CN114075339A - 一种光固化3d打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，该水凝胶以透明质酸和丝素蛋白为原料，对透明质酸和丝素蛋白改性后分别得到透明质酸‑甲基丙烯酸酯和丝素蛋白‑甲基丙烯酸酯，以一定比例混合透明质酸‑甲基丙烯酸酯溶液和丝素蛋白‑甲基丙烯酸酯溶液得到前驱液，通过光固化3D打印技术构建水凝胶，利用甲醇溶液或乙醇溶液处理改善了其降解性。本发明结合了丝素蛋白和透明质酸的优异特性，通过控制透明质酸‑甲基丙烯酸酯和丝素蛋白‑甲基丙烯酸酯预聚物溶液的混合比例以及甲醇或乙醇处理，使水凝胶具有良好的生物相容性以及可调节的降解性。
Description
技术领域
本发明属于水凝胶技术领域，具体涉及一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法。
背景技术
透明质酸(HA)因其出色的生物相容性和生物安全性而广泛用于生物医学领域。此外，通过共价交联形成HA网络的HA水凝胶不仅在整形外科领域，而且在组织工程领域也经常使用。尽管如此，常规的HA水凝胶在进一步的应用中仍存在一些局限性，HA水凝胶的物理化学性质控制受到纯HA分子的限制，出现低细胞粘附，粘弹性特性以及HA水凝胶的快速降解等致命缺陷。
丝素蛋白(SF)是一种从蚕茧中获得的纤维蛋白。迄今，许多研究已展示了基于SF材料在生物医学领域优良性能。SF和SF衍生物水凝胶通过化学交联不仅容易形成网络结构，而且由于其富含酪氨酸的结构和规则重复的甘氨酸-丙氨酸序列而容易形成β-折叠。不同的交联方法使水凝胶许多物理性质和功能在加工中易于控制。因此，SF经常与其他生物相容性聚合物杂交以形成水凝胶。同样，SF杂合的HA水凝胶也显示出可观的性能，例如，增强的机械性能和减缓降解速度等。
面前大多数通过酶交联、醇溶液诱导等方法制备丝素蛋白复合凝胶，尚未通过光交联方法进行丝素蛋白与透明质酸复合凝胶的制备。光交联是一种快速温和的交联方式，光引发剂能够吸收光能，进而使光反应性官能团交联。结合3D打印技术，解决现有技术存在的制备速度低、精度低等问题。
水凝胶制造中的光交联在生物医学应用中为水凝胶网络的时空控制提供了很大的优势。通过甲基丙烯酸酯部分的光聚合制备了具有甲基丙烯酸酯官能化的HA和SF的杂化水凝胶，经过甲醇溶液或乙醇溶液处理后可以改变其降解性。
发明内容
本发明的目的在于针对上述问题，提出了一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，本发明结合了丝素蛋白和透明质酸的优异特性，通过控制透明质酸-甲基丙烯酸酯和丝素蛋白-甲基丙烯酸酯预聚物溶液的混合比例以及乙醇处理，使水凝胶具有良好的生物相容性以及可调节的降解性。
本申请的具体技术方案为：
一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，所述水凝胶以透明质酸和丝素蛋白为原料，对透明质酸和丝素蛋白改性后分别得到透明质酸-甲基丙烯酸酯和丝素蛋白-甲基丙烯酸酯，以一定比例混合透明质酸-甲基丙烯酸酯溶液和丝素蛋白-甲基丙烯酸酯溶液得到前驱液，利用甲基丙烯酸酯部分的光聚合反应实现物理交联，通过光固化3D打印技术构建水凝胶，利用甲醇溶液或乙醇溶液处理得到生物兼容丝素蛋白水凝胶。
上述光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、打印原料的制备；
(1)、丝素蛋白的制备：
将蚕茧除去丝胶，然后洗涤干燥得到脱胶茧，将脱胶茧在溴化锂溶液中加热搅拌至完全溶解，然后水解，经透析后，将丝素蛋白溶液离心除去不溶的聚集体，离心，冻干得到丝素蛋白，备用；
(2)、透明质酸-甲基丙烯酸酯的制备：
将透明质酸溶于去离子水中，超声后冻干，将超声处理后的透明质酸配置成透明质酸溶液，并且将甲基丙烯酸酐添加至透明质酸溶液中，将pH调节至8-9，在4℃的黑暗中搅拌均匀，用醇洗沉淀后，将产物重新溶解在去离子水中，经透析后，冻干得到透明质酸-甲基丙烯酸酯，储存在4℃下备用；
(3)、丝素蛋白-甲基丙烯酸酯的制备：
将(1)得到的丝素蛋白在含有氯化锂的无水二甲基亚砜中加热搅拌至完全溶解得到丝素蛋白溶液中，然后，将甲基丙烯酸异氰基乙酯直接加入到丝素蛋白溶液中，并在氮气环境下搅拌均匀，加入10倍以上体积的去离子水停止反应得到丝素蛋白-甲基丙烯酸酯溶液，经透析后，将丝素蛋白-甲基丙烯酸酯溶液离心除去不溶性聚集体，然后进行冻干得到丝素蛋白-甲基丙烯酸酯，备用；
S2、光固化3D打印前驱液的配置：
