CN115785256A - 一种调控胶原与细胞受体结合能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医学生物技术领域,具体涉及一种调控胶原与细胞受体结合能力的方法。该方法包括:1)将胶原与去离子水置于柔性包装材料中;2)排除空气后,充入0.1~0.5MPa压力的二氧化碳并密封;3)置于恒温振荡器,在低温条件下,充分振荡至形成均一的混合物;4)置于超高压处理机内腔中,进行静压力场处理;5)取出密封的胶原样品,快速冷冻;6)解除密封,释放出二氧化碳,冷冻干燥。本发明利用可挥发性的二氧化碳和物理属性的静压力场,在不改变胶原化学结构、不引入外源性组分的前提下,调控胶原分子的精细空间结构,进而实现胶原与细胞受体结合能力的差异化调控。
Description
技术领域
本发明属于医学生物技术领域,更具体地,涉及一种调控胶原与细胞受体结合能力的方法。
背景技术
胶原是多细胞生物中含量最丰富的结构类蛋白质,广泛分布于皮肤、骨骼、肌腱、角膜、血管等组织中,在生物组织的形成和功能发挥中扮演着不可或缺的角色。因其良好的亲水性、优异的生物相容性、柔韧性、趋化性、生物降解性和极低的抗原性,在生物医药、医学美容、化妆品等领域均有广泛的应用。在生物医学材料的创制中,源于细胞外基质(ECM)的胶原可以为细胞粘附、迁移、扩散和增殖提供优异的“仿生”环境,因此,胶原被视为组织再生中最重要的生物材料之一。
胶原与细胞受体的结合能力在调节细胞行为方面(如细胞粘附、增值、迁移)发挥着至关重要的作用,也是其生物学功能的核心。与天然胶原特异性结合的细胞受体中,被广泛表达的主要有两大类:整合素(α1β1、α2β1、α10β1和α11β1)和盘状结构域受体(DDR1和DDR2)。大量研究证实,这些受体与胶原的互作用是调节细胞迁移、增殖、分化等细胞过程以及ECM重塑的关键,并与骨骼、乳腺、血管等组织的正常发育、伤口愈合、炎症反应以及癌细胞的浸润和转移等密切相关。理想的胶原基材料应具备灵活、可调控的细胞受体结合能力,以满足不同场景对细胞响应的差异化需求。例如,用于创面修复、止血海绵、组织工程支架的胶原基质材料,需强化其与细胞受体的响应能力;用于植入器械涂层、人工血管等场景时,则需弱化胶原基质与细胞受体的结合能力,以避免产生血栓等不良反应;用作靶向药物载体时,需要胶原具有选择性的细胞受体结合能力,从而实现特异性结合病变组织细胞达到靶向检测或药物递送的目的。
但目前传统方法难以实现从分子水平上调控胶原与细胞受体结合能力。其中,通过加入微扰物质、化学修饰等方法引入的基团变化和残留试剂极易引发其他细胞相容性问题;而在众多物理扰动方法中,温度场扰动易诱发形成不可控的无序构造;电磁场作用成本高昂,常用于蛋白质分子行为的调控,对蛋白质的空间构型仅有微弱的影响。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种能从分子水平上调控胶原与细胞受体结合能力的技术方法。该方法是基于静压力场调控胶原分子空间构型这一科学发现来实现的。该方法基于Le Chatelier原理调控分子体积和原子间距,为纯粹的物理场作用,不涉及外来组分的添加以及胶原分子中共价键的变化,可实现其他物理或化学扰动方法难以实现的胶原-细胞受体结合能力的精细调控。
为实现上述目的,本发明提供一种调控胶原与细胞受体结合能力的方法,该方法包括:
1)在低温条件下,将胶原与去离子水置于柔性包装材料中;
2)排除空气后,充入0.1~0.5MPa压力的二氧化碳并密封;
3)将步骤2)所得密封样品置于恒温振荡器,在低温条件下,充分振荡至形成均一的混合物;
4)将步骤3)所得密封样品置于超高压处理机内腔中,进行静压力场处理;
5)静压力场处理完成后,取出密封的胶原样品,快速冷冻;
6)解除密封,释放出二氧化碳,冷冻干燥后获得细胞黏附能力、细胞受体结合能力、细胞迁移能力差异化的产品胶原。
作为优选方案,步骤1)中,所述柔性包装材料为聚乙烯袋、聚丙烯袋或带密封的硅胶管中的一种。
