CN111298162B - 病毒灭活方法及生物材料 - Google Patents
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Abstract
本申请公开病毒灭活方法及生物材料，其中病毒灭活方法包括：以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液以获得灭活溶液；在预设条件下，利用所述灭活溶液，对生物材料进行病毒灭活处理。超临界流体的密度近于液体，粘度近于气体，扩散系数为液体的100倍，具有类似气体的扩散性及液体的溶解能力，同时兼具低黏度，低表面张力的特性，从而超临界流体能够迅速渗透进入微孔隙的物质，可以将灭活分子输送到需灭菌的生物材料的任何位置，快速有效的进行病毒灭活。以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液以获得灭活溶液，从而灭活溶液具有超临界流体的性质，可以快速有效地对生物材料进行病毒灭活处理，同时不会对生物材料的分子结构和性能造成改变。
Description
技术领域
本申请属于生物材料处理领域，具体涉及病毒灭活方法及生物材料。
背景技术
生物材料是用于与生命系统接触和发生相互作用的，并能对其细胞、组织和器官进行诊断治疗、替换修复或诱导再生的一类天然或人工合成的特殊功能材料，又称生物医用材料。生物材料有人工合成材料和天然材料；有单一材料、复合材料以及活体细胞或天然组织与无生命的材料结合而成的杂化材料。生物材料本身不是药物，其治疗途径是以与生物机体直接结合和相互作用为基本特征。
现有的病毒灭活技术对生物材料的基质损伤较大，生物材料承受传统的高温高压强酸强碱等剧烈条件的病毒灭活技术容易导致分子结构改变(包括蛋白质材料的交联、分子破碎和肽链断裂降解，导致其力学性能的显著改变)或有益成分散失(包括GAGs、生长因子等)。
发明内容
本申请提供病毒灭活方法及生物材料，以解决传统病毒灭活技术对生物材料损伤大技术问题。
为解决上述技术问题，本申请采用的一个技术方案是：一种病毒灭活方法，包括：以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液以获得灭活溶液；在预设条件下，利用所述灭活溶液，对生物材料进行病毒灭活处理。
根据本申请一实施方式，所述超临界流体包括超临界二氧化碳、超临界氨、超临界丙烷、超临界乙烯、超临界丙烯或超临界水。
根据本申请一实施方式，所述灭活液包括过氧乙酸、叔丁基过氧化氢、甲酸、过氧化氢、乙酸酐、辛酸、三氟乙酸或醇类中的一种或多种。
根据本申请一实施方式，所述预设条件包括灭活处理时的压力范围、温度范围、相对湿度和/或灭活时间，其中，所述压力范围为2-20MPa，所述温度范围为20-60℃，所述相对湿度为30％-100％，所述灭活时间为1-120分钟。
根据本申请一实施方式，所述利用所述灭活溶液，对生物材料进行病毒灭活处理包括：将生物材料放置于容器内，向容器内添加所述灭活溶液，所述灭活溶液对所述生物材料进行病毒灭活处理。
根据本申请一实施方式，所述利用所述灭活溶液，对生物材料进行病毒灭活处理还包括：对所述容器内的所述灭活溶液进行振荡、超声波、搅拌和/或内循环，其中，进行所述内循环时，所述灭活溶液的循环流量控制为0.1-50L/min。
根据本申请一实施方式，单次灭活100g以下的所述生物材料时，需要10ml-10L的所述超临界流体和1ml-1000ml的所述灭活液，其中，所述灭活液的浓度为0.1％-30％。
根据本申请一实施方式，所述生物材料包括动物源性血液制品、异体血液制品、异源生物制品、异种生物制品或疫苗制品。
根据本申请一实施方式，所述生物材料的状态为完全脱水干燥。
为解决上述技术问题，本申请采用的另一个技术方案是：一种生物材料，所述生物材料经过上述任一的方法进行病毒灭活处理。
本申请的有益效果是：超临界流体的密度近于液体，粘度近于气体，扩散系数为液体的100倍，具有类似气体的扩散性及液体的溶解能力，同时兼具低黏度，低表面张力的特性，从而超临界流体能够迅速渗透进入微孔隙的物质，可以将灭活分子输送到需灭菌生物材料的任何位置，快速有效的进行病毒灭活。以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液以获得灭活溶液，从而灭活溶液具有超临界流体的性质，可以快速有效地对生物材料进行病毒灭活处理，同时不会对生物材料的分子结构和性能造成改变。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是本申请的病毒灭活方法的一实施例的流程示意图；