将步骤S1中，(2)得到的透明质酸-甲基丙烯酸酯和(3)得到的丝素蛋白-甲基丙烯酸酯分别溶解在磷酸盐缓冲液中，以特定的体积比混合透明质酸-甲基丙烯酸酯溶液和丝素蛋白-甲基丙烯酸酯溶液得到前驱液；
S3、水凝胶光固化3D打印及后处理：
将S2得到的前驱液加入3D打印机的配料箱中，设定配料箱和升降平台温度恒定，调整升降平台位置，调试紫外光照射距离和照射时间后开始打印；打印结束后，在室温环境中用乙醇溶液处理，最后用磷酸盐缓冲液清洗以去除残留乙醇，得到一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶。
上述光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，步骤S1的(1)中，将蚕茧在油酸钠和碳酸钠的混合溶液中煮沸1小时以除去丝胶，所述油酸钠和碳酸钠的混合溶液由油酸钠、碳酸钠溶液以体积比为1：0.8-1.2混合得到，所述油酸钠、碳酸钠溶液的质量浓度分别为0.3％w/v和0.2％w/v；
干燥温度为60℃-80℃，溶解温度为60℃-80℃；
水解采用氢氧化钠溶液水解在60℃-80℃下进行12h，溴化锂溶液和氢氧化钠溶液的浓度分别为9.3mol/l和0.6mol/l，所述脱胶茧、溴化锂溶液和氢氧化钠溶液的比例为1g：5mL：1-1.1mL；
透析使用的醋酸纤维素透析管对去离子水进行渗析3-5天。
上述光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，步骤S1的(2)中，超声处理前后去离子水透明质酸溶液浓度均为0.9-1.1wt％，透明质酸和甲基丙烯酸酐用量的比例为1g：4.5-5ml；
pH调节采用氢氧化钠溶液；醇洗采用乙醇或甲醇清洗；
透析使用的醋酸纤维素透析管对去离子水进行渗析3-5天。
上述光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，步骤S1的(3)中，含有氯化锂的无水二甲基亚砜的配制方法为将氯化锂粉末加入二甲基亚砜中，搅拌至完全溶解，配置成的氯化锂溶液浓度为0.8-1.2mol/l；溶解温度为60℃-80℃；丝素蛋白溶液浓度为1wt％，丝素蛋白和甲基丙烯酸2-异氰酸根合乙酯的比例为1g：4.5-5ml；
透析使用的醋酸纤维素透析管对去离子水进行渗析3-5天。
上述光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，步骤S2中，所述磷酸盐缓冲液包含苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂，将苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂粉末加入PBS缓冲液，搅拌至完全溶解即得；透明质酸-甲基丙烯酸酯溶液、丝素蛋白-甲基丙烯酸酯溶液、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂的磷酸盐缓冲液浓度分别为：0.5-0.6wt％、9-11wt％、0.8-1.2mmol/l。
上述光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，步骤S2中，透明质酸-甲基丙烯酸酯溶液和丝素蛋白-甲基丙烯酸酯溶液混合体积比例为：100-0：0-100，透明质酸-甲基丙烯酸酯溶液体积逐渐降低时，丝素蛋白-甲基丙烯酸酯溶液体积逐渐增大。
上述光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，步骤S3中，配料箱维度为28-30℃，平台温度为4-8℃。
上述光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，步骤S3中，UV照射强度为10-60mW，UV波长为360-380nm，UV光照时间为5-10min，扫描厚度为0.1-0.2mm，紫外光照射距离为1-5cm。
上述光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，步骤S3中，乙醇溶液浓度为70-90w/v％，处理时间为2h-4h。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
(1)本发明所用材料为透明质酸和丝素蛋白两种天然可再生高分子，其来源广泛易获取，具有很好的生物相容性，为医学领域提供了全新的材料选择；
(2)利用甲基丙烯酸酯部分的光聚合及光固化3D技术制备具有甲基丙烯酸酯官能化的丝素蛋白/透明质酸水凝胶结构稳定，能够在短时间内凝胶固化，能够通过剪应力发生凝胶-溶胶的可逆变化，具有可注射能力；