作为优选方案,步骤1)中,所述胶原为以哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、跟腱、鳞片中的一种或多种为原料提取的天然胶原和/或失去部分三螺旋结构的部分变性胶原。如选用哺乳动物的跟腱,选用鱼类的鳞片和两栖动物的皮肤的混合物。获得该胶原的方法为本领域技术人员常规采用的技术手段。
作为优选方案,步骤1)中,低温条件为4~20℃。
作为优选方案,步骤1)中,胶原与去离子水的质量比为1:100~10000。
作为优选方案,步骤2)中,排除空气的方法为超声、振荡、抽真空中的一种或多种。
作为优选方案,步骤3)中,低温条件为4~20℃,在不破坏胶原构型的同时快速形成均一的混合物。
作为优选方案,步骤4)中,静压力场处理的压力为100~600MPa,在不影响胶原分子共价键的同时,有效调控胶原与细胞受体的结合能力。
作为优选方案,步骤4)中,静压力场处理的时间为5~120min。
作为优选方案,步骤4)中,静压力场处理的温度为4~20℃。
作为优选方案,步骤4)中,静压力场处理的介质为水。
作为优选方案,步骤5)中,控制在静压力场处理完成后2min内取出胶原样品。
作为优选方案,步骤5)中,快速冷冻的方式可以是用液氮进行冷冻,时间优选为20~40min,如30min。
本发明的有益效果:
(1)本发明方法,为物理场作用,操作简单、生物安全性高。利用易析出、可挥发性的二氧化碳和物理属性的静压力场,在不改变胶原化学结构、不引入外源性组分的前提下,调控胶原分子的精细空间结构,进而实现胶原与细胞受体结合能力的差异化调控。
(2)本发明方法可通过优化和调节静压力场操作参数,有效调节胶原与细胞受体的结合能力,进而直接影响细胞在胶原材料界面的附着表现。以整合素α2β1为例,与天然胶原(100%)相比,经本发明的方法处理后,胶原与整合素α2β1的结合能力可在10%~150%范围内调节,可满足胶原基材料创制中不同场景对细胞响应的差异化需求。
本发明的其他特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
图1是实施例1、对比例1制得的产品胶原与天然牛跟腱胶原上HT1080细胞(人纤维肉瘤细胞)黏附的光学显微图像。
图2是实施例2、对比例2制得的产品胶原与天然青鱼皮胶原上HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)黏附的光学显微图像。
图3是实施例4制得产品胶原与热变性程度为46%的牛蛙皮胶原上CAL-27细胞(人舌鳞状上皮细胞)细胞迁移实验的光学显微图像。
具体实施方式
下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式,然而应该理解,可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反,提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整,并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。
本发明实施例中,超高压处理机为天津华泰森淼生物工程技术股份有限公司的L2-600/2型处理机。
实施例1
选择牛跟腱为原料,采用乙酸结合胃蛋白酶处理提取天然胶原,提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到牛跟腱胶原产品。该胶原经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和圆二色谱(CD)分析,证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。
在10℃下,将质量比为1:5000的牛跟腱胶原样品与去离子水装入聚乙烯包装袋中;超声排除空气后,充入0.4MPa的二氧化碳并密封;将密封好的胶原样品放置恒温振荡器,在10℃下,充分振荡至形成均一的混合物;将密封好的混合物样品放入超高压处理机内腔中,以水为传压介质,进行静压力场处理;处理条件为:静压力场压力500MPa,静压力场处理时间为15min,静压力场处理温度为10℃。静压力场处理完毕后,快速泄压,取出胶原样品,用液氮快速冷冻,解除密封释放出二氧化碳后,放置冷冻干燥机中,冷冻干燥获得产品胶原。
