CN115181226A - 一种小分子丝素蛋白基水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小分子丝素蛋白基水凝胶及其制备方法和应用,包括:将蚕丝脱胶、酶解后获的酶解后的丝素蛋白溶液进行透析,透析完成后,取中间层透析液进行冷冻干燥,获得小分子丝素蛋白粉末;取小分子丝素蛋白粉末经溶解、酰化及透析后,获得甲基丙烯酰化丝素蛋白;制备甲基丙烯酰化纤维素;利用甲基丙烯酰化丝素蛋白和甲基丙烯酰化纤维素,经光交联后喷涂氯化铁溶液后即获得小分子丝素蛋白基水凝胶。本发明的小分子丝素蛋白基水凝胶由蚕丝脱胶、水解而成的小分子丝素蛋白接枝甲基丙烯酸缩水甘油醚和高分子量羧甲基纤维素接枝光响应基团甲基丙烯酸酐制备而成,具有可快速止血、可注射、机械性能优异、能快速光响应交联、生物相容性高的优点。
Description
技术领域
本发明涉及生物材料技术领域,尤其涉及一种小分子丝素蛋白基水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
皮肤是人体最大的器官,它担负着抵御微生物的物理屏障、保持水分的温度调节、外部环境的感觉信息以及其他重要功能。皮肤损伤可由遗传性疾病、急性创伤、慢性创伤或复杂的手术引起。而在复杂的全层伤口中,表皮层、真皮层、汗腺、毛囊以及皮下脂肪组织均受损。伤口的大小阻碍了皮肤的关键功能,并可能导致并发症,如微生物感染、体内水电解质失衡,严重的情况可能危及生命。
丝素蛋白制得的水凝胶是三维空间的水合网络结构,含水率极高(>95%) ,具有较高的分子通透性和弹性,在皮肤创伤修复中有显著的优势。首先,可为细胞所需的氧气、营养成分及代谢产物提供交换场所;其次,作为最接近细胞外基质的微环境,有利于细胞迁移、生长和增殖;最后,环境湿润对新生肉芽组织无黏附作用,且易吸收坏死脱落的脓液和组织,减轻患者换药时的疼痛。现有的丝素蛋白止血材料,多采用胶原蛋白以及壳聚糖进行研制,并在快速止血性能方面存在缺陷。
此外,现有技术中制备高强度水凝胶的方法主要包括双网络水凝胶,纳米复合水凝胶,双交联水凝胶等等,但是,由于蚕丝是纤维状材料,现有技术中的制备方法使脱胶后的丝素蛋白存在分子量无法控制、结构不可控的技术问题,且由于丝素蛋白分子量较大,大分子丝素蛋白比小分子丝素蛋白肽链空间结构更加复杂,生物机体利用大分子丝素蛋白比较困难,所以只有当大分子丝素蛋白降解成为氨基酸时才利于人体吸收;而由小分子丝素蛋白水凝胶组成的生物材料其降解产物即为氨基酸,有利于细胞培养,但小分子丝素蛋白水凝胶的弹性模量较低。为了解决小分子丝素蛋白水凝胶的弹性模量较低的问题;例如公开号为CN113773456A的专利文献中公开了一种光固化双网络水凝胶的制备方法及其应用,也同样存在上述技术问题。同时,现有技术中也常常通过提高小分子水凝胶的浓度降低材料本身的含水量来提高力学强度。但是这种方法也存在缺陷,虽然提高了小分子水凝胶的含量,但含量过高难以溶解,当达到饱和浓度时,材料的力学强度不会再发生明显变化,所以这种方法其材料的力学强度其实并不可控。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种小分子丝素蛋白基水凝胶及其制备方法和应用,获得可快速交联、生物相容性高、快速止血和能修复皮肤损伤的可注射复合水凝胶材料。
第一方面,本发明提供一种小分子丝素蛋白基水凝胶的制备方法,具体包括以下步骤:
(1)取碎蚕丝置于碳酸钠溶液中煮沸后过滤,获得滤饼;将滤饼多次洗涤后进行烘干,获得丝素蛋白粉末;