(3)丝素蛋白/透明质酸水凝胶经乙醇处理后，丝素蛋白结构域形成β-折叠结构，从而在丝素蛋白/透明质酸水凝胶中形成双网络，极大地改善了水凝胶地力学性能，并且使水凝胶的降解性可调。
附图说明
图1为本发明光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶过程示意图。
图2为实施例4生物兼容丝素蛋白水凝胶实际图。
图3为水凝胶酶解处理残余质量比随酶解时间的变化关系图，其中，(a)图为HA、SF和实施例1得到HA/SF水凝胶的酶解处理变化图；(b)图为HA、SF和对比例1得到的HA/SF水凝胶的酶解处理变化图。
具体实施方式
下面结合附图1-3以及实施例，对本发明作进一步地详细说明，但本发明的实施方式不限于此。需要说明的是本发明中SF表示丝素蛋白，HA表示透明质酸，SFMA表示丝素蛋白-甲基丙烯酸酯，HAMA表示透明质酸-甲基丙烯酸酯。
下述实施例一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，图1为光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶过程示意图，水凝胶以透明质酸和丝素蛋白为原料，利用甲基丙烯酸酯部分的光聚合反应实现物理交联，通过光固化3D打印技术构建水凝胶，利用乙醇溶液处理得到生物兼容丝素蛋白水凝胶。
实施例1
本实施例提供的一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、打印原料的制备；
S11、丝素蛋白(SF)的制备：将蚕茧在质量浓度为0.3％w/v油酸钠和0.2％w/v碳酸钠溶液中煮沸1小时以除去丝胶，然后洗涤并干燥，在80℃下将10g脱胶茧溶解在50ml9.3mol/l的溴化锂溶液中30分钟得到SF溶液，随后，将10ml 0.6mol/l的氧化钠溶液直接添加至SF溶液在80℃下水解12h，然后使用醋酸纤维素透析管对去离子水进行渗析3天，透析后，将SF溶液以15000g离心20分钟以除去不溶的聚集体，然后进行冻干；
S12、透明质酸-甲基丙烯酸酯(HAMA)的制备：将透明质酸(HA)溶于去离子水中配制成质量百分比为1wt％的溶液，超声处理30分钟后冻干，在圆底烧瓶中，将1g超声处理后的HA配置成1wt％的去离子水溶液，并且将4.8ml甲基丙烯酸酐缓慢地添加至HA溶液，用6mol/l的氢氧化钠溶液将pH调节至8-9，在4℃的黑暗中轻轻搅拌18h，用乙醇清洗后，将产物重新溶解在去离子水中，置于醋酸纤维素试管，渗析3天，最后将HAMA溶液冻干并储存在4℃下备用；
S13、丝素蛋白-甲基丙烯酸酯(SFMA)的制备：将水解的1gSF在60℃的条件下溶于含有1mol/l的氯化锂的无水二甲基亚砜中，配制成1wt％的溶液。然后，将4.8ml甲基丙烯酸异氰基乙酯直接加入到SF溶液中，并在氮气环境下搅拌5小时，加入10倍体积的去离子水停止反应，并使用醋酸纤维素试管将溶液对去离子水进行透析3天，透析后，将SFMA溶液以15000g离心20分钟以除去不溶性聚集体，最后在4℃下冷冻干燥，备用；
S2、光固化3D打印前驱液的配置：将HAMA和SFMA分别溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，分别配制成0.6wt％和10wt％的溶液，缓冲液中包含浓度为1mol/l的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂(LAP)，混合HAMA和SFMA溶液，体积比为95:5；
S3、水凝胶光固化3D打印及后处理：将前驱液加入3D打印机的配料箱中，设定配料箱温度29℃和升降平台温度6℃，调整升降平台位置，使其位于前驱液一个扫描厚度以下，扫描厚度0.1mm，调整紫外灯参数为UV光波长365nm，强度50mW，照射时间5min，紫外线照射距离为1cm，打印结束后，在37℃环境中用75％乙醇溶液处理，最后用PBS缓冲液清洗以去除残留乙醇，得到一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶。
实施例2
本实施例提供的一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、打印原料的制备；
S11、丝素蛋白(SF)的制备：将蚕茧在0.3％w/v油酸钠和0.2％w/v碳酸钠溶液中煮沸1小时以除去丝胶，然后洗涤并干燥。在80℃下将10g脱胶茧溶解在50ml 9.3mol/l的溴化锂溶液中30分钟。随后，将10ml 0.6mol/l的氧化钠溶液直接添加至SF溶液。水解在80℃下进行12h，然后使用醋酸纤维素透析管对去离子水进行渗析3天。透析后，将SF溶液以15000g离心20分钟以除去不溶的聚集体，然后进行冻干；
