CN102526806B - 一种组织工程软骨及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种组织工程软骨及其制备方法，本发明软骨具有细胞活性，为表层、中层、深层和钙化层依次层状排列的细胞膜片构成，主要成分为胶原基质；各层之间以胶原及透明质酸复合，采用流体静压培养以促进各层软骨结构边界融合；采用各层软骨细胞膜片制备，以及多层结构组装的步骤制备而成。所制备的组织工程软骨呈天然软骨分层排列，具有很好的组织结构和力学性能(摩擦系数为天然软骨组织的75％～85％，弹性模量为天然软骨组织的80％～90％)，各层之间融合性好，经实验证明，能够形成与正常软骨组织一致的潮线，层状结构一致；并具有较好的促软骨再生及功能恢复能力，明显缩短软骨损伤治疗周期，适用于关节软骨承重部位的软骨缺损修复。
Description
技术领域
本发明属于组织工程学医用生物材料技术领域，具体涉及一种具有天然结构与功能的组织工程软骨及其制备方法。
背景技术
天然关节软骨的组成结构，随着深度变化，软骨细胞的大小、形状和密度也发生着变化，胶原含量随着深度增加而下降，而蛋白多糖的含量则随着深度的增加而增加。根据软骨细胞及软骨间质的形态变化，关节软骨由关节面至骨骼分为四层结构，分别为表层、中层、深层以及钙化层。各层间没有明显界限，但其组成、结构和力学特性均有所不同，细胞形态和功能也有差别。表层是天然软骨中最薄的一层，厚度仅占整个关节软骨的5％～10％，该层可完整地从关节软骨上剥离；中层占关节软骨整体厚度的40％～45％，其形态和间质的组成介于表层与深层之间，该层的细胞呈圆形或卵圆形，代谢比表层活跃，细胞质内有大量诸如粗面内质网、高尔基体等具有分泌功能的细胞器；深层约占关节软骨厚度的30％，该层细胞的直径大、数量多，与中层一样呈圆形或卵圆形，并且垂直于关节面呈柱状排列；钙化层位于深层与软骨下骨之间，该层较薄，细胞很少且部分蜕变，细胞质内粗面内质网和高尔基体等细胞器极少，细胞周围是钙化组织，软骨细胞如同镶嵌在陷窝中。
软骨在关节功能中发挥着重要的作用。然而，关节软骨损伤是十分常见的疾病，临床上各种原因进行的关节镜手术约60％的病人均发现有软骨损伤，20％为较重的软骨损伤。由于软骨内缺乏血管组织，而且软骨细胞被包裹在基质成分中，不能迁移到损伤部位修复缺损，致使关节软骨损伤后的自愈能力很差，不能实现再生。软骨损伤如不及时治疗，易造成后期关节面软化，严重的可出现大片脱落，使软骨下骨层裸露，造成关节弹响、僵硬、疼痛加重等，最终需要关节置换，严重地影响患者的生活质量。
研究表明，依所含胶原纤维成分的不同，软骨分为三种类型，即透明软骨、弹性软骨和纤维软骨。透明软骨间质内仅含少量胶原纤维，基质较丰富，新鲜时呈半透明状；弹性软骨的构造与透明软骨相似，只是间质内含有大量的弹性纤维，互相交织成网，使其具有很大的弹性；纤维软骨的特点是基质很少，含有大量平行或交叉排列的胶原纤维束，力学性能较差。因此，如何实现损伤部位软骨组织天然结构与功能的恢复是软骨损伤治疗的最终目的。
传统的治疗方法有关节灌洗术、关节清理术、微骨折手术、骨膜移植、软骨移植和自体软骨细胞移植等，已广泛用于关节软骨的损伤修复，但临床应用结果显示，这些方法均存在不足。例如，关节清理术只能暂时缓解症状，不能有效治疗软骨损伤；微骨折手术只能在缺损部位再生纤维软骨，不能达到正常软骨的力学要求，存在后期退化的隐患；自体软骨移植效果较好，仅适用于软骨缺损面积较小(＜2cm2)的损伤治疗；异体软骨移植可用于较大缺损修复，但供体来源有限，并有感染传染病、免疫排斥的风险。临床研究还表明，软骨细胞移植是目前修复关节软骨损伤、实现功能重建的有效途径；其第一代移植技术需要采用患者自体骨膜封闭缺损位置，增加了对患者的损伤，易形成骨膜肥大，需要二次手术；第二代技术采用胶原/透明质酸膜代替自体骨膜封闭缺损表面，移植细胞悬液易造成软骨细胞渗漏，使新生软骨表面不平整；第三代技术是在胶原膜上直接种植细胞，以纤维蛋白胶作为固定液，贴附至软骨缺损部位，以期形成均匀的软骨，但临床结果显示，该技术生成的软骨大部分为纤维软骨，疗效不及第一代技术稳定，是由于软骨细胞不能穿透胶原膜，只能在胶原膜表面贴附生长，该材料在植入缺损位置后，形成的软骨组织多为纤维软骨，比正常软骨的力学性能差、易退化。
