CN106957817A - 一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法 - Google Patents

一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法，具体步骤为：骨髓悬液备用，取患者外周血,密封备用；自体血清，分装待用；将骨髓悬液梯度离心；得到细胞悬液；将细胞悬液培养箱中培养；再用0.5ml生理盐水重悬细胞；取一块牛源Ⅰ型胶原蛋白膜，将细胞悬液滴注于牛源Ⅰ型胶原蛋白膜中；将牛源Ⅰ型胶原蛋白膜浸泡于生理盐水中，然后置于37℃，5%的CO2培养箱中孵育6h，即可。本发明具有治疗效果好等优点。

Description

一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法
技术领域
本发明涉及组织工程技术修复无血运区半月板损伤领域，具体来说是一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法。
背景技术
膝关节半月板是膝关节结构和功能的重要部分，它除吸收震荡、增加关节接触面、润滑关节外，还有着承受载荷及分散负荷、维持关节稳定等功能，半月板的切除将导致关节不稳和载荷传递紊乱，以致关节骨性关节炎的发生，半月板位于股骨和胫骨之间，内外各一，为纤维软骨组织，呈周缘厚，内缘薄的契型，从平面上看为半月形，半月板靠近滑膜的外1/3有血供，此区域的半月板撕裂有良好的潜在修复能力，而半月板游离缘近2/3区域缺乏血供难以愈合，国内外许多学者的研究结果一致，即半月板无血运区损伤后不能自愈。
近年来，随着组织工程的兴起，许多组织的修复再生由不可能变为可能，由低级向高级质量方向修复，由具有再生可能变为可以成功地再生，组织工程修复半月板的要求是将体外扩增培养到合适数量级的种子细胞，复合到具有良好生物相容性的支架材料上，并添加相对应的细胞因子，形成支架-细胞复合物，移植入体内进行半月板损伤的修复，经过一段时间后，支架材料慢慢被降解吸收，但是种子细胞却能不断地生殖增长并分泌胞外基质，从而最终能够形成新生半月板组织，研究主要在以下三个方面：种子细胞体外培养、支架材料选择、组织工程化构建。
骨髓间充质干细胞来源充足、繁殖能力强、取材方便、创伤小、无免疫排斥反应、不存在伦理道德问题，体外培养达30代以上，细胞数目扩增100万倍以上，仍具有良好的增值和分化潜能，体外诱导可分化为骨细胞、软骨细胞、纤维软骨、脂肪细胞、肌腱细胞、肌肉细胞、神经细胞等多种细胞，其被认为是组织工程的理想的种子细胞。
目前，半月板支架材料主要分为天然支架和人工支架：壳聚糖、骨膜、丝素蛋白、小肠粘膜下层等天然支架，基本都存在于机械性能不足及孔隙结构不可改变等缺点，PluronicF-127、聚羟基乙酸（PGA）、聚乳酸（PLA）、聚己内酯（PCL）等人工合成支架材料，孔径及空隙率可以控制、生物力学性能以及降解率稳定，但是缺乏对细胞的吸附力，所以新型的支架材料也成为研究的热点。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中的治疗效果不好的缺陷，提供一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法来解决上述问题。
本发明公开了一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法，具体步骤为：
（1）、无菌条件下，采用内含1ml肝素钠生理盐水的20ml注射器抽出患者的自体骨髓9ml,去针头后，加入含10ml DMEM高糖培养基的培养瓶中，混匀后，得到骨髓悬液备用，然后在无菌条件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封备用；
（2）、将外周血置于50ml离心管中，在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，再将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，制备得到自体血清，分装待用；
（3）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，梯度离心20min；
（4）、吸取中间白膜层，加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，然后加入50mlPBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，加入20ml DMEM高糖培养基，吹打计数，得到细胞悬液；
（5）、将细胞悬液分装于5个含24ml DMEM高糖培养基的T175培养瓶中，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养；
（6）、第4天更换一次培养液，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基，该DMEM高糖培养基中也含5 ng/ml FGF-2、10%自体血清、硫酸庆大霉素40U/ml；
（7）、第13天，向未传代的细胞培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，胰蛋白酶-EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，置于37℃，5%的CO2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖DMEM培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，在1200rpm的条件下，再将细胞悬液离心7min，再用生理盐水洗3次；
（9）、再用0.5ml生理盐水重悬细胞；
（10）、取一块牛源Ⅰ型胶原蛋白膜，将细胞悬液滴注于牛源Ⅰ型胶原蛋白膜中，细胞密度为1×106/cm2；
（11）、将牛源Ⅰ型胶原蛋白膜浸泡于生理盐水中，然后置于37℃，5%的CO2培养箱中孵育6h，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200U/ml。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的DMEM高糖培养基中含硫酸庆大霉素，所述的硫酸庆大霉素在DMEM高糖培养基中的浓度为40U/ml。
