注1:1 陆眠宁/氯胺酮0.2 ml/Kg深度麻醉；麻醉后由助手进行术区的备皮、消毒铺单，除膝关节外其余部位均由手术单覆盖；用手术刀在髌韧带内侧切开，钝性分离皮下组织，打开关节囊，外脱位髌骨暴露出关节囊内结构。找到内侧半月板，首先切断内侧半月板前角止点，夹住半月板前角并沿着半月板滑膜缘向内探查，在半月板后角处将半月板离断，完成内侧半月板全切术。注意在切除半月板的过程不要损伤股骨髁或者胫骨平台的表面软骨，以防止手术造成的骨关节炎发生。注意不要切断内侧副韧带，否则术后兔子的运动能力以及关节的稳定性将会受到限制。将预先制备好的PCL复合胶原膜支架按照切下的半月板进行简单修建后进行植入，使用No. 4-0 缝线进行固定，前角固定在半月板前角止点处，后角固定在后交叉韧带处，前体部固定在内侧副韧带前方关节囊上，后体部固定在内侧副韧带后内方肌肉止点处，缝合好后轻微拉动植入的半月板支架确认是否牢固。复位髌骨，逐层关闭关节囊及皮肤。术后不进行制动，使兔子可以自由活动。术前30分组和术后一周内每天进行青霉素 40U/只肌注，防止术后关节发生感染，笼内饲养，一段时间后取材观察血管再生及半月板再生情况。

结果如图8所示，PCL复合胶原膜支架植入16周后半月板再生情况良好，同时滑膜缘有明显血管长入趋势。

以上结果说明，本发明所制备的生物胶原膜可提供良好的生物安全性、生物相容性及特定的生物学功能（如促进血管再生等），保留活性的细胞可促进组织损伤的修复，而内层的PCL支架可以为胶原膜材料提供良好的力学支撑，同时3D打印的PCL支架可根据不同的损伤模型进行个性化的形状及微结构的定制，体外扩增培养制备出具有细胞活性的PCL复合生物胶原膜后植入体内，具有兼顾力学强度及生物学功能的优点。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims

1.一种聚己内酯复合生物胶原膜，其特征在于，所述聚己内酯复合生物胶原膜由聚己内酯支架与附着在聚己内酯支架上的生物胶原膜复合而成，所述生物胶原膜是由胶原成膜培养基培养附着在聚己内酯支架上的人源软骨细胞而形成，所述胶原成膜培养基组分包括：

DMEM基础培养基；

Glutmax，添加浓度为0.01ml/ml；

非必需氨基酸，添加浓度为0.01ml/ml；

双抗，添加浓度为0.01ml/ml；

地塞米松，添加浓度为100nM；

胰岛素-转铁蛋白-硒，添加浓度为0.01ml/ml,；

脯氨酸，添加浓度为40μg/ml。

2.一种制备聚己内酯复合生物胶原膜的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1）人体来源软骨细胞培养；

2）将人体来源软骨细胞高浓度的滴加到聚己内酯支架上：

3）待人体来源软骨细胞吸附在聚己内酯支架上后，添加培养基没过聚己内酯支架，继续培养；

4）待人体来源软骨细胞在聚己内酯支架上均匀的黏附之后，更换胶原成膜培养基继续培养直至获得聚己内酯复合生物胶原膜；

其中，所述胶原成膜培养基组分包括：

DMEM基础培养基；

Glutmax，添加浓度为0.01ml/ml；

非必需氨基酸，添加浓度为0.01ml/ml；

双抗，添加浓度为0.01ml/ml；

地塞米松，添加浓度为100nM；

胰岛素-转铁蛋白-硒，添加浓度为0.01ml/ml,；

脯氨酸，添加浓度为40μg/ml。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述人源软骨细胞可来自人半月板组织或软骨组织。

4.一种如权利要求1所述的聚己内酯复合生物胶原膜或如权利要求2或3所述的方法在制备治疗半月板损伤的产品中的应用。

5.一种如权利要求1所述的聚己内酯复合生物胶原膜或如权利要求2或3所述的方法在制备用于促进半月板血管化的产品中的应用。

6.一种如权利要求1所述的聚己内酯复合生物胶原膜或如权利要求2或3所述的方法在制备用于促进半月板再生的产品中的应用。