图2是本申请的病毒灭活方法的另一实施例的流程示意图；
图3是本申请的病毒灭活方法的一实施例处理的样本的猪细小病毒PPV的灭活动力学曲线；
图4是本申请的病毒灭活方法的一实施例处理的样本的微观组织结构变化。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本申请保护的范围。
请参阅图1，图1是本申请的病毒灭活方法的一实施例的流程示意图。
本申请一实施例提供了一种病毒灭活方法，包括如下步骤：
S101：以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液以获得灭活溶液。
以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液以获得灭活溶液。超临界流体的密度近于液体，粘度近于气体，扩散系数为液体的100倍，具有类似气体的扩散性及液体的溶解能力，同时兼具低黏度，低表面张力的特性，从而超临界流体能够迅速渗透进入微孔隙的物质，可以将灭活分子输送到需灭菌生物材料的任何位置，快速有效的进行病毒灭活。
在一实施例中，超临界流体包括超临界二氧化碳、超临界氨、超临界丙烷、超临界乙烯、超临界丙烯或超临界水。超临界流体可以杀灭孢子和灭活各种病毒。
在一实施例中，灭活液包括过氧乙酸、叔丁基过氧化氢、甲酸、过氧化氢、乙酸酐、辛酸、三氟乙酸、表面活性剂或醇类中的一种或多种。表面活性剂具体包括曲拉通(聚乙二醇对异辛基苯基醚)，在其他实施例中，还可以其他表面活性剂，此处不作限定。醇类具体包括甲醇和/或乙醇，在其他实施例中，还可以是其他醇类，此处不作限定。灭活液的选择基于生物材料的性质，可根据生物材料的不同选择最适合的灭活液。
S102：在预设条件下，利用灭活溶液对生物材料进行病毒灭活处理。
在预设条件下，利用灭活溶液对生物材料进行病毒灭活处理。灭活溶液为以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液而获得，从而灭活溶液具有超临界流体的性质，可以快速有效地对生物材料进行病毒灭活处理，同时不会对生物材料的分子结构和性能造成改变。
对某些热敏性的生物药物、制剂、材料或食品，用超临界流体溶解灭活液进行病毒灭活处理，可在较为温和的条件下作用，抑制酶活和灭菌，避免因高温消毒引起的不良影响。
在一实施例中，预设条件包括灭活处理时的压力范围、温度范围、相对湿度和/或灭活时间。其中，压力范围为2-20MPa，具体地，压力范围可以为2MPa、5MPa、11MPa、16MPa或者20MPa，此处不作限定。温度范围20-60℃，具体地，温度范围可以为20℃、30℃、40℃、50℃或60℃；相对湿度为30％-100％，具体地，相对湿度可以为30％、50％、65％或者100％；灭活时间为1-120分钟，具体地，灭火时间可以为1分钟、30分钟、60分钟、90分钟或者120分钟。
在一实施例中，生物材料包括动物源性血液制品、异体血液制品、异源生物制品(如补片、瓣膜、人造骨、肌腱、手术缝合线和血管等)、异种生物制品或疫苗制品。
在一实施例中，生物材料的状态为完全脱水干燥，从而生物材料所含的水分含量为最低状态，避免灭活溶液被生物材料中的水分稀释，且灭活溶液更易达到生物材料的各个缝隙中对生物材料进行病毒灭活，此时的生物材料在灭活溶液的灭活下具有更好的病毒灭活效果。当然，在其他实施例中，生物材料还可以是湿态或其他状态，灭活溶液也可以对生物材料起到病毒灭活效果。
请参阅图2，图2是本申请的病毒灭活方法的另一实施例的流程示意图。
本申请另一实施例提供了一种病毒灭活方法，包括如下步骤：
S201：以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液以获得灭活溶液。
以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液以获得灭活溶液。超临界流体的密度近于液体，粘度近于气体，扩散系数为液体的100倍，具有类似气体的扩散性及液体的溶解能力，同时兼具低黏度，低表面张力的特性，从而超临界流体能够迅速渗透进入微孔隙的物质，可以将灭活分子输送到需灭菌生物材料的任何位置，快速有效的进行病毒灭活。