通过细胞结合实验测试产品胶原对HT1080细胞(人纤维肉瘤细胞)的黏附能力,结果表明较天然牛跟腱胶原提升42.1±1.2%。通过ELISA实验测试产品胶原对α2β1整合素的结合能力,结果表明较天然牛跟腱胶原提升38.3±2.2%。通过ELISA实验测试产品胶原对DDR1盘状结构域受体的结合能力,结果表明较天然牛跟腱胶原提升44.7±1.7%。通过细胞迁移实验测试产品胶原上NIH-3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞)的迁移速率,结果表明较天然牛跟腱胶原提升25.4±2.2%。
实施例2
选择青鱼皮为原料,采用乙酸处理提取天然胶原,提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到青鱼皮胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和CD分析,证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。
在15℃下,将质量比为1:600的青鱼皮胶原与去离子水装入聚丙烯包装袋中;抽真空排除空气后,充入0.3MPa的二氧化碳并密封;将密封好的胶原样品放置恒温振荡器,在15℃下,充分振荡至形成均一的混合物;将密封好的混合物样品放入超高压处理机内腔中,以水为传压介质,进行静压力场处理;处理条件为:静压力场压力600MPa,静压力场处理时间为50min,静压力场处理温度为15℃。静压力场处理完毕后,快速泄压,取出胶原样品,用液氮快速冷冻,解除密封释放出二氧化碳后,放置冷冻干燥机中,冷冻干燥获得产品胶原。
通过细胞结合实验测试产品胶原对HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)的黏附能力,结果表明较天然青鱼皮胶原下降83.3±4.2%。通过ELISA实验测试产品胶原对α2β1整合素的结合能力,结果表明较天然青鱼皮胶原下降87.5±2.9%。通过ELISA实验测试产品胶原对DDR1盘状结构域受体的结合能力,结果表明较天然青鱼皮胶原下降84.9±3.7%。通过细胞迁移实验测试产品胶原上HT1080细胞的迁移速率,结果表明较天然青鱼皮胶原下降79.8±5.2%。
实施例3
选择草鱼皮为原料,采用乙酸结合胃蛋白酶处理提取天然胶原,提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到草鱼皮胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和CD分析,证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。
在4℃下,将质量比为1:1000的草鱼皮胶原与去离子水装入带密封的硅胶管中;超声排除空气后,充入0.2MPa的二氧化碳并密封;将密封好的胶原样品放置恒温振荡器,在10℃下,充分振荡至形成均一的混合物;将密封好的混合物样品放入超高压处理机内腔中,以水为传压介质,进行静压力场处理;处理条件为:静压力场压力200MPa,静压力场处理时间为100min,静压力场处理温度为4℃。静压力场处理完毕后,快速泄压,取出胶原样品,用液氮快速冷冻,解除密封释放出二氧化碳后,放置冷冻干燥机中,冷冻干燥获得产品胶原。
通过细胞结合实验测试产品胶原对HT1080细胞的黏附能力,结果表明较天然草鱼皮胶原提升14.3±2.1%。通过ELISA实验测试产品胶原对α2β1整合素的结合能力,结果表明较天然草鱼皮胶原提升20.5±1.7%。通过ELISA实验测试产品胶原对DDR1盘状结构域受体的结合能力,结果表明较天然草鱼皮胶原提升12.7±2.8%。通过细胞迁移实验测试产品胶原上NIH-3T3细胞的迁移速率,结果表明较天然草鱼皮胶原提升11.8±1.1%。