S12、透明质酸-甲基丙烯酸酯(HAMA)的制备：将透明质酸(HA)溶于去离子水中配制成1wt％的溶液，超声处理30分钟后冻干。在圆底烧瓶中，将1g超声处理后的HA配置成1wt％的去离子水溶液，并且将4.8ml甲基丙烯酸酐缓慢地添加至HA溶液。用6mol/l的氢氧化钠溶液将pH调节至8–9，在4℃的黑暗中轻轻搅拌18h。用乙醇清洗后，将产物重新溶解在去离子水中，置于醋酸纤维素试管，渗析3天。最后将HAMA溶液冻干并储存在4℃下备用；
S13、丝素蛋白-甲基丙烯酸酯(SFMA)的制备：将水解的1gSF在60℃的条件下溶于含有1mol/l的氯化锂的无水二甲基亚砜中，配制成1wt％的溶液。然后，将4.8ml甲基丙烯酸异氰基乙酯直接加入到SF溶液中，并在氮气环境下搅拌5小时。加入10倍体积的去离子水停止反应，并使用醋酸纤维素试管将溶液对去离子水进行透析3天。透析后，将SFMA溶液以15000g离心20分钟以除去不溶性聚集体。最后在4℃下冷冻干燥，备用；
S2、光固化3D打印前驱液的配置：将HAMA和SFMA分别溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，分别配制成0.6wt％和10wt％的溶液，缓冲液中包含浓度为1mol/l的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂(LAP)。混合HAMA和SFMA溶液，体积比为9:1；
S3、水凝胶光固化3D打印及后处理：将前驱液加入3D打印机的配料箱中，设定配料箱温度29℃和升降平台温度6℃，调整升降平台位置，使其位于前驱液一个扫描厚度以下，扫描厚度0.1mm；调整紫外灯参数为UV光波长365nm，强度50mW，照射时间5min，紫外线照射距离为1cm，；打印结束后，在37℃环境中用75％乙醇溶液处理；最后用PBS缓冲液清洗以去除残留乙醇，得到一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶。
实施例3
本实施例提供的一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、打印原料的制备；
S11、丝素蛋白(SF)的制备：将蚕茧在0.3％w/v油酸钠和0.2％w/v碳酸钠溶液中煮沸1小时以除去丝胶，然后洗涤并干燥。在80℃下将10g脱胶茧溶解在50ml 9.3mol/l的溴化锂溶液中30分钟。随后，将10ml 0.6mol/l的氧化钠溶液直接添加至SF溶液。水解在80℃下进行12h，然后使用醋酸纤维素透析管对去离子水进行渗析3天。透析后，将SF溶液以15000g离心20分钟以除去不溶的聚集体，然后进行冻干；
S12、透明质酸-甲基丙烯酸酯(HAMA)的制备：将透明质酸(HA)溶于去离子水中配制成1wt％的溶液，超声处理30分钟后冻干。在圆底烧瓶中，将1g超声处理后的HA配置成1wt％的去离子水溶液，并且将4.8ml甲基丙烯酸酐缓慢地添加至HA溶液。用6mol/l的氢氧化钠溶液将pH调节至8–9，在4℃的黑暗中轻轻搅拌18h。用乙醇清洗后，将产物重新溶解在去离子水中，置于醋酸纤维素试管，渗析3天。最后将HAMA溶液冻干并储存在4℃下备用；
S13、丝素蛋白-甲基丙烯酸酯(SFMA)的制备：将水解的1gSF在60℃的条件下溶于含有1mol/l的氯化锂的无水二甲基亚砜中，配制成1wt％的溶液。然后，将4.8ml甲基丙烯酸异氰基乙酯直接加入到SF溶液中，并在氮气环境下搅拌5小时。加入10倍体积的去离子水停止反应，并使用醋酸纤维素试管将溶液对去离子水进行透析3天。透析后，将SFMA溶液以15000g离心20分钟以除去不溶性聚集体。最后在4℃下冷冻干燥，备用；
S2、光固化3D打印前驱液的配置：将HAMA和SFMA分别溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，分别配制成0.6wt％和10wt％的溶液，缓冲液中包含浓度为1mol/l的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂(LAP)。混合HAMA和SFMA溶液，体积比例为7:3；