作为优选，所述的步骤（4）中，所述的DMEM高糖培养基含有FGF-2、自体血清、硫酸庆大霉素，所述的DMEM高糖培养基中的FGF-2的浓度为5 ng/ml ，所述的DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，所述的DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml。
作为优选，所述的步骤（5）中，所述的DMEM高糖培养基含有FGF-2、自体血清、硫酸庆大霉素，所述的DMEM高糖培养基中的FGF-2的浓度为5 ng/ml ，所述的DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，所述的DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml。
所述的步骤（7）中，胰蛋白酶- EDTA 溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
本发明相比现有技术具有以下优点：
1、本技术采用自体骨髓间充质干细胞作为种子细胞，自体骨髓间充质干细胞来源充足、繁殖能力强、取材方便、创伤小、无免疫排斥反应、不存在伦理道德问题；
2 、本技术采用牛源Ⅰ型胶原蛋白作为支架材料，其具有海绵状结构，易于吸附细胞，又具有足够的机械强度；
3、 本技术使用5ng/ml的成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）诱导骨髓间充质干细胞生长，其可以促进干细胞的分离增殖，缩短培养周期，同时又保持干细胞的分化潜能；
4 、本技术使用未传代的自体骨髓间充质干细胞来构建支架，未传代的细胞具有典型的干细胞表面标志物特征，包括高表达CD105、CD90，低表达CD34、CD45；
5 、本技术使用自体血清，其无免疫原性问题；。
6 、本技术使用40U/ml硫酸庆大霉素作为抑菌剂，有效起到抑菌的作用。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
本发明公开了一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法，具体步骤为：
（1）、无菌条件下，采用内含1ml肝素钠生理盐水的20ml注射器抽出患者的自体骨髓9ml,去针头后，加入含10ml DMEM高糖培养基的培养瓶中，混匀后，得到骨髓悬液备用，然后在无菌条件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封备用；
（2）、将外周血置于50ml离心管中，在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，再将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，制备得到自体血清，分装待用；
（3）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，梯度离心20min；
（4）、吸取中间白膜层，加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，然后加入50mlPBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，加入20ml DMEM高糖培养基，吹打计数，得到细胞悬液；
（5）、将细胞悬液分装于5个含24ml DMEM高糖培养基的T175培养瓶中，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养；
（6）、第4天更换一次培养液，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基，该DMEM高糖培养基中也含5 ng/ml FGF-2、10%自体血清、硫酸庆大霉素40U/ml；
（7）、第13天，向未传代的细胞培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，胰蛋白酶-EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，置于37℃，5%的CO2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖DMEM培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，在1200rpm的条件下，再将细胞悬液离心7min，再用生理盐水洗3次；
（9）、再用0.5ml生理盐水重悬细胞；
（10）、取一块牛源Ⅰ型胶原蛋白膜，将细胞悬液滴注于牛源Ⅰ型胶原蛋白膜中，细胞密度为1×106/cm2；
（11）、将牛源Ⅰ型胶原蛋白膜浸泡于生理盐水中，然后置于37℃，5%的CO2培养箱中孵育6h，即可。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200U/ml。
作为优选，所述的步骤（1）中，所述的DMEM高糖培养基中含硫酸庆大霉素，所述的硫酸庆大霉素在DMEM高糖培养基中的浓度为40U/ml。
作为优选，所述的步骤（4）中，所述的DMEM高糖培养基含有FGF-2、自体血清、硫酸庆大霉素，所述的DMEM高糖培养基中的FGF-2的浓度为5 ng/ml ，所述的DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，所述的DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml。
作为优选，所述的步骤（5）中，所述的DMEM高糖培养基含有FGF-2、自体血清、硫酸庆大霉素，所述的DMEM高糖培养基中的FGF-2的浓度为5 ng/ml ，所述的DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，所述的DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml。