本实施例的步骤S201与上述实施例中的对应步骤基本相同，除此之外，本实施例中的步骤S201还包括：
以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液以获得灭活溶液具体包括：
在容器中加入灭活液，并加入超临界流体混合，即可得到灭活溶液。当然，还可以在容器中加入灭活液和生物材料后，再加入超临界流体，此处不作限定。
S202：在预设条件下，利用灭活溶液对生物材料进行病毒灭活处理。
本实施例的步骤S202与上述实施例中的对应步骤基本相同，除此之外，本实施例中地步骤S202还包括：
利用灭活溶液，对生物材料进行病毒灭活处理包括：
将生物材料放置于容器内，向容器内添加灭活溶液，灭活溶液对生物材料进行病毒灭活处理。
具体地，可以将生物材料放置于容器中，向容器中加入灭活液，随后向容器内通入超临界流体，超临界流体将灭活液溶解后得到灭活溶液，灭活溶液在容器内扩散并对生物材料进行病毒灭活处理。
利用灭活溶液，对生物材料进行病毒灭活处理还包括：
对容器内的灭活溶液进行震荡、超声波、搅拌和/或内循环，从而可以加快灭活溶液的扩散和流动速度，从而加快对生物材料的病毒灭活效果，其中，进行内循环时，灭活溶液的循环流量控制为0.1-50L/min，例如0.1L/min、25L/min、50L/min，此处不作限定。
在预设条件下，利用灭活溶液对生物材料进行病毒灭活处理。灭活溶液为以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液获得，从而灭活溶液具有超临界流体的性质，可以快速有效地对生物材料进行病毒灭活处理，同时不会对生物材料的分子结构和性能造成改变。
在一实施例中，预设条件包括灭活处理时的压力范围、温度范围、相对湿度和/或灭活时间。其中，压力范围为2-20MPa，具体地，压力范围可以为2MPa、5MPa、11MPa、16MPa或者20MPa，此处不作限定。温度范围为20-60℃，具体地，温度范围可以为20℃、30℃、40℃、50℃或60℃；相对湿度为30％-100％，具体地，相对湿度可以为30％、50％、65％或者100％；灭活时间为1-120分钟，具体地，灭火时间可以为1分钟、30分钟、60分钟、90分钟或者120分钟。
进一步地，容器可以是密闭容器，从而可以减少灭活溶液的损耗，同时，灭活时的预设条件也更易调节和维持。
需要说明的是，单次灭活100g以下的生物材料时，需要10ml-10L的超临界流体和1ml-1000ml的灭活液，其中，灭活液的浓度为0.1％-30％。其中，超临界流体可以采用10ml、2L、5L、8L或者10L，灭活液可以选用1ml、200ml、500ml、800ml或者1000ml，灭活液的浓度可以为0.1％、5％、15％或者30％，此处不作限定。
以下将结合一具体实施方式说明：
实施例1：
1、称量已交联和去抗原的牛心包材料冻干品100g，使用双层特卫强透析袋封口包装，放置在一个镂空带盖的不锈钢篮中，并架在一个可密闭容器的搅拌桨正上方。
使用双层特卫强透析袋包装可在病毒灭活后方便收集生物材料，使用镂空带盖的不锈钢篮可以盛放生物材料，且便于灭活溶液的扩散和流动，搅拌桨可以转动加快超临界流体和灭活液的混合速率，以及灭活溶液的扩散和流动速率。
2、以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液以获得灭活溶液。
灭活液选用过氧乙酸、过氧化氢和无水乙醇，量取15％的过氧乙酸溶液100ml，30％过氧化氢溶液10ml，无水乙醇300ml，加入到可密闭容器中，然后将可密闭容器密封，并向可密闭容器内通入超临界二氧化碳8L。
其中，灭活液需要不浸没透析袋，从而灭活液可与超临界二氧化碳混合后得到灭活溶液，由灭活溶液对生物材料进行病毒灭活处理，处理更快速，作用条件更温和。
其中，加入超临界二氧化碳时，可以浸没透析袋或液面达到镂空不锈钢篮上方，从而混合得到的灭活溶液可以快速地对生物材料进行灭活处理。当然，基于超临界二氧化碳的性质，即使加入超临界二氧化碳时，未浸没透析袋或液面达到镂空不锈钢篮上方，灭活溶液也对生物材料有同样的病毒灭活效果。
3、预设条件下，利用灭活溶液对生物材料进行病毒灭活处理。
将温度范围设置为37℃，压力范围设置为10MPa，灭活处理时间设置为2h，搅拌转速设定为100rpm，开始病毒灭活工作，时间设置为2h，转速设定为100rpm，开始病毒灭活工作。