基于软骨组织的结构，如何在体外条件下构建组织工程软骨，用于软骨损伤的修复，为软骨缺损治疗提供更好的选择，具有很好的临床应用价值。
细胞膜片技术是指在体外将细胞连续培养，使细胞复层生长形成一种由细胞和细胞外基质组成的膜片，该膜片具有一定的机械强度，并可以用细胞刮刀或是温敏材料方便地与培养皿分离。细胞膜片已被广泛应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提供一种组织工程软骨及其制备方法，所制备的组织工程软骨具有表层、中层、深层和钙化层的天然结构，以及与天然软骨一致的抗压强度和表面摩擦特性，能承受静态的、周期的、反复的高负荷，承受负重时组织中产生的压力和张力，适用于软骨缺损修复，特别是关节承重部位的软骨缺损修复。
本发明所提出的组织工程软骨的特征为，具有细胞活性的类天然软骨组织结构，为表层、中层、深层和钙化层依次层状排列的细胞膜片构成，主要成分为胶原基质；其中，表层由滑膜间充质细胞及其分泌的细胞外基质构成，在软骨组织微环境下所形成致密的纤维化软骨表层；中层由软骨细胞及其分泌的具有透明软骨特征的细胞外基质构成，具有高密度的三维结构；深层由骨髓间充质干细胞诱导分化的软骨细胞及其分泌的细胞外基质构建，具有向肥大软骨细胞转化的特性；钙化层由骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞及其分泌的细胞外基质构建，细胞密度更大，能促进软骨组织与宿主软骨下骨的融合；各层之间以胶原及透明质酸复合，在体外流体静压条件下培养后，能够促进各层软骨结构边界融合。
本发明的组织工程软骨的制备方法，是采用软骨细胞、滑膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞经诱导培养，分别制备成细胞膜片，以胶原及透明质酸复合后，经体外流体静压条件下培养，得到具有天然层状结构和生理功能的组织工程软骨；其充分发挥了细胞外基质的分泌能力和结构功能，以及细胞在组织构建中的作用。具体步骤包括(各层的制备顺序不受限制)：
步骤一、制备软骨钙化层：取第3～4代骨髓间充质干细胞按0.5×105/cm2～5×105/cm2的密度接种在细胞培养孔板内，待细胞贴壁后更换培养液A培养7～21天，使骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞并形成膜状结构，完成软骨钙化层制备；所述培养液A的组成为：在商用高糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、地塞米松10-9～10-8mol/L、β-甘油磷酸钠2～20mmol/L和抗坏血酸10～100μg/mL；
所制备的钙化层由骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞及其分泌的细胞外基质构成，无外源支架参与，相比细胞复合支架材料构建的组织工程软骨，细胞密度更大，具有更好的细胞活性和微环境，在植入软骨缺损部位后，保证钙化层内的细胞能够大量合成分泌钙化层特有的细胞外基质，促进移植软骨组织与宿主软骨下骨的融合，提高软骨成活率及结构的功能作用。
步骤二、制备软骨深层：将第3～4代骨髓间充质干细胞以0.2×105/cm2～5×105/cm2的密度接种在细胞培养孔板内，待细胞贴壁后更换培养液B诱导培养7～15天，使骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞并形成膜状结构，完成软骨深层制备；所述培养液B的组成为：在商用高糖型DMEM培养液中含有，转化生长因子β1(TGF-β1)为1～20ng/mL、碱性形成纤维生长因子-2(bFGF-2)为2～15ng/mL、地塞米松10-8～10-6mol/L、胰岛素5～15μg/mL、亚硒酸钠5～15μg/L、牛血清白蛋白1～5g/L、维生素C(Vc)15～100μg/mL和丙酮酸钠75～200μg/mL；