所述的步骤（7）中，胰蛋白酶- EDTA 溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
实施例1
本发明公开了一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法，具体步骤为：
（1）、无菌条件下，采用内含1ml肝素钠生理盐水的20ml注射器抽出患者的自体骨髓9ml,去针头后，加入含10ml DMEM高糖培养基的培养瓶中，混匀后，得到骨髓悬液备用，然后在无菌条件下，取患者外周血180ml，置于血袋中，密封备用；
（2）、将外周血置于50ml离心管中，在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，再将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，制备得到自体血清，分装待用；
（3）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，梯度离心20min；
（4）、吸取中间白膜层，加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，然后加入50mlPBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，加入20ml DMEM高糖培养基，吹打计数，得到细胞悬液；
（5）、将细胞悬液分装于5个含24ml DMEM高糖培养基的T175培养瓶中，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养；
（6）、第4天更换一次培养液，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基，该DMEM高糖培养基中也含5 ng/ml FGF-2、10%自体血清、硫酸庆大霉素40U/ml；
（7）、第13天，向未传代的细胞培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，胰蛋白酶-EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，置于37℃，5%的CO2温箱2min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖DMEM培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，在1200rpm的条件下，再将细胞悬液离心7min，再用生理盐水洗3次；
（9）、再用0.5ml生理盐水重悬细胞；
（10）、取一块牛源Ⅰ型胶原蛋白膜，将细胞悬液滴注于牛源Ⅰ型胶原蛋白膜中，细胞密度为1×106/cm2；
（11）、将牛源Ⅰ型胶原蛋白膜浸泡于生理盐水中，然后置于37℃，5%的CO2培养箱中孵育6h，即可。
所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200U/ml。
所述的步骤（1）中，所述的DMEM高糖培养基中含硫酸庆大霉素，所述的硫酸庆大霉素在DMEM高糖培养基中的浓度为40U/ml。
所述的步骤（4）中，所述的DMEM高糖培养基含有FGF-2、自体血清、硫酸庆大霉素，所述的DMEM高糖培养基中的FGF-2的浓度为5 ng/ml ，所述的DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，所述的DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml。
所述的步骤（5）中，所述的DMEM高糖培养基含有FGF-2、自体血清、硫酸庆大霉素，所述的DMEM高糖培养基中的FGF-2的浓度为5 ng/ml ，所述的DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，所述的DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml。
所述的步骤（7）中，胰蛋白酶- EDTA 溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
实施例2
本发明公开了一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法，具体步骤为：
（1）、无菌条件下，采用内含1ml肝素钠生理盐水的20ml注射器抽出患者的自体骨髓9ml,去针头后，加入含10ml DMEM高糖培养基的培养瓶中，混匀后，得到骨髓悬液备用，然后在无菌条件下，取患者外周血105ml，置于血袋中，密封备用；
（2）、将外周血置于50ml离心管中，在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，再将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，制备得到自体血清，分装待用；
（3）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，梯度离心20min；
（4）、吸取中间白膜层，加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，然后加入50mlPBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，加入20ml DMEM高糖培养基，吹打计数，得到细胞悬液；
（5）、将细胞悬液分装于5个含24ml DMEM高糖培养基的T175培养瓶中，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养；
（6）、第4天更换一次培养液，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基，该DMEM高糖培养基中也含5 ng/ml FGF-2、10%自体血清、硫酸庆大霉素40U/ml；