(2)将步骤(1)中的丝素蛋白粉末溶解于溴化锂(LiBr)溶液中,在一定温度下使丝素蛋白溶解后过滤,获得丝素蛋白滤液;
(3)将步骤(2)中的丝素蛋白滤液中加入蛋白酶进行酶解,待酶解结束后高温灭酶,获得酶解后的丝素蛋白溶液;
(4)将步骤(3)中酶解后的丝素蛋白溶液灌入截留分子量为3500~5000Da的第一透析袋中;将灌有丝素蛋白溶液的第一透析袋装入截留分子量为500~800Da的第二透析袋中;在第一透析袋和第二透析袋之间形成的中间层内装入透析液;在一定温度下进行透析,每隔2-6h更换透析液直至透析完成;待透析完成后,取中间层透析液进行冷冻干燥,获得小分子丝素蛋白粉末;
(5)取步骤(4)中的小分子丝素蛋白粉末溶于去离子水中,配置成10~15%的水溶性小分子丝素蛋白溶液;在所述水溶性小分子丝素蛋白溶液中加入二甲基亚砜(DMSO)和三乙胺(TEA)进行反应一定时间后,再加入甲基丙烯酸缩水甘油醚进行反应,待反应结束后获得反应溶液;将所述反应溶液灌入截留分子量为500~2000da的透析袋内进行透析,透析完成后,将透析液冷冻干燥获得甲基丙烯酰化丝素蛋白;
(6)将羧甲基纤维素加入碳酸钠水溶液中,待羧甲基纤维素溶解于碳酸钠水溶液中后,获得羧甲基纤维素溶液;在所述羧甲基纤维素溶液中加入甲基丙烯酸酐和三乙胺进行反应形成反应体系,再向反应体系中加入N,N-二甲基甲酰胺,反应过程中每隔12h加入碳酸钠水溶液常温反应18-40h后,获得甲基丙烯酰化纤维素反应溶液;将所述甲基丙烯酰化纤维素反应溶液用去离子水在常温下透析后,将透析液冷冻干燥获得甲基丙烯酰化纤维素;
(7)在避光条件下,向DMEM培养基中加入引发剂,再加入步骤(5)中的甲基丙烯酰化丝素蛋白和步骤(6)中的甲基丙烯酰化纤维素,待溶解并混合均匀后进行过滤,获得混合滤液;将所述混合滤液滴置于培养皿中使用蓝光灯照射进行光固化,获得固化物;在所述固化物上喷涂氯化铁溶液后即获得小分子丝素蛋白基水凝胶。
由于采用上述方法,通过酶解所制得的小分子丝素蛋白其降解产物为氨基酸,无需加入溴化锂即可直接溶解于水(酶解后的丝素蛋白水凝胶可以将脱胶后大分子量的丝素蛋白酶解为小分子的,更易溶解于水),有利于细胞培养,具有更好的生物相容性。通过酶解后采用双层梯度透析的方法透析后得到的丝素蛋白水凝胶可获得截留的分子量,并且分子量可根据需要的临床条件可控。此外,获得的甲基丙烯酰化纤维素为光响应材料,可使聚合物前驱体水溶液原位交联,使产物几何形状易于控制。该水凝胶为可注射双光交联水凝胶,由蚕丝脱胶、水解而成的小分子丝素蛋白接枝甲基丙烯酸缩水甘油醚(GMA)和高分子量羧甲基纤维素接枝光响应基团甲基丙烯酸酐(MA)制备而成,喷涂氯化铁溶液后,在水凝胶进行Fe3+喷雾渗透形成角质层“盔甲”渗透进水凝胶;由于血液中的主要成分是蛋白质溶胶,其胶粒带有负电荷,胶体中加入了电解质使血液介稳性被破坏,可以使胶体发生聚沉,加入的氯化铁为电解质,Fe3+使胶体凝聚,生成的沉淀会堵塞伤口从而达到快速止血的效果。制备出的水凝胶具有快速交联、较好机械性能、组织黏附能力强、生物相容性好,同时具有止血和密封作用,形成皮肤损伤和外界环境的天然隔离层,防止有害微生物的侵扰。与传统的纱布等皮肤损伤敷料相比,该水凝胶由于含水量高、质地柔软,不会在更换时造成二次损伤,从而减轻患者的痛苦,患者的依从性相应提高。而且该水凝胶外观较为透明,有利于医生更直观的观察到患处的修复情况,提供更及时和精确的诊断。同时,本发明为共价双网络水凝胶,甲基丙烯酰化丝素蛋白和甲基丙烯酰化纤维素在lap存在的条件下由蓝光引发交联。