S3、水凝胶光固化3D打印及后处理：将前驱液加入3D打印机的配料箱中，设定配料箱温度29℃和升降平台温度6℃，调整升降平台位置，使其位于前驱液一个扫描厚度以下，扫描厚度0.1mm；调整紫外灯参数为UV光波长365nm，强度50mW，照射时间5min，紫外线照射距离为1cm，；打印结束后，在37℃环境中用75％乙醇溶液处理；最后用PBS缓冲液清洗以去除残留乙醇，得到一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶。
实施例4
本实施例提供的一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、打印原料的制备；
S11、丝素蛋白(SF)的制备：将蚕茧在0.3％w/v油酸钠和0.2％w/v碳酸钠溶液中煮沸1小时以除去丝胶，然后洗涤并干燥。在80℃下将10g脱胶茧溶解在50ml 9.3mol/l的溴化锂溶液中30分钟。随后，将10ml 0.6mol/l的氧化钠溶液直接添加至SF溶液。水解在80℃下进行12h，然后使用醋酸纤维素透析管对去离子水进行渗析3天。透析后，将SF溶液以15000g离心20分钟以除去不溶的聚集体，然后进行冻干；
S12、透明质酸-甲基丙烯酸酯(HAMA)的制备：将透明质酸(HA)溶于去离子水中配制成1wt％的溶液，超声处理30分钟后冻干。在圆底烧瓶中，将1g超声处理后的HA配置成1wt％的去离子水溶液，并且将4.8ml甲基丙烯酸酐缓慢地添加至HA溶液。用6mol/l的氢氧化钠溶液将pH调节至8–9，在4℃的黑暗中轻轻搅拌18h。用乙醇清洗后，将产物重新溶解在去离子水中，置于醋酸纤维素试管，渗析3天。最后将HAMA溶液冻干并储存在4℃下备用；
S13、丝素蛋白-甲基丙烯酸酯(SFMA)的制备：将水解的1gSF在60℃的条件下溶于含有1mol/l的氯化锂的无水二甲基亚砜中，配制成1wt％的溶液。然后，将4.8ml甲基丙烯酸异氰基乙酯直接加入到SF溶液中，并在氮气环境下搅拌5小时。加入10倍体积的去离子水停止反应，并使用醋酸纤维素试管将溶液对去离子水进行透析3天。透析后，将SFMA溶液以15000g离心20分钟以除去不溶性聚集体。最后在4℃下冷冻干燥，备用；
S2、光固化3D打印前驱液的配置：将HAMA和SFMA分别溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，分别配制成0.6wt％和10wt％的溶液，缓冲液中包含浓度为1mol/l的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂(LAP)。混合HAMA和SFMA溶液，体积比为1:1；
S3、水凝胶光固化3D打印及后处理：将前驱液加入3D打印机的配料箱中，设定配料箱温度29℃和升降平台温度6℃，调整升降平台位置，使其位于前驱液一个扫描厚度以下，扫描厚度0.1mm；调整紫外灯参数为UV光波长365nm，强度50mW，照射时间5min，紫外线照射距离为1cm；打印结束后，在37℃环境中用75％乙醇溶液处理；最后用PBS缓冲液清洗以去除残留乙醇，得到一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶，如图2所示，为实施例4生物兼容丝素蛋白水凝胶实际图。
实施例5
本实施例提供的一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、打印原料的制备；
S11、丝素蛋白(SF)的制备：将蚕茧在0.3％w/v油酸钠和0.2％w/v碳酸钠溶液中煮沸1小时以除去丝胶，然后洗涤并干燥。在80℃下将10g脱胶茧溶解在50ml 9.3mol/l的溴化锂溶液中30分钟。随后，将10ml 0.6mol/l的氧化钠溶液直接添加至SF溶液。水解在80℃下进行12h，然后使用醋酸纤维素透析管对去离子水进行渗析3天。透析后，将SF溶液以15000g离心20分钟以除去不溶的聚集体，然后进行冻干；
S12、透明质酸-甲基丙烯酸酯(HAMA)的制备：将透明质酸(HA)溶于去离子水中配制成1wt％的溶液，超声处理30分钟后冻干。在圆底烧瓶中，将1g超声处理后的HA配置成1wt％的去离子水溶液，并且将4.8ml甲基丙烯酸酐缓慢地添加至HA溶液。用6mol/l的氢氧化钠溶液将pH调节至8–9，在4℃的黑暗中轻轻搅拌18h。用乙醇清洗后，将产物重新溶解在去离子水中，置于醋酸纤维素试管，渗析3天。最后将HAMA溶液冻干并储存在4℃下备用；
S13、丝素蛋白-甲基丙烯酸酯(SFMA)的制备：将水解的1gSF在60℃的条件下溶于含有1mol/l的氯化锂的无水二甲基亚砜中，配制成1wt％的溶液。然后，将4.8ml甲基丙烯酸异氰基乙酯直接加入到SF溶液中，并在氮气环境下搅拌5小时。加入10倍体积的去离子水停止反应，并使用醋酸纤维素试管将溶液对去离子水进行透析3天。透析后，将SFMA溶液以15000g离心20分钟以除去不溶性聚集体。最后在4℃下冷冻干燥，备用；