（7）、第13天，向未传代的细胞培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，胰蛋白酶-EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，置于37℃，5%的CO2温箱2.5min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖DMEM培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，在1200rpm的条件下，再将细胞悬液离心7min，再用生理盐水洗3次；
（9）、再用0.5ml生理盐水重悬细胞；
（10）、取一块牛源Ⅰ型胶原蛋白膜，将细胞悬液滴注于牛源Ⅰ型胶原蛋白膜中，细胞密度为1×106/cm2；
（11）、将牛源Ⅰ型胶原蛋白膜浸泡于生理盐水中，然后置于37℃，5%的CO2培养箱中孵育6h，即可。
所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200U/ml。
所述的步骤（1）中，所述的DMEM高糖培养基中含硫酸庆大霉素，所述的硫酸庆大霉素在DMEM高糖培养基中的浓度为40U/ml。
所述的步骤（4）中，所述的DMEM高糖培养基含有FGF-2、自体血清、硫酸庆大霉素，所述的DMEM高糖培养基中的FGF-2的浓度为5 ng/ml ，所述的DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，所述的DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml。
所述的步骤（5）中，所述的DMEM高糖培养基含有FGF-2、自体血清、硫酸庆大霉素，所述的DMEM高糖培养基中的FGF-2的浓度为5 ng/ml ，所述的DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，所述的DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml。
所述的步骤（7）中，胰蛋白酶- EDTA 溶液购自北京雷根生物技术有限公司。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明的范围内。本发明要求的保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。

Claims (5)

1.一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法，其特征在于：具体步骤为：
（1）、无菌条件下，采用内含1ml肝素钠生理盐水的20ml注射器抽出患者的自体骨髓9ml,去针头后，加入含10ml DMEM高糖培养基的培养瓶中，混匀后，得到骨髓悬液备用，然后在无菌条件下，取患者外周血100-200ml，置于血袋中，密封备用；
（2）、将外周血置于50ml离心管中，在3000rpm的条件下，离心30min，取上清，在3000rpm的条件下，再将上清离心30min，去沉淀，经0.22μm孔径过滤除菌，制备得到自体血清，分装待用；
（3）、将骨髓悬液沿管壁缓慢加入含20ml细胞分离液的离心管中，在2000rpm的条件下，梯度离心20min；
（4）、吸取中间白膜层，加入50ml PBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，然后加入50mlPBS吹打均匀，在1500rpm的条件下，离心5min，弃上清，加入20ml DMEM高糖培养基，吹打计数，得到细胞悬液；
（5）、将细胞悬液分装于5个含24ml DMEM高糖培养基的T175培养瓶中，置于37℃，5%的CO2培养箱中培养；
（6）、第4天更换一次培养液，以后每三天更换一次DMEM高糖培养基，该DMEM高糖培养基中也含5 ng/ml FGF-2、10%自体血清、硫酸庆大霉素40U/ml；
（7）、第13天，向未传代的细胞培养瓶内加入0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，胰蛋白酶-EDTA 溶液中的胰蛋白酶的质量浓度为0.25%，胰蛋白酶- EDTA 溶液中的EDTA 的质量浓度为0.01%，置于37℃，5%的CO2温箱2-3min后，倒置显微镜下观察到细胞回缩，细胞间隙增大，再向培养瓶里滴入高糖DMEM培养基终止消化；
（8）、用吸管反复吹打瓶底，使细胞脱落，在1200rpm的条件下，再将细胞悬液离心7min，再用生理盐水洗3次；
（9）、再用0.5ml生理盐水重悬细胞；
（10）、取一块牛源Ⅰ型胶原蛋白膜，将细胞悬液滴注于牛源Ⅰ型胶原蛋白膜中，细胞密度为1×106/cm2；
（11）、将牛源Ⅰ型胶原蛋白膜浸泡于生理盐水中，然后置于37℃，5%的CO2培养箱中孵育6h，即可。
2.根据权利要求1所述的一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法，其特征在于：所述的步骤（1）中，所述的肝素钠生理盐水的浓度为1200U/ml。
3.根据权利要求1或2所述的一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法，其特征在于：所述的步骤（1）中，所述的DMEM高糖培养基中含硫酸庆大霉素，所述的硫酸庆大霉素在DMEM高糖培养基中的浓度为40U/ml。
4.根据权利要求1所述的一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法，其特征在于：所述的步骤（4）中，所述的DMEM高糖培养基含有FGF-2、自体血清、硫酸庆大霉素，所述的DMEM高糖培养基中的FGF-2的浓度为5 ng/ml ，所述的DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，所述的DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml。
5.根据权利要求1所述的一种用于修复无血运区半月板损伤的细胞支架的构建方法，其特征在于：所述的步骤（5）中，所述的DMEM高糖培养基含有FGF-2、自体血清、硫酸庆大霉素，所述的DMEM高糖培养基中的FGF-2的浓度为5 ng/ml ，所述的DMEM高糖培养基中的自体血清的体积浓度为10%，所述的DMEM高糖培养基中的硫酸庆大霉素的浓度为40U/ml。
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