此外,由小分子水凝胶组成的生物材料其降解产物即为氨基酸,有利于细胞培养,通常这类小分子水凝胶具有更好的生物相容性。而且小分子水凝胶具有主动、优先、完整的形式被人体吸收、不需消化等优异特点,在皮肤损伤时能加速表皮的生成、促进皮肤损伤的愈合。同时小分子水凝胶可大批量生产、易于调控和引入明确的功能单元从而实现靶向性与对外界条件刺激的响应性、为小分子水凝胶在更多领域发挥作用带来了巨大的可能。
优选地,步骤(1)中所述碳酸钠溶液的摩尔浓度为0.01~0.02M;所述煮沸时间为10~45min;所述滤饼为经重复煮沸并过滤3~5次脱胶后获得;所述洗涤为采用去离子水洗涤3~6次;所述烘干的条件为于35~55℃烘干12~36h。
优选地,步骤(2)中所述溴化锂溶液的摩尔浓度为8.0~10.0M,溶解的温度为15~45℃。
优选地,步骤(3)中所述蛋白酶的加入量为丝素蛋白滤液总重量的1.2~2%;酶解条件为:PH值6~7、温度32~37℃;酶解时间为7~10h;所述高温灭酶的条件为升温到70~80℃,保温10~30min进行灭酶。
由于采用上述方法,蛋白酶的加入量或多或少及特定的酶解条件,都会影响小分子丝素蛋白的力学性能。
优选地,步骤(4)中所述第一透析袋的直径为2~3cm;所述第二透析袋的直径为5~7cm;所述透析液为去离子水,透析温度为4~8℃。
优选地,步骤(5)中所述小分子丝素蛋白粉末与二甲基亚砜的质量体积比为1:(7.5~10)g /mL;所述小分子丝素蛋白粉末与三乙胺的质量体积比为1:3g /mL;所述小分子丝素蛋白粉末与甲基丙烯酸缩水甘油醚的质量体积比为1:(2.0~4.0)g /mL;所述水溶性小分子丝素蛋白溶液与二甲基亚砜和三乙胺的反应时间为30min;加入甲基丙烯酸缩水甘油醚进行反应的反应时间为8~20h。
由于采用上述方法,由于小分子丝素蛋白粉末与甲基丙烯酸缩水甘油醚的质量体积比为1:(2.0~4.0)g /mL,使其具有较强的光响应行为;甲基丙烯酸缩水甘油醚的量或多或少,都会影响其光响应行为。
优选地,步骤(6)中所述碳酸钠水溶液的pH为8~10;所述羧甲基纤维素与碳酸钠水溶液的质量体积比为(5~20):1g/L;所述羧甲基纤维素在碳酸钠水溶液中溶解的条件为在30-55℃下进行溶解;所述羧甲基纤维素与甲基丙烯酸酐的质量体积比为1:(1~5)g/mL;所述羧甲基纤维素与三乙胺的质量体积比为1:(0.2~0.6)g/mL;所述N,N-二甲基甲酰胺与反应体系的体积比为(1~5):1ml/L;所述碳酸钠水溶液的浓度为0.2-1.0mmol/L。
优选地,步骤(7)中所述引发剂与DMEM培养基的质量体积比为1:(2.5~5)g/L;所述引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP);所述甲基丙烯酰化丝素蛋白的质量百分比浓度为10~50%;所述甲基丙烯酰化纤维素的质量百分比浓度为0.5~2%;所述过滤为采用0.22um-0.45um的过滤器进行过滤;所述蓝光灯照射的条件为照射时间20-40s、蓝光波长405-465nm。
由于采用上述方法,通过蓝光灯照射进行光交联制备的水凝胶具有可使聚合物前驱体水溶液原位交联、在室温或生理温度下快速聚合形成水凝胶、产物几何形状易于控制、原位聚合过程中产生较低的热量等优点。
第二方面,本发明提供上述制备方法制备获得小分子丝素蛋白基水凝胶。