S2、光固化3D打印前驱液的配置：将HAMA和SFMA分别溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，分别配制成0.6wt％和10wt％的溶液，缓冲液中包含浓度为1mol/l的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂(LAP)。混合HAMA和SFMA溶液，体积比为1:1；
S3、水凝胶光固化3D打印及后处理：将前驱液加入3D打印机的配料箱中，设定配料箱温度29℃和升降平台温度6℃，调整升降平台位置，使其位于前驱液一个扫描厚度以下，扫描厚度0.2mm；调整紫外灯参数为UV光波长365nm，强度50mW，照射时间10min，紫外线照射距离为3cm，；打印结束后，在37℃环境中用75％乙醇溶液处理；最后用PBS缓冲液清洗以去除残留乙醇，得到一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶。
实施例6
本实施例提供的一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、打印原料的制备；
S11、丝素蛋白(SF)的制备：将蚕茧在0.3％w/v油酸钠和0.2％w/v碳酸钠溶液中煮沸1小时以除去丝胶，然后洗涤并干燥。在80℃下将10g脱胶茧溶解在50ml 9.3mol/l的溴化锂溶液中30分钟。随后，将10ml 0.6mol/l的氧化钠溶液直接添加至SF溶液。水解在80℃下进行12h，然后使用醋酸纤维素透析管对去离子水进行渗析3天。透析后，将SF溶液以15000g离心20分钟以除去不溶的聚集体，然后进行冻干；
S12、透明质酸-甲基丙烯酸酯(HAMA)的制备：将透明质酸(HA)溶于去离子水中配制成1wt％的溶液，超声处理30分钟后冻干。在圆底烧瓶中，将1g超声处理后的HA配置成1wt％的去离子水溶液，并且将4.8ml甲基丙烯酸酐缓慢地添加至HA溶液。用6mol/l的氢氧化钠溶液将pH调节至8–9，在4℃的黑暗中轻轻搅拌18h。用乙醇清洗后，将产物重新溶解在去离子水中，置于醋酸纤维素试管，渗析3天。最后将HAMA溶液冻干并储存在4℃下备用；
S13、丝素蛋白-甲基丙烯酸酯(SFMA)的制备：将水解的1gSF在60℃的条件下溶于含有1mol/l的氯化锂的无水二甲基亚砜中，配制成1wt％的溶液。然后，将4.8ml甲基丙烯酸异氰基乙酯直接加入到SF溶液中，并在氮气环境下搅拌5小时。加入10倍体积的去离子水停止反应，并使用醋酸纤维素试管将溶液对去离子水进行透析3天。透析后，将SFMA溶液以15000g离心20分钟以除去不溶性聚集体。最后在4℃下冷冻干燥，备用；
S2、光固化3D打印前驱液的配置：将HAMA和SFMA分别溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，分别配制成0.6wt％和10wt％的溶液，缓冲液中包含浓度为1mol/l的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂(LAP)。混合HAMA和SFMA溶液，体积比为1:1；
S3、水凝胶光固化3D打印及后处理：将前驱液加入3D打印机的配料箱中，设定配料箱温度29℃和升降平台温度6℃，调整升降平台位置，使其位于前驱液一个扫描厚度以下，扫描厚度0.15mm；调整紫外灯参数为UV光波长365nm，强度50mW，照射时间8min，紫外线照射距离为2cm，；打印结束后，在37℃环境中用75％乙醇溶液处理；最后用PBS缓冲液清洗以去除残留乙醇，得到一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶。
对比例1
本对比例提供的一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
S1、打印原料的制备；
S11、丝素蛋白(SF)的制备：将蚕茧在0.3％w/v油酸钠和0.2％w/v碳酸钠溶液中煮沸1小时以除去丝胶，然后洗涤并干燥。在80℃下将10g脱胶茧溶解在50ml 9.3mol/l的溴化锂溶液中30分钟。随后，将10ml 0.6mol/l的氧化钠溶液直接添加至SF溶液。水解在80℃下进行12h，然后使用醋酸纤维素透析管对去离子水进行渗析3天。透析后，将SF溶液以15000g离心20分钟以除去不溶的聚集体，然后进行冻干；