实施例4
选择牛蛙皮为原料,采用乙酸处理提取天然胶原,提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到牛蛙皮胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和CD分析,证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。用0.1mol/L乙酸水溶液溶解该胶原得到浓度为5mg/mL的胶原溶液。随后将胶原溶液置于恒温水浴中进行适度热处理(32℃,30min),随后立即用冰水浴冷却,并冷冻干燥,获得热变性程度为46%的牛蛙皮胶原。
在15℃下,将质量比为1:500的该部分热变性胶原与去离子水装入聚乙烯包装袋中;振荡排除空气后,充入0.2MPa的二氧化碳并密封;将密封好的胶原样品放置恒温振荡器,在10℃下,充分振荡至形成均一的混合物;将密封好的混合物样品放入超高压处理机内腔中,以水为传压介质,进行静压力场处理;处理条件为:静压力场压力500MPa,静压力场处理时间为60min,静压力场处理温度为10℃。静压力场处理完毕后,快速泄压,取出胶原样品,用液氮快速冷冻,解除密封释放出二氧化碳后,放置冷冻干燥机中,冷冻干燥获得产品胶原。
通过细胞结合实验测试产品胶原对CAL-27细胞(人舌鳞状上皮细胞)的黏附能力,结果表明较热变性程度为46%的牛蛙皮胶原提升64.3±3.2%;产品胶原对EMT-6细胞(小鼠乳腺癌细胞)的黏附能力较热变性程度为46%的牛蛙皮胶原提升55.5±4.1%。通过ELISA实验测试产品胶原对α2β1整合素的结合能力,结果表明较热变性程度为46%的牛蛙皮胶原提升40.5±2.9%。通过ELISA实验测试产品胶原对DDR1盘状结构域受体的结合能力,结果表明较热变性程度为46%的牛蛙皮胶原提升32.9±3.8%。通过细胞迁移实验测试产品胶原上CAL-27细胞的迁移速率,结果表明较天然草鱼皮胶原提升11.8±1.1%。
对比例1
选择牛跟腱为原料,采用乙酸结合胃蛋白酶处理提取天然胶原,提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到牛跟腱胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和CD分析,证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。
在10℃下,将质量比为1:5000的牛跟腱胶原样品与去离子水装入聚乙烯包装袋中;超声排除空气后,充入0.4MPa的二氧化碳并密封;将密封好的胶原样品放置恒温振荡器,在10℃下,充分振荡至形成均一的混合物;将密封好的混合物样品用液氮快速冷冻,解除密封释放出二氧化碳后,放置冷冻干燥机中,冷冻干燥获得产品胶原。
通过细胞结合实验测试产品胶原对HT1080细胞的黏附能力,结果表明较天然牛跟腱胶原没有明显差异。通过ELISA实验测试产品胶原对α2β1整合素的结合能力,结果表明较天然牛跟腱胶原没有明显差异。通过ELISA实验测试产品胶原对DDR1盘状结构域受体的结合能力,结果表明较天然牛跟腱胶原没有明显差异。通过细胞迁移实验测试产品胶原上NIH-3T3细胞的迁移速率,结果表明较天然牛跟腱胶原没有明显差异。
对比例2
选择青鱼皮为原料,采用乙酸处理提取天然胶原,提取物经过盐析、透析等方法纯化后冷冻干燥得到青鱼皮胶原产品。该胶原经过SDS-PAGE和CD分析,证实为具有完整三螺旋分子结构的天然I型胶原。
在15℃下,将质量比为1:600的青鱼皮胶原与去离子水装入聚丙烯包装袋中;抽真空排除空气后密封,将密封好的胶原样品放置恒温振荡器,在15℃下,充分振荡120分钟形成混合物;将密封好的混合物样品放入超高压处理机内腔中,以水为传压介质,进行静压力场处理;处理条件为:静压力场压力600MPa,静压力场处理时间为50min,静压力场处理温度为15℃。静压力场处理完毕后,快速泄压,取出胶原样品,用液氮快速冷冻,解除密封后,放置冷冻干燥机中,冷冻干燥获得产品胶原。