第三方面,本发明提供制备获得小分子丝素蛋白基水凝胶在制备伤口敷料中的应用。可作为皮肤伤口敷料,用于非全层、全层、深层皮肤损伤、擦伤、划伤、褥疮以及糖尿病引发的糖尿病足溃疡等各种皮肤损伤。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1、本发明通过蚕丝水解而成的小分子丝素蛋白和高分子量的羧甲基纤维素钠,分别接枝光响应基团甲基丙烯酸缩水甘油醚(GMA)和甲基丙烯酸酐(MA)而得到快速光响应交联、生物相容性高的可注射复合水凝胶材料。制备出的小分子丝素蛋白基水凝胶可在皮肤损伤出现时快速吸收血液和组织渗出液,达到止血与隔离外界的效果;同时材料中含有的生物因子可以诱导细胞的迁移、增殖、分化等行为,促表皮化,加速皮肤损伤的愈合。
2、本发明以丝素蛋白、羧甲基纤维素钠为原料,接枝光响应基团甲基丙烯酸缩水甘油醚GMA和甲基丙烯酸酐MA,得到双光交联水凝胶。本发明将天然高分子材料进行改性使其具有光敏性,注射在皮肤损伤处后可以在对人体无害的蓝光光源下进行快速交联,其适应于皮肤损伤的形状并与组织形成紧密贴合,有利于细胞的迁移、增殖、分化等行为,更快取代材料部分修复皮肤损伤区域。本发明具有“自适应”的双光交联水凝胶与传统的皮肤损伤敷料相比提供一种新方向,进而开发更人性化的皮肤创伤治疗方法。
附图说明
图1 为本发明蚕丝脱胶效果图;
图2 为本发明甲基丙烯酰化丝素蛋白SEM图;
图3 为本发明甲基丙烯酰化丝素蛋白核磁氢谱图;
图4为本发明甲基丙烯酰化纤维素核磁氢谱图;
图5为本发明光交联前后对比图;
图6 为本发明铁离子渗透示意图;
图7为本发明生物相容性效果图;
图8为本发明光固化小分子丝素蛋白基水凝胶敷料的止血实验效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细说明,但本发明的保护范围并不限于所述内容。
实施例1
可快速止血、可注射的光固化小分子丝素蛋白基水凝胶的制备方法,具体包括以下步骤:
1.1甲基丙烯酰化丝素蛋白的制备:
(1)将死蛹剥除、蚕丝剪碎,配置0.01M的碳酸钠溶液,将剪碎的蚕丝置于碳酸钠溶液中煮沸45min后过滤,重复5次;用去离子水洗涤3次后55℃烘干12h,获得丝素蛋白粉末。
(2)将丝素蛋白粉末溶解于8.0M的LiBr溶液中,在15℃条件下使丝素蛋白溶解后进行过滤,获得丝素蛋白滤液。
(3)将丝素蛋白滤液中加入总重量1.2%的蛋白酶进行酶解,酶解的条件为PH值为6,温度32℃,时间为:7 h 。酶解结束后升温到70℃,保温30min灭酶,获得酶解后的丝素蛋白溶液。
(4)将酶解后的丝素蛋白溶液灌入截留分子量为3500-5000Da、直径为3cm的第一透析袋中,将第一透析袋装入截留分子量为500-800Da、直径为5cm的第二透析袋中;在第一透析袋和第二透析袋之间形成的中间层中装入去离子水。每隔4h更换去离子水,透析温度为5℃。透析完成后,取中间层透析液冷冻干燥,获得水溶性小分子丝素蛋白粉末。
(5)取1g水溶性小分子丝素蛋白粉末溶于去离子水中,配置成15%水溶性小分子丝素蛋白溶液,加入10ml的DMSO、3.0ml的TEA,反应30min后加入4.0ml的甲基丙烯酸缩水甘油醚,反应8h,用500-2000da透析袋透析,透析完成后,将透析液冷冻干燥获得甲基丙烯酰化丝素蛋白。
1.2甲基丙烯酰化纤维素的制备