其中的诱导分化培养方法可以参考文献：Hyun Jung Yoo et al.GeneExpression Profile during Chondrogenesis in Human Bone Marrow derivedMesenchymal Stem Cells using a cDNA Microarray.J Korean Med Sci.2011；26(7)：851-858；
本步骤诱导分化的软骨细胞在增殖的同时，具有向体积较大、呈圆形或卵圆形的肥大软骨细胞的转化趋势，肥大软骨细胞是软骨细胞终末分化形式。深层的蛋白质多糖含量最高，胶原纤维最粗，软骨细胞呈明显的放射状排列，基质成分能将软骨细胞完整包裹，形成明显的软骨陷窝，并且呈垂直于关节面的柱状排列。
本步骤选择骨髓间充质干细胞(BMSCs)为种子细胞，在体外生长环境和诱导因子的作用下分化为软骨细胞，并在软骨细胞和分泌基质构成的特有微环境下向肥大软骨细胞转化，肥大软骨细胞复层化形成细胞膜片，最终构成具有天然软骨特征的深层结构；肥大软骨细胞之间具有丰富的透明软骨细胞外基质将细胞紧密包裹，具有很好的机械强度。
步骤三、制备软骨中层：将1～4代的软骨细胞按0.5×105/cm2～5×105/cm2的密度接种在细胞培养孔板内，加入培养液C培养7～15天，每2～3天换液一次，完成软骨中层制备；所述培养液C的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺10～500μg/mL、Vc为50～100μg/mL、TGF-β1为5～10ng/mL、bFGF-2为5～50ng/mL；
本步骤通过对软骨细胞体外高效扩增，能够形成由软骨细胞分泌的细胞外基质包裹软骨细胞的细胞膜片结构，完成软骨中层的制备；该结构具有天然软骨组织功能，同时能够保持细胞生物学效力，有利于软骨细胞的功能发挥及体内存活。
所构建的软骨中层具有高密度的三维结构，结构中的软骨细胞能够分泌具有透明软骨特征的细胞外基质，细胞与胞外基质间能够形成良好的信号传导，并排除材料对信号传导的干扰；细胞分泌的胶原基质相互交错有利于细胞在体外环境下保持表型的稳定；细胞因细胞外基质的存在而紧密联系在一起，在构建移植体时不会因为培养液的流动而造成细胞流失，增强了组织修复的稳定性和有效性。
步骤四、制备软骨表层：将滑膜间充质干细胞以0.5×105/cm2～8×105/cm2的密度接种在步骤三制备的软骨中层(软骨细胞膜片)表面，采用培养液D培养3～7天，完成软骨表层的制备及其与软骨中层的组装；所述培养液D的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺50～500μg/mL、Vc为25～100μg/mL、TGF-β1为1～10ng/mL、bFGF-2为3～15ng/mL、地塞米松为10-8～10-6mol/L；
所述滑膜间充质干细胞(SMSCs)的获取和培养参考文献：Van LanduytKB，Jones EA，McGonagle D，Luyten FP，Lories RJ.Flow cytometriccharacterization of freshly isolated and culture expanded humansynovial cell populations in patients with chroni carthritis.Arthritis Res Ther.2010，12(1)：R15。
本步骤采用滑膜间充质干细胞为种子细胞，该细胞具有良好的增殖能力和分化潜能，能够在滑膜间充质干细胞及其分泌的细胞外基质构成的软骨微环境条件下分化成排列致密的表层细胞，大量的表层细胞分泌细胞外基质，共同形成纤维化软骨表层，保证了软骨表面的低摩擦系数及软骨组织高抗压强度，同时阻止了深层细胞外基质中的水分在压力作用下的外流。