S12、透明质酸-甲基丙烯酸酯(HAMA)的制备：将透明质酸(HA)溶于去离子水中配制成1wt％的溶液，超声处理30分钟后冻干。在圆底烧瓶中，将1g超声处理后的HA配置成1wt％的去离子水溶液，并且将4.8ml甲基丙烯酸酐缓慢地添加至HA溶液。用6mol/l的氢氧化钠溶液将pH调节至8–9，在4℃的黑暗中轻轻搅拌18h。用乙醇清洗后，将产物重新溶解在去离子水中，置于醋酸纤维素试管，渗析3天。最后将HAMA溶液冻干并储存在4℃下备用；
S13、丝素蛋白-甲基丙烯酸酯(SFMA)的制备：将水解的1gSF在60℃的条件下溶于含有1mol/l的氯化锂的无水二甲基亚砜中，配制成1wt％的溶液。然后，将4.8ml甲基丙烯酸2-异氰酸根合乙酯直接加入到SF溶液中，并在氮气环境下搅拌5小时。加入10倍体积的去离子水停止反应，并使用醋酸纤维素试管将溶液对去离子水进行透析3天。透析后，将SFMA溶液以15000g离心20分钟以除去不溶性聚集体。最后在4℃下冷冻干燥，备用；
S2、光固化3D打印前驱液的配置：将HAMA和SFMA分别溶解在磷酸盐缓冲液(PBS)中，分别配制成0.6wt％和10wt％的溶液，缓冲液中包含浓度为1mol/l的苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂(LAP)。然后，混合HAMA和SFMA溶液，体积比为1:1；
S3、水凝胶光固化3D打印及后处理：将前驱液加入3D打印机的配料箱中，设定配料箱温度29℃和升降平台温度6℃，调整升降平台位置，使其位于前驱液一个扫描厚度以下，扫描厚度1mm；调整紫外灯参数为UV光波长365nm，强度50mW，照射时间5min；打印结束后，在37℃环境中用PBS缓冲液清洗，出去未固化前驱液，最终得到一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶。
酶解实验：
图3为水凝胶酶解处理残余质量比随酶解时间的变化图，其中，(a)图为HA、SF和实施例1得到HA/SF水凝胶的酶解处理变化图；(b)图为HA、SF和对比例1得到的HA/SF水凝胶的酶解处理变化图。
具体酶解实验过程：取PBS缓冲液200ml，将透明质酸酶粉末加入PBS溶液，配置浓度为10-12U/ml的酶溶液。
HA、SF和HA/SF水凝胶各取20g-25g，混合并加入配置好的酶溶液中孵育，酶溶液的质量为HA、SF和HA/SF水凝胶总质量的三倍，(a)图中的酶解实验，HA、SF和HA/SF水凝胶均未进行乙醇处理，(b)图中的酶解实验，HA、SF和HA/SF水凝胶均进行乙醇处理，乙醇处理指的是在37℃环境中用75％乙醇溶液处理，最后用PBS缓冲液清洗以去除残留乙醇，每过10h检测溶液中各物质残余质量比。
实验结论：
对于未乙醇处理的水凝胶，HA/SF水凝胶的残留质量比迅速降低，至20h后无法检测出含量，并且随着HA/SF水凝胶酶解，分解出的SFMA的甲基丙烯酸酯的酯键发生水解，产生SF，从而使SF残余质量升高。
对于乙醇处理的水凝胶，HA/SF水凝胶残余质量在80h的孵育中并没有明显变化，而纯SF水凝胶与未处理的基本相同。这意味着乙醇处理使HA/SF水凝胶能够抵抗酶促降解，从而使HA/SF水凝胶的降解性变得可控。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (10)
1.一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，所述水凝胶以透明质酸和丝素蛋白为原料，对透明质酸和丝素蛋白改性后分别得到透明质酸-甲基丙烯酸酯和丝素蛋白-甲基丙烯酸酯，以一定比例混合透明质酸-甲基丙烯酸酯溶液和丝素蛋白-甲基丙烯酸酯溶液得到前驱液，通过光固化3D打印技术构建水凝胶，利用甲醇溶液或乙醇溶液处理得到生物兼容丝素蛋白水凝胶。
2.根据权利要求1所述的光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、打印原料的制备；
(1)、丝素蛋白的制备：
将蚕茧除去丝胶，然后洗涤干燥得到脱胶茧，将脱胶茧在溴化锂溶液中加热搅拌至完全溶解，然后水解，经透析后，离心，冻干得到丝素蛋白，备用；
(2)、透明质酸-甲基丙烯酸酯的制备：
将透明质酸溶于去离子水中配置成透明质酸溶液，并且将甲基丙烯酸酐添加至透明质酸溶液中，将pH调节至8-9，在4℃的黑暗中搅拌均匀，醇洗沉淀后，将产物溶解在去离子水中，经透析后，冻干得到透明质酸-甲基丙烯酸酯，备用；
(3)、丝素蛋白-甲基丙烯酸酯的制备：
将(1)得到的丝素蛋白在含有氯化锂的无水二甲基亚砜中加热搅拌至完全溶解得到丝素蛋白溶液，然后，将甲基丙烯酸异氰基乙酯加入到丝素蛋白溶液中，并在氮气环境下搅拌均匀，加入10倍以上体积的去离子水停止反应得到丝素蛋白-甲基丙烯酸酯溶液，经透析后，离心，冻干得到丝素蛋白-甲基丙烯酸酯，备用；