将碳酸钠中加入去离子水中,配制成pH=8的碳酸钠水溶液;然后将20g羧甲基纤维素加至1L碳酸钠水溶液中,于30℃下搅拌溶解,得到羧甲基纤维素溶液;在羧甲基纤维素溶液中加入20mL甲基丙烯酸酐、8mL的三乙胺形成反应体系,按1L反应体系加入5 ml N,N-二甲基甲酰胺的比例加入N,N-二甲基甲酰胺,每隔12h加入1.0mmol/L的碳酸钠溶液,常温反应18h后,用去离子水在常温下透析、冷冻干燥得到甲基丙烯酰化纤维素。
1.3小分子丝素蛋白基水凝胶的制备
在避光条件下,在1g苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)中加入 2.5L的DMEM培养基进行混合;待溶解后,加入质量百分比浓度为10%甲基丙烯酰化丝素蛋白和质量百分比浓度为0.5%甲基丙烯酰化纤维素,使其完全溶解;用0.22um-0.45um过滤器过滤后,将混合滤液用移液枪滴置于培养皿中蓝光灯照射,照射时间为20s、蓝光波长405-465nm照射;照射完成后再加入氯化铁溶液,得到可快速止血、可注射的、机械性能优异、能快速光响应交联、生物相容性高的光固化小分子丝素蛋白基水凝胶。将光固化小分子丝素蛋白基水凝胶应用在制备伤口敷料中。通过将凝胶注射于猴子体内,实验表明该水凝胶无毒性。
实施例2
2.1甲基丙烯酰化丝素蛋白的制备:
(1)将死蛹剥除、蚕丝剪碎,配置0.02M的碳酸钠溶液,将剪碎的蚕丝置于碳酸钠溶液中煮沸10min,重复3次;去离子水洗涤6次后35℃烘干12h,获得丝素蛋白粉末。
(2)将丝素蛋白粉末溶解于10.0M的LiBr溶液中,在45℃条件下使丝素蛋白溶解后进行过滤,获得丝素蛋白滤液。
(3)将丝素蛋白滤液中加入总重量2.0%的蛋白酶进行酶解,酶解的条件为PH值为8,温度37℃,时间为:10 h。酶解结束后升温到80℃,保温10min灭酶,获得酶解后的丝素蛋白溶液。
(4)将酶解后的丝素蛋白溶液灌入截留分子量为3500-5000Da、直径为3cm的第一透析袋中,将第一透析袋装入截留分子量为500-800Da、直径为7cm的第二透析袋中;在第一透析袋和第二透析袋之间形成的中间层中装入去离子水。每隔6h更换去离子水,透析温度为8℃;透析完成后,取中间层透析液冷冻干燥,获得水溶性小分子丝素蛋白粉末。
(5)取1g水溶性小分子丝素蛋白粉末溶于去离子水中,配置成10%水溶性小分子丝素蛋白溶液,加入7.5ml的DMSO、3.0ml的TEA,反应30min后加入2.0ml的甲基丙烯酸缩水甘油醚,反应20h,用500-2000da透析袋透析,透析完成后,将透析液冷冻干燥获得甲基丙烯酰化丝素蛋白。
2.2甲基丙烯酰化纤维素的制备
将碳酸钠加入去离子水中,配制成pH=10的碳酸钠水溶液;然后按10g羧甲基纤维素加至1L碳酸钠水溶液中,于55℃下搅拌溶解,得到羧甲基纤维素溶液;在羧甲基纤维素溶液中加入20mL甲基丙烯酸酐、2mL的三乙胺形成反应体系;按1L反应体系加入1 ml N,N-二甲基甲酰胺的比例加入N,N-二甲基甲酰胺,每隔12h加入0.2mmol/L碳酸钠溶液,常温反应40h后,用去离子水在常温下透析、冷冻干燥得到甲基丙烯酰化纤维素;
2.3小分子丝素蛋白基水凝胶的制备
在避光条件下,在1g苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)中加入 5L的DMEM培养基进行混合;待溶解后,加入质量百分比浓度为50%的甲基丙烯酰化丝素蛋白和质量百分比浓度为2%的甲基丙烯酰化纤维素,使其完全溶解;用0.22um-0.45um过滤器过滤后,将混合液用移液枪滴置于培养皿中蓝光灯照射,时间为40s、蓝光波长405-465nm;照射完成后再加入氯化铁溶液,得到可快速止血、可注射的、机械性能优异、能快速光响应交联、生物相容性高的光固化小分子丝素蛋白基水凝胶。将光固化小分子丝素蛋白基水凝胶应用在制备伤口敷料中。通过将凝胶注射于猴子体内,实验表明该水凝胶无毒性。