通过细胞结合实验测试产品胶原对HUVEC细胞的黏附能力,结果表明较天然青鱼皮胶原没有明显差异。通过ELISA实验测试产品胶原对α2β1整合素的结合能力,结果表明较天然青鱼皮胶原没有明显差异。通过ELISA实验测试产品胶原对DDR1盘状结构域受体的结合能力,结果表明较天然青鱼皮胶原没有明显差异。通过细胞迁移实验测试产品胶原上HT1080细胞的迁移速率,结果表明较天然青鱼皮胶原没有明显差异。
图1是实施例1、对比例1制得的产品胶原与天然牛跟腱胶原上HT1080细胞(人纤维肉瘤细胞)黏附的光学显微图像。可以观察到实施例1制得产品胶原对HT1080细胞的黏附能力明显强于天然牛跟腱胶原,而对比例1制得产品胶原对HT1080细胞的黏附能力与天然牛跟腱胶原没有明显差异。
图2是实施例2、对比例2制得的产品胶原与天然青鱼皮胶原上HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)黏附的光学显微图像。可以观察到实施例2制得产品胶原对HUVEC细胞的黏附能力明显强于天然青鱼皮胶原,而对比例2制得产品胶原对HUVEC细胞的黏附能力与天然青鱼皮胶原没有明显差异。
图3是实施例4制得产品胶原与热变性程度为46%的牛蛙皮胶原上CAL-27细胞(人舌鳞状上皮细胞)细胞迁移实验的光学显微图像。可以观察到实施例3制得产品胶原上CAL-27细胞的迁移速率明显快于热变性程度为46%的牛蛙皮胶原。
其中,图1-3中各个小图中右下角的标尺均为100μm。
以上已经描述了本发明的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。
Claims (10)
1.一种调控胶原与细胞受体结合能力的方法,其特征在于,该方法包括:
1)在低温条件下,将胶原与去离子水置于柔性包装材料中;
2)排除空气后,充入0.1~0.5MPa压力的二氧化碳并密封;
3)将步骤2)所得密封样品置于恒温振荡器,在低温条件下,充分振荡至形成均一的混合物;
4)将步骤3)所得密封样品置于超高压处理机内腔中,进行静压力场处理;
5)静压力场处理完成后,取出密封的胶原样品,快速冷冻;
6)解除密封,释放出二氧化碳,冷冻干燥后获得细胞黏附能力、细胞受体结合能力、细胞迁移能力差异化的产品胶原。
2.根据权利要求1所述的调控胶原与细胞受体结合能力的方法,其中,
步骤1)中,所述柔性包装材料为聚乙烯袋、聚丙烯袋或带密封的硅胶管中的一种;
步骤1)中,所述胶原为以哺乳动物、鱼类、两栖动物的皮肤、跟腱、鳞片中的一种或多种为原料提取的天然胶原和/或失去部分三螺旋结构的部分变性胶原。
3.根据权利要求1所述的调控胶原与细胞受体结合能力的方法,其中,
步骤1)中,低温条件为4~20℃;
步骤1)中,胶原与去离子水的质量比为1:100~10000。
4.根据权利要求1所述的调控胶原与细胞受体结合能力的方法,其中,
步骤2)中,排除空气的方法为超声、振荡、抽真空中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的调控胶原与细胞受体结合能力的方法,其中,
步骤3)中,低温条件为4~20℃。
6.根据权利要求1所述的调控胶原与细胞受体结合能力的方法,其中,
步骤4)中,静压力场处理的压力为100~600MPa。
7.根据权利要求1所述的调控胶原与细胞受体结合能力的方法,其中,
步骤4)中,静压力场处理的时间为5~120min。
8.根据权利要求1所述的调控胶原与细胞受体结合能力的方法,其中,
步骤4)中,静压力场处理的温度为4~20℃。
9.根据权利要求1所述的调控胶原与细胞受体结合能力的方法,其中,
步骤4)中,静压力场处理的介质为水。
10.根据权利要求1所述的调控胶原与细胞受体结合能力的方法,其中,
步骤5)中,控制在静压力场处理完成后2min内取出胶原样品。
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