步骤五、组织工程软骨多层结构的组装：将上述制备的各层软骨组织，按层状排列由上到下分别为：表层、中层、深层与钙化层，各层之间采用以2～8mg/mL浓度的胶原与10～40mg/mL浓度的透明质酸按2∶1体积比混合的混合液粘合，形成“三明治”状的层状结构；将其置入无菌密封的包装袋内，加入培养液E，排净袋内空气后密封，再放入压力装置的压力舱内，舱内灌满无菌水排净气泡进行培养；设置流体静压力参数为0.1～2Hz、50～15000kPa；37℃恒温条件下，每天加压2～8小时，培养4～15天，完成组织工程软骨的制备；所述培养液E的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺50～300μg/mL、Vc为50～200μg/mL、TGF-β1为3～15ng/mL、bFGF-2为5～20ng/mL和地塞米松1×10-8～5×10-6mol/L。
本步骤中压力动态流体静压条件下诱导培养的软骨各层结构更加致密，细胞层间基质成分含量上升，细胞间及其与基质成分间具有良好的信号传导；培养结束后，可见构建的细胞层状结构有组织块形态形成。组织学(HE)检测结果显示：组织中细胞排列紧凑，有软骨细胞陷窝出现。
本发明采用骨髓间充质干细胞进行不同条件下的诱导培养以及细胞膜片制备，构建出结构及功能与天然软骨一致的组织工程软骨。该软骨符合天然软骨组织解剖学、功能学结构特点；细胞膜片能够在体外条件下提高种子细胞的存活时间，发挥细胞的组织构建作用，提高钙化层与软骨下骨和骨层的融合能力；其不同层结构的分子胶原、蛋白多糖与其他分子组成一种强大、耐疲劳、坚韧的固体基质，能够承受负重时组织中产生的压力和张力，具有良好的力学性能。该组织工程软骨适用于关节软骨损伤的治疗，在体内能够修复软骨损伤并重建具有关节软骨功能的软骨层。
实验结果证明，本发明的软骨组织与天然软骨成分及结构一致，在体内修复软骨损伤及功能重建均符合天然软骨的功能特点，在缺损部位能自我稳定，具有很好的力学、组织学性能，能够加速损伤部位软骨形成及功能恢复。与现有技术方法相比，本发明保证了所构建软骨具有天然软骨组织的层状结构，其结构功能完善；软骨表层采用SMSCs，其细胞外基质中胶原、纤维连接蛋白和水的含量高、蛋白多糖含量低，使得关节具有液压负重的机能，其蛋白多糖与胶原纤维交织成网可对关节软骨提供较强的抗剪力；所采用骨髓间充质干细胞(BMSCs)成软骨及成骨的诱导，基于BMSCs分化潜能，能够实现中层、深层及钙化层、软骨下骨的结构融合，增强软骨组织的力学性能及结构稳定；本发明以细胞膜片形成软骨组织特有的微环境，在体外条件下尽可能地提高细胞的存活时间及功能发挥，有效提高细胞之间及其与细胞基质之间的连接和信号传导，发挥了细胞因子在组织构建及软骨损伤治疗中的作用，提高软骨损伤修复的再生能力，缩短了治疗时间。
本发明所制备的组织工程软骨具有很好的组织结构(呈天然软骨分层排列)、较好的力学性能(摩擦系数为天然软骨组织的75％～85％，弹性模量为天然软骨组织的80％～90％)和较好的稳定性，各层之间具有良好的融合性(经兔软骨损伤修复实验证明，能够形成与正常软骨组织一致的潮线，层状结构一致，见附图3)；并具有较好的促软骨再生能力，明显缩短软骨损伤治疗周期(经裸鼠皮下植入实验证明，在2周即有明显的透明软骨组织形成)，适用于关节软骨等承重部位的软骨缺损修复。
附图说明
附图1A为本发明方法中所制备细胞膜片的照片；附图1B为本发明所制备的组织工程软骨在裸鼠皮下异位软骨形成能力检测的照片(4周取材)，显示所构建的组织工程软骨具有良好的软骨形成能力。
附图2为本发明制备的人组织工程软骨所形成的软骨组织(图1B所示)采用甲苯胺蓝(图2A)、番红-O(图2B)染色结果照片，显示所制备的软骨能够在裸鼠皮下形成透明软骨组织，说明软骨组织具有良好的天然软骨形态学结构，以及明显的软骨细胞陷窝及胶原基质成分。
附图3A为采用本发明方法制备的兔组织工程软骨修复兔关节软骨损伤20周后取材的大体照片，显示损伤部位有新生软骨形成、表面平整度良好，证明其具有良好的软骨损伤再生及功能恢复能力；附图3B为图3A的组织学(番红-O)染色检测照片：显示出再生软骨有明显的潮线出现，与天然软骨具有相似的层状结构，与周围自体软骨组织融合良好，证明具有良好的软骨损伤修复能力。
具体实施方式
以下结合实例对本发明技术方案作进一步的详细说明。
实例中采用的压力装置由英斯特朗生产的电子压力机(Instron 8871)与PARR公司生产的压力舱(Parr Instrument，Moline，IL)组成，由电脑软件控制压力参数，电子压力机在电脑控制下产生压力，压力传导到舱内转换为流体静压力，使用中压力舱内保持无菌条件。