实施例3
3.1甲基丙烯酰化丝素蛋白的制备:
(1)将死蛹剥除、蚕丝剪碎,配置0.01M的碳酸钠溶液,将剪碎的蚕丝置于碳酸钠溶液中煮沸30min,重复4次;用去离子水洗涤5次后45℃烘干25h。
(2)将丝素蛋白粉末溶解于9.0M的LiBr溶液中,在30℃条件下使丝素蛋白溶解后进行过滤,获得丝素蛋白滤液。
(3)将丝素蛋白滤液中加入总重量1.6%的蛋白酶进行酶解,酶解的条件为PH值为6,温度35℃,时间为:9h 。酶解结束后升温到75℃,保温20min灭酶获得酶解后的丝素蛋白溶液。
(4)将酶解后的丝素蛋白溶液灌入截留分子量为3500-5000Da、直径为2cm的第一透析袋中,将第一透析袋装入截留分子量为500-800Da、直径为5cm的第二透析袋中,在第一透析袋和第二透析袋之间形成的中间层中装入去离子水。每隔5h更换透析液,透析温度为6℃;透析完成后,取中间层透析液冷冻干燥,获得水溶性小分子丝素蛋白粉末。
(5)取1g水溶性小分子丝素蛋白溶于去离子水中,配置成13%的水溶性小分子丝素蛋白溶液,加入9ml的DMSO、3.0ml的TEA,反应30min后加入3ml的甲基丙烯酸缩水甘油醚,反应15h,用500-2000da透析袋透析完成后,将透析液冷冻干燥获得甲基丙烯酰化丝素蛋白。
本实施例烘干的脱丝胶丝素蛋白如图1所示,由图1可看出蚕壳已经完全脱胶。
本实施例甲基丙烯酰化丝素蛋白SEM如图2所示,由图2可看出甲基丙烯酰化丝素蛋白水凝胶是一种极亲水的三维网络结构凝胶,由高分子(相对分子质量比较大的分子,呈链状结构)在一定条件下互相连接,形成三维的空间网状结构。由于形成三维的空间网状结构使水凝胶能够模仿细胞外基质环境作为细胞移植的载体,促进细胞存活、增殖、分化和迁移,促进组织再生。
本实施例丝素蛋白、甲基丙烯酰化丝素蛋白核磁氢谱如图3所示,由图3可看出甲基丙烯酰基的新质子峰出现在6.1-5.4 ppm。由于甲基丙烯酰化丝素蛋白在6.1-5.4 ppm出现了新质子峰,表明光响应基团已接上,可以进行光固化。
3.2甲基丙烯酰化纤维素的制备
将碳酸钠加入去离子水中,配制成pH=9的碳酸钠水溶液;然后将5g的羧甲基纤维素加至1L碳酸钠水溶液中,于45℃下搅拌溶解,得到羧甲基纤维素溶液;在羧甲基纤维素溶液中加入20mL甲基丙烯酸酐、3mL的三乙胺形成反应体系;按1L反应体系加入3 ml N,N-二甲基甲酰胺的比例加入N,N-二甲基甲酰胺,每隔12h按0.6mmol/L碳酸钠,常温反应30h后,用去离子水在常温下透析、冷冻干燥得到甲基丙烯酰化纤维素。
甲基丙烯酰化纤维素核磁氢谱如图4所示,由图4可看出甲基丙烯酰基的新质子峰出现在6.1-5.4 ppm。由于甲基丙烯酰基的新质子峰出现在6.1-5.4 ppm,表明光响应基团已接上,可以进行光固化。
3.3小分子丝素蛋白基水凝胶的制备
在避光条件下,在1g苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(LAP)中加入 4L的DMEM培养基进行混合;待溶解后,加入质量百分比浓度为30%的甲基丙烯酰化丝素蛋白和质量百分比浓度为1.5%甲基丙烯酰化纤维素,使其完全溶解;用0.22um-0.45um过滤器过滤后,将混合液用移液枪滴置于培养皿中蓝光灯照射,照射时间为30s、蓝光波长405-465nm照射,加入氯化铁溶液,得到可快速止血、可注射的、机械性能优异、能快速光响应交联、生物相容性高的光固化小分子丝素蛋白基水凝胶。将光固化小分子丝素蛋白基水凝胶应用在制备伤口敷料中。通过将凝胶注射于猴子体内,实验表明该水凝胶无毒性。