病毒灭活完成后，取出生物材料，超临界二氧化碳使用后回收或过滤可重复使用。
采用上述具体实施方式中的方法处理样本，且对样本处理前和处理后分别进行病毒没和效果和性能检测，具体检测结果如下：
1.病毒灭活效果：请参阅图3，图3是本申请的病毒灭活方法的一实施例处理的样本的猪细小病毒PPV的灭活动力学曲线。通过灭活动力学曲线可以看出，本申请的病毒灭活方法能在一小时内杀死4.9logs的猪细小病毒，本申请的病毒灭活方法效率高，灭活效果好。
2.样本病毒灭活前后热变性温度(DSC)结果如下表1：(单位℃)
表1：样本病毒灭活前后热变性温度
采用上述具体实施方式中的方法处理十组样本，由上述表1可以分析得出，病毒灭活前后生物材料热变性温度(DSC)结果没有差异，所以本申请的病毒灭活方法条件温和，不改变生物材料的热变形温度。
3.样本力学性能测试结果如下表3：
表3：样本病毒灭活前后力学性能检测数据
采用上述具体实施方式中的方法处理十四组样本，并计算均值，病毒灭活前后最大力增加了0.07N，P＞0.05，排除误差因素，结果基本一致；病毒灭活前后拉伸强度增大了8.53％，结果无统计学差异，所以本申请的病毒灭活方法条件温和，不改变生物材料的力学性能。
4.微观组织结构变化：
参阅图4，图4是本申请的病毒灭活方法的一实施例处理的样本的微观组织结构变化。
具体地，采用苏木精—伊红染色法(HE染色)，检测三组上述具体实施方式中病毒灭活方法处理前后的生物材料的微观组织结构的变化，通过对比可知，结果无明显差异。
本申请又一实施例提供了一种生物材料，生物材料经过上述任一实施例中的方法进行病毒灭活处理，从而生物材料携带的病毒被全部灭活，且生物材料的分子结构和性能没有改变。其中，生物材料包括动物源性血液制品、异体血液制品、异源生物制品(如补片、瓣膜、人造骨、肌腱、手术缝合线和血管等)、异种生物制品或疫苗制品。
以上所述仅为本申请的实施例，并非因此限制本申请的专利范围，凡是利用本申请说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本申请的专利保护范围内。
Claims (8)
1.一种病毒灭活方法，其特征在于，包括：
以超临界流体作为溶剂，混合溶解灭活液以获得灭活溶液；
在预设条件下，利用所述灭活溶液，对生物材料进行病毒灭活处理；
其中，利用所述灭活溶液，对生物材料进行病毒灭活处理包括：
将生物材料放置于容器内，向容器内添加所述灭活溶液，所述灭活溶液对所述生物材料进行病毒灭活处理；进行病毒灭活处理时，对所述容器内的所述灭活溶液进行振荡、超声波、搅拌和/或内循环，其中，进行所述内循环时，所述灭活溶液的循环流量控制为0.1-50L/min。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超临界流体包括超临界二氧化碳、超临界氨、超临界丙烷、超临界乙烯、超临界丙烯或超临界水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述灭活液包括过氧乙酸、叔丁基过氧化氢、甲酸、过氧化氢、乙酸酐、辛酸、三氟乙酸或醇类中的一种或多种。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述预设条件包括灭活处理时的压力范围、温度范围、相对湿度和/或灭活时间，其中，所述压力范围为2-20MPa，所述温度范围为20-60℃，所述相对湿度为30％-100％，所述灭活时间为1-120分钟。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，单次灭活100g以下的所述生物材料时，需要10ml-10L的所述超临界流体和1ml-1000ml的所述灭活液，其中，所述灭活液的浓度为0.1％-30％。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物材料包括动物源性血液制品或异种生物制品中的非血液制品。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物材料的状态为完全脱水干燥。
8.一种生物材料，其特征在于，所述生物材料经过权利要求1-7中任一项所述的方法进行病毒灭活处理。
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