实例1、制备人组织工程软骨
步骤一、制备软骨钙化层：将人骨髓间充质干细胞用商用低糖型DMEM培养基扩增，取第3代BMSCs按照1×105/cm2的密度接种在细胞培养用6孔培养板内，待细胞完全贴壁后，更换培养液A进行诱导培养；所述培养液A的组成为：在商品用高糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L和抗坏血酸50μg/mL。
诱导分化为成骨细胞的检测：在培养第7和14天时分别进行碱性磷酸酶钙钴法染色、钙茜素红染色和I型胶原免疫组化检测BMSCs诱导分化为成骨细胞情况，结果呈阳性；培养15天后完成软骨钙化层的制备。
骨髓间充质干细胞(BMSCs)的获取与培养可以参考：Beloti MM，RosaAL.Osteoblast differentiation of human bone marrow cells undercontinuous and discontinuous treatment with dexamethasone.Braz DentJ.2005；16(2)：156-61。
步骤二、制备软骨深层：取第3代BMSCs为种子细胞，按2×105/cm2的密度接种在细胞培养用6孔培养板内，待细胞完全贴壁后，更换培养液B进行诱导培养；所述培养液B的组成为：在商用高糖型DMEM培养液中含有，TGF-β1为10ng/mL、bFGF-2为5ng/mL、地塞米松10-8mol/L、胰岛素为6.25μg/mL、亚硒酸钠6.25μg/L、牛血清白蛋白1.25g/L、Vc为25μg/mL和丙酮酸钠75μg/mL。
诱导分化为软骨细胞的检测：在培养第7和14天时分别进行II型胶原免疫组化和甲苯胺蓝染色检测BMSCs诱导分化为软骨细胞情况，结果呈阳性；培养15天后完成软骨深层的制备。
步骤三、制备软骨中层：取第2代软骨细胞按照2×105/cm2的密度将细胞接种在细胞培养用6孔培养板内，加入培养液C培养15天，每2天换液一次，完成软骨中层制备；所述培养液C的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L，L-谷氨酰胺500μg/mL、Vc为75μg/mL、TGF-β1为10ng/mL、bFGF-2为10ng/mL。
步骤四、制备软骨表层：将第3代人SMSCs按1×105/cm2的细胞密度接种在步骤三制备的软骨细胞膜片(软骨中层)表面，待细胞完全贴在软骨中层上，采用培养液D培养7天，完成软骨表层的制备及其与软骨中层的组装；所述培养基D的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺50μg/mL、Vc为50μg/mL、TGF-β1为10ng/mL、bFGF-2为5ng/mL、地塞米松10-8mol/L。
步骤五、人组织工程软骨多层结构的组装：将上述制备的各层软骨组织，按层状排列由上到下分别为：表层、中层、深层与钙化层，各层之间采用以8mg/mL浓度的胶原与10mg/mL浓度的透明质酸按2∶1体积比混合的混合液粘合，制成“三明治”状的层状结构；将该层状结构的软骨放入无菌密封的包装袋内，加满培养液E，排除袋内空气后密封，放入压力装置的压力舱内，舱内灌满无菌水排净气泡，设置流体静压力参数为1Hz、2000kPa，在37℃恒温培养，每隔19小时，加压作用5小时，连续培养8天，完成人组织工程软骨的制备；所述培养基E的组成为：在商品用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L，L-谷氨酰胺290μg/mL、Vc为50μg/mL、TGF-β1为10ng/mL、bFGF-2为10ng/mL、地塞米松10-8Mol/L。
植入裸鼠皮下进行有效性验证：
将所制备的人组织工程软骨组织植入裸鼠皮下，检测在体内的软骨形成能力，4周后取材进行组织学检测。取材之前，植入物轮廓在动物背部皮下清晰可见；取材后，外观呈现为成熟软骨组织，有珍珠样光泽，弹性好，硬度和柔软度也类似正常软骨组织；组织块呈透明状，具有一定强度。组织学检测表明，有大量软骨样组织生成，细胞为类圆形，可见软骨陷窝，形成组织中胞核及细胞周围基质成分均有明显着色，证明所制备的软骨组织可以在异位形成透明软骨。