蓝光灯照射结果如图5所示,由图5可看出光照射后水凝胶交联,表明水凝胶已经交联。
加入氯化铁溶液后,铁离子渗透示意图如图6所示,由图6可看出铁离子渗透进入水凝胶。
3.4光固化小分子丝素蛋白基水凝胶生物相容性实验:
采用体积分数为10%小牛血清的DMEM培养液制备出浸提液,将BMSCs细胞配制成细胞悬液(5 × 104个/mL),细胞接种于水凝胶上不同时间。然后,采用细胞活死染色(AM/PI)检测培养3天后细胞的存活情况,在激光共聚焦扫描显微镜下观察样品(CLSM,徕卡,日本)。由图7可看出光固化小分子丝素蛋白基水凝胶生物相容性良好。
3.5光固化小分子丝素蛋白基水凝胶敷料的止血实验:
实验方法:将每只实验鼠麻醉固定在手术台上,手术暴露股动脉并横向切开3/4,其自由喷血10秒钟后实验组使用快速止血的光固化小分子丝素蛋白基水凝胶敷料止血,试验过程中观察止血时间及失血量。
试验结果如图8所示,由图8可看出光固化小分子丝素蛋白基水凝胶止血效果良好。
Claims (10)
1.一种小分子丝素蛋白基水凝胶的制备方法,其特征在于,具体包括以下步骤:
(1)取碎蚕丝置于碳酸钠溶液中煮沸后过滤,获得滤饼;将滤饼多次洗涤后进行烘干,获得丝素蛋白粉末;
(2)将步骤(1)中的丝素蛋白粉末溶解于溴化锂溶液中,在一定温度下使丝素蛋白溶解后过滤,获得丝素蛋白滤液;
(3)将步骤(2)中的丝素蛋白滤液中加入蛋白酶进行酶解,待酶解结束后高温灭酶,获得酶解后的丝素蛋白溶液;
(4)将步骤(3)中酶解后的丝素蛋白溶液灌入截留分子量为3500~5000Da的第一透析袋中;将灌有丝素蛋白溶液的第一透析袋装入截留分子量为500~800Da的第二透析袋中;在第一透析袋和第二透析袋之间形成的中间层内装入透析液;在一定温度下进行透析,每隔2-6h更换透析液直至透析完成;待透析完成后,取中间层透析液进行冷冻干燥,获得小分子丝素蛋白粉末;
(5)取步骤(4)中的小分子丝素蛋白粉末溶于去离子水中,配置成10~15%的水溶性小分子丝素蛋白溶液;在所述水溶性小分子丝素蛋白溶液中加入二甲基亚砜和三乙胺进行反应一定时间后,再加入甲基丙烯酸缩水甘油醚进行反应,待反应结束后获得反应溶液;将所述反应溶液灌入截留分子量为500~2000da的透析袋内进行透析,透析完成后,将透析液冷冻干燥获得甲基丙烯酰化丝素蛋白;
(6)将羧甲基纤维素加入碳酸钠水溶液中,待羧甲基纤维素溶解与碳酸钠水溶液中后,获得羧甲基纤维素溶液;在所述羧甲基纤维素溶液中加入甲基丙烯酸酐和三乙胺进行反应形成反应体系,再向反应体系中加入N,N-二甲基甲酰胺,反应过程中每隔12h加入碳酸钠水溶液常温反应18-40h后,获得甲基丙烯酰化纤维素反应溶液;将所述甲基丙烯酰化纤维素反应溶液用去离子水在常温下透析后,将透析液冷冻干燥获得甲基丙烯酰化纤维素;
(7)在避光条件下,向DMEM培养基中加入引发剂,再加入步骤(5)中的甲基丙烯酰化丝素蛋白和步骤(6)中的甲基丙烯酰化纤维素,待溶解并混合均匀后进行过滤,获得混合滤液;将所述混合滤液滴置于培养皿中使用蓝光灯照射进行光固化,获得固化物;在所述固化物上喷涂氯化铁溶液后即获得小分子丝素蛋白基水凝胶。