S2、光固化3D打印前驱液的配置：
将步骤S1中，(2)得到的透明质酸-甲基丙烯酸酯和(3)得到的丝素蛋白-甲基丙烯酸酯分别溶解在磷酸盐缓冲液中，混合透明质酸-甲基丙烯酸酯溶液和丝素蛋白-甲基丙烯酸酯溶液得到前驱液；
S3、水凝胶光固化3D打印及后处理：
将S2得到的前驱液加入3D打印机的配料箱中，设定配料箱和升降平台温度恒定，调整升降平台位置，调试紫外光照射距离和照射时间后开始打印；打印结束后，在室温环境中用乙醇溶液处理，最后用磷酸盐缓冲液清洗以去除残留乙醇，得到一种光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶。
3.根据权利要求2所述的光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S1的(1)中，蚕茧除去丝胶的方法为：将蚕茧在油酸钠和碳酸钠的混合溶液中煮沸除去丝胶，所述油酸钠和碳酸钠的混合溶液由油酸钠、碳酸钠溶液以体积比为1：0.8-1.2混合得到，所述油酸钠、碳酸钠溶液的质量浓度分别为0.3％w/v和0.2％w/v；
干燥温度为60℃-80℃，溶解温度为60℃-80℃；
水解采用氢氧化钠溶液在60℃-80℃下进行12h，溴化锂溶液和氢氧化钠溶液的浓度分别为9.3mol/l和0.6mol/l，所述脱胶茧、溴化锂溶液和氢氧化钠溶液的比例为1g：5mL：1-1.1mL；
透析使用的醋酸纤维素透析管进行渗析3-5天。
4.根据权利要求2所述的光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S1的(2)中，透明质酸溶液浓度为0.9-1.1wt％，透明质酸和甲基丙烯酸酐用量的比例为1g：4.5-5ml；pH调节采用氢氧化钠溶液；醇洗采用乙醇或甲醇清洗；
透析使用的醋酸纤维素透析管对去离子水进行渗析3-5天，得到的透明质酸-甲基丙烯酸酯储存在4℃下备用。
5.根据权利要求2所述的光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S1的(3)中，含有氯化锂的无水二甲基亚砜的配制方法为将氯化锂粉末加入二甲基亚砜中，搅拌至完全溶解，配置成的氯化锂溶液浓度为0.8-1.2mol/l；溶解温度为60℃-80℃；丝素蛋白溶液浓度为1wt％，丝素蛋白和甲基丙烯酸2-异氰酸根合乙酯的比例为1g：4.5-5ml；
透析使用的醋酸纤维素透析管进行渗析3-5天。
6.根据权利要求2所述的光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述磷酸盐缓冲液包含苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂，将苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂粉末加入磷酸盐缓冲液，搅拌至完全溶解即得；透明质酸-甲基丙烯酸酯溶液、丝素蛋白-甲基丙烯酸酯溶液、苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰磷酸锂的磷酸盐缓冲液浓度分别为：0.5-0.6wt％、9-11wt％、0.8-1.2mmol/l。
7.根据权利要求2所述的光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S2中，透明质酸-甲基丙烯酸酯溶液和丝素蛋白-甲基丙烯酸酯溶液混合体积比例为：100-0：0-100。
8.根据权利要求2所述的光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S3中，配料箱维度为28-30℃，平台温度为4-8℃。
9.根据权利要求2所述的光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S3中，UV照射强度为10-60mW，UV波长为360-380nm，UV光照时间为5-10min，扫描厚度为0.1-0.2mm，紫外光照射距离为1-5cm。
10.根据权利要求2所述的光固化3D打印生物兼容丝素蛋白水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤S3中，乙醇溶液浓度为70-90w/v％，处理时间为2h-4h。
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