实例2、制备兔组织工程软骨
步骤一、制备软骨钙化层：取第3代兔BMSCs按照1.5×105/cm2的密度接种在细胞培养用12孔培养板内，待细胞贴壁后更换培养液A，进行诱导培养；培养液A的组成为：在商用高糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、地塞米松10-8mol/L、β-甘油磷酸钠10mmol/L和抗坏血酸75μg/mL。
诱导分化为成骨细胞的检测：按实例1的检测方法进行，结果呈阳性；培养14天后完成软骨钙化层的制备。
步骤二、制备软骨深层：取第3代BMSCs按1×105/mL的密度接种在细胞培养用12孔培养板内，待细胞贴壁后更换培养液B，进行诱导培养；培养液B的组成为：在商用高糖型DMEM培养液中含有，TGF-β1为10ng/mL、bFGF-2为10ng/mL、地塞米松10-8mol/L、胰岛素6.25μg/mL、亚硒酸钠5μg/L、牛血清白蛋白1.25g/L、Vc为50μg/mL和丙酮酸钠75μg/mL。
诱导分化为软骨细胞的检测：按实例1的检测方法进行，结果呈阳性；培养15天后完成软骨深层的制备。
步骤三：制备软骨中层：取第2代软骨细胞按照1.5×105/cm2的密度将细胞接种在细胞培养用12孔培养板内，加入培养液C培养10天，每3天换液一次，完成软骨中层制备；培养液C的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L，L-谷氨酰胺290μg/mL、Vc为75μg/mL、TGF-β1为10ng/mL、bFGF-2为5ng/mL。
步骤四：制备软骨表层：在细胞培养用12孔培养板内，以第4代兔SMSCs按照1×105/cm2的密度将细胞接种在步骤三制备的软骨细胞膜片表面，待细胞完全贴在软骨中层上，采用培养液D培养5天，完成软骨表层的制备及其与软骨中层的组装；培养液D的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺50μg/mL、Vc为75μg/mL、TGF-β1为10ng/mL、bFGF-2为10ng/mL、地塞米松10-8mol/L。
步骤五：兔组织工程软骨多层结构的组装：将上述制备的软骨组织四层膜片按层状排列由上到下分别为：表层、中层、深层与钙化层，各层之间采用以8mg/mL浓度的胶原与15mg/mL浓度的透明质酸按2∶1体积比混合的混合物粘合，制成“三明治”状的层状结构；
将该层状结放入无菌密封的包装袋内，加满培养液E，排除袋内空气后密封，放入压力装置的压力舱内，舱内灌满无菌水排净气泡，设置流体静压力参数为0.5Hz、500kPa，在37℃恒温培养，每隔21小时加压作用3小时，连续培养6天，完成兔组织工程软骨的制备；培养液E的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L，L-谷氨酰胺50μg/mL、Vc为50μg/mL、TGF-β1为10ng/mL、bFGF-2为5ng/mL、地塞米松10-8mol/L。
动物有效性验证：
选取约2kg重新西兰兔，麻醉后双侧膝关节部位剪毛，消毒后在膝关节内侧切口，造成髌骨外侧脱位，用齿科钻在髌股关节滑车部造成直径4mm的全层软骨缺损，植入所制备的兔组织工程软骨，另膝造成缺损后为空白对照；手术后动物不作固定，笼中饲养自由活动。20周后取材进行大体观察及组织学检测：移植软骨组缺损部位有新生软骨组织生成，其颜色、质地、平整度均与自体软骨组织趋于一致；透明软骨细胞增多，出现软骨陷窝，细胞核及基质异染明显，潮线明显；新生软骨层与周边软骨结合趋于紧密，表面平整有光泽、强度。
Claims (3)
1.一种组织工程软骨，其特征在于，所述的软骨为具有细胞活性的类天然软骨组织结构，由表层、中层、深层和钙化层依次层状排列的细胞膜片构成，主要成分为胶原基质；其中，表层由滑膜间充质细胞及其分泌的细胞外基质构成，在软骨组织微环境下所形成致密的纤维化软骨表层；中层由软骨细胞及其分泌的具有透明软骨特征的细胞外基质构成；深层由骨髓间充质干细胞诱导分化的软骨细胞及其分泌的细胞外基质构建，具有向肥大软骨细胞转化的特性；钙化层由骨髓间充质干细胞诱导分化的成骨细胞及其分泌的细胞外基质构建；各层之间以胶原及透明质酸复合，在体外流体静压条件下培养后，能够促进各层软骨结构边界融合。