2.根据权利要求1所述的小分子丝素蛋白基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述碳酸钠溶液的摩尔浓度为0.01~0.02M;所述煮沸时间为10~45min;所述滤饼为经重复煮沸并过滤3~5次脱胶后获得;所述洗涤为采用去离子水洗涤3~6次;所述烘干的条件为于35~55℃烘干12~36h。
3.根据权利要求1所述的小分子丝素蛋白基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述溴化锂溶液的摩尔浓度为8.0~10.0M,溶解的温度为15~45℃。
4.根据权利要求1所述的小分子丝素蛋白基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(3)中所述蛋白酶的加入量为丝素蛋白滤液总重量的1.2~2%;酶解条件为:PH值6~7、温度32~37℃;酶解时间为7~10h;所述高温灭酶的条件为升温到70~80℃,保温10~30min进行灭酶。
5.根据权利要求1所述的小分子丝素蛋白基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(4)中所述第一透析袋的直径为2~3cm;所述第二透析袋的直径为5~7cm;所述透析液为去离子水,透析温度为4~8℃。
6.根据权利要求1所述的小分子丝素蛋白基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(5)中所述小分子丝素蛋白粉末与二甲基亚砜的质量体积比为1:(7.5~10)g / mL;所述小分子丝素蛋白粉末与三乙胺的质量体积比为1:3g /mL;所述小分子丝素蛋白粉末与甲基丙烯酸缩水甘油醚的质量体积比为1:(2.0~4.0)g /mL;所述水溶性小分子丝素蛋白溶液与二甲基亚砜和三乙胺的反应时间为30min;加入甲基丙烯酸缩水甘油醚进行反应的反应时间为8~20h。
7.根据权利要求1所述的小分子丝素蛋白基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(6)中所述碳酸钠水溶液的pH为8~10;所述羧甲基纤维素与碳酸钠水溶液的质量体积比为(5~20):1g/L;所述羧甲基纤维素在碳酸钠水溶液中溶解的条件为在30-55℃下进行溶解;所述羧甲基纤维素与甲基丙烯酸酐的质量体积比为1:(1~5)g/mL;所述羧甲基纤维素与三乙胺的质量体积比为1:(0.2~0.6)g/mL;所述N,N-二甲基甲酰胺与反应体系的体积比为(1~5):1ml/L;所述碳酸钠水溶液的浓度为0.2-1.0mmol/L。
8.根据权利要求1所述的小分子丝素蛋白基水凝胶的制备方法,其特征在于,步骤(7)中所述引发剂与DMEM培养基的质量体积比为1:(2.5~5)g/L;所述引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂;所述甲基丙烯酰化丝素蛋白的质量百分比浓度为10~50%;所述甲基丙烯酰化纤维素的质量百分比浓度为0.5~2%;所述过滤为采用0.22um-0.45um的过滤器进行过滤;所述蓝光灯照射的条件为照射时间20-40s、蓝光波长405-465nm。
9.根据权利要求1-8任一项所述的制备方法制备的小分子丝素蛋白基水凝胶。
10.根据权利要求9所述的小分子丝素蛋白基水凝胶在制备伤口敷料中的应用。
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