2.制备权利要求1所述组织工程软骨的方法，其特征在于，是采用软骨细胞、滑膜间充质干细胞和骨髓间充质干细胞经诱导培养，分别制备成细胞膜片，以胶原及透明质酸复合，经体外流体静压条件下培养，得到具有天然层状结构和生理功能的组织工程软骨。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，具体步骤包括：
步骤一、制备软骨钙化层：取第3～4代骨髓间充质干细胞按0.5×105/cm2～5×105/cm2的密度接种在细胞培养孔板内，待细胞贴壁后更换培养液A培养7～21天，使骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞并形成膜状结构，完成软骨钙化层制备；所述培养液A的组成为：在商用高糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、地塞米松10-9～10-8mol/L、β-甘油磷酸钠2～20mmol/L和抗坏血酸10～100μg/mL；
步骤二、制备软骨深层：将第3～4代骨髓间充质干细胞以0.2×105/cm2～5×105/cm2的密度接种在细胞培养孔板内，待细胞贴壁后更换培养液B诱导培养7～15天，使骨髓间充质干细胞诱导分化为软骨细胞并形成膜状结构，完成软骨深层制备；所述培养液B的组成为：在商用高糖型DMEM培养液中含有，转化生长因子β1为1～20ng/mL、碱性形成纤维生长因子-2为2～15ng/mL、地塞米松10-8～10-6mol/L、胰岛素5～15μg/mL、亚硒酸钠5～15μg/L、牛血清白蛋白1～5g/L、维生素C为15～100μg/mL和丙酮酸钠75～200μg/mL；
步骤三、制备软骨中层：将1～4代的软骨细胞按0.5×105/cm2～5×105/cm2的密度接种在细胞培养孔板内，加入培养液C培养7～15天，每2～3天换液一次，完成软骨中层制备；所述培养液C的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺10～500μg/mL、维生素C为50～100μg/mL、转化生长因子β1为5～10ng/mL、碱性形成纤维生长因子-2为5～50ng/mL；
步骤四、制备软骨表层：将滑膜间充质干细胞以0.5×105/cm2～8×105/cm2的密度接种在步骤三制备的软骨中层表面，采用培养液D培养3～7天，完成软骨表层的制备及其与软骨中层的组装；所述培养液D的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺50～500μg/mL、维生素C为25～100μg/mL、转化生长因子β1为1～10ng/mL、碱性形成纤维生长因子-2为3～15ng/mL、地塞米松为10-8～10-6mol/L；
步骤五、组织工程软骨多层结构的组装：将上述制备的各层软骨组织，按层状排列由上到下分别为：表层、中层、深层与钙化层，各层之间采用以2～8mg/mL浓度的胶原与10～40mg/mL浓度的透明质酸按2∶1体积比混合的混合液粘合，形成层状结构；将该层状结构置入无菌密封的包装袋内，加入培养液E，排净袋内空气后密封，再放入压力装置的压力舱内，舱内灌满无菌水排净气泡进行培养，设置流体静压力参数为0.1～2Hz、50～15000kPa；37℃恒温条件下，每天加压2～8小时，培养4～15天，完成组织工程软骨的制备；所述培养液E的组成为：在商用低糖型DMEM培养液中含有，胎牛血清100ml/L、L-谷氨酰胺50～300μg/mL、维生素C为50～200μg/mL、转化生长因子β1为3～15ng/mL、碱性形成纤维生长因子-2为5～20ng/mL和地塞米松1×10-8～5×10-6mol/L。
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