KR102473363B1 - 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 제조방법 및 이에 따른 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 - Google Patents
스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 제조방법 및 이에 따른 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102473363B1 KR102473363B1 KR1020200120269A KR20200120269A KR102473363B1 KR 102473363 B1 KR102473363 B1 KR 102473363B1 KR 1020200120269 A KR1020200120269 A KR 1020200120269A KR 20200120269 A KR20200120269 A KR 20200120269A KR 102473363 B1 KR102473363 B1 KR 102473363B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- gelatin
- solution
- hydrogel
- concentration
- spray
- Prior art date
Links
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 title claims abstract description 147
- 239000007921 spray Substances 0.000 title claims description 18
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 title claims description 17
- 238000000576 coating method Methods 0.000 title claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 3
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims abstract description 46
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 12
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 126
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 126
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 124
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 124
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 124
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 68
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 64
- DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N Tyramine Natural products NCCC1=CC=C(O)C=C1 DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 50
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 26
- 229960003732 tyramine Drugs 0.000 claims description 24
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 23
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 18
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims description 12
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 12
- 238000005507 spraying Methods 0.000 claims description 11
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 10
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims description 9
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 9
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 8
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 7
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 7
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 7
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 7
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 7
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 6
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 6
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 6
- 239000006260 foam Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 4
- 238000011049 filling Methods 0.000 claims description 4
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 claims description 4
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 claims description 2
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 claims description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 2
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 241000218691 Cupressaceae Species 0.000 claims description 2
- ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N D-erythro-ascorbic acid Natural products OCC1OC(=O)C(O)=C1O ZZZCUOFIHGPKAK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims description 2
- 229920001612 Hydroxyethyl starch Polymers 0.000 claims description 2
- 240000003553 Leptospermum scoparium Species 0.000 claims description 2
- 235000016887 Leptospermum scoparium Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000002789 Panax ginseng Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000082204 Phyllostachys viridis Species 0.000 claims description 2
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 claims description 2
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 claims description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 claims description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 2
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 claims description 2
- 229930003268 Vitamin C Natural products 0.000 claims description 2
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 claims description 2
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims description 2
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 claims description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229960002713 calcium chloride Drugs 0.000 claims description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 229940045110 chitosan Drugs 0.000 claims description 2
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 claims description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims description 2
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000020710 ginseng extract Nutrition 0.000 claims description 2
- 229940050526 hydroxyethylstarch Drugs 0.000 claims description 2
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 claims description 2
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 2
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 claims description 2
- 235000019154 vitamin C Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011718 vitamin C Substances 0.000 claims description 2
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 claims description 2
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 claims description 2
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-O tyraminium Chemical compound [NH3+]CCC1=CC=C(O)C=C1 DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 4
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 claims 1
- 229940032147 starch Drugs 0.000 claims 1
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 abstract description 63
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 63
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 abstract description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 abstract description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 12
- 230000036560 skin regeneration Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 34
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 33
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 25
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 20
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 19
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 19
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 18
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 14
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 13
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 11
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 11
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 10
- -1 poly(hydroxyethyl methacrylate) Polymers 0.000 description 10
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004504 adult stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 4
- 238000007490 hematoxylin and eosin (H&E) staining Methods 0.000 description 4
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 3
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 3
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 3
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 3
- KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-2-[5-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]ethanone Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)C(CC=1OC(=NN=1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F)=O KZEVSDGEBAJOTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005160 1H NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- SXAMGRAIZSSWIH-UHFFFAOYSA-N 2-[3-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,2,4-oxadiazol-5-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NOC(=N1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 SXAMGRAIZSSWIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)pyrimidin-5-yl]-1,3,4-oxadiazol-2-yl]-1-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)ethanone Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C1=NN=C(O1)CC(=O)N1CC2=C(CC1)NN=N2 YJLUBHOZZTYQIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)-1-[4-[2-[[3-(trifluoromethoxy)phenyl]methylamino]pyrimidin-5-yl]piperazin-1-yl]propan-1-one Chemical compound N1N=NC=2CN(CCC=21)CCC(=O)N1CCN(CC1)C=1C=NC(=NC=1)NCC1=CC(=CC=C1)OC(F)(F)F YLZOPXRUQYQQID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N Arg-Gly-Asp Chemical group NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O IYMAXBFPHPZYIK-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000012422 Collagen Type I Human genes 0.000 description 2
- 108010022452 Collagen Type I Proteins 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 2
- 239000006147 Glasgow's Minimal Essential Medium Substances 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N Heavy water Chemical compound [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 2
- 210000004700 fetal blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003020 moisturizing effect Effects 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N phenol group Chemical group C1(=CC=CC=C1)O ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920002338 polyhydroxyethylmethacrylate Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 1-ethenylpyrrolidin-2-one;molecular iodine Chemical compound II.C=CN1CCCC1=O CPKVUHPKYQGHMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 3-(dimethylamino)propyliminomethylidene-ethylazanium;chloride Chemical compound Cl.CCN=C=NCCCN(C)C FPQQSJJWHUJYPU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BGWLYQZDNFIFRX-UHFFFAOYSA-N 5-[3-[2-[3-(3,8-diamino-6-phenylphenanthridin-5-ium-5-yl)propylamino]ethylamino]propyl]-6-phenylphenanthridin-5-ium-3,8-diamine;dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].C=1C(N)=CC=C(C2=CC=C(N)C=C2[N+]=2CCCNCCNCCC[N+]=3C4=CC(N)=CC=C4C4=CC=C(N)C=C4C=3C=3C=CC=CC=3)C=1C=2C1=CC=CC=C1 BGWLYQZDNFIFRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010011985 Decubitus ulcer Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 108010080379 Fibrin Tissue Adhesive Proteins 0.000 description 1
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 description 1
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 229920000153 Povidone-iodine Polymers 0.000 description 1
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 208000031737 Tissue Adhesions Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010306 acid treatment Methods 0.000 description 1
- 230000001919 adrenal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 1
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 1
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 108010072041 arginyl-glycyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- VVAVKBBTPWYADW-RVTJCSDESA-L biebrich scarlet Chemical compound [Na+].[Na+].OC1=CC=C2C=CC=CC2=C1\N=N\C(C(=C1)S([O-])(=O)=O)=CC=C1\N=N\C1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1 VVAVKBBTPWYADW-RVTJCSDESA-L 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N calcein am Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(C)=O)=C(OC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CN(CC(=O)OCOC(C)=O)CC(=O)OCOC(=O)C)C(OC(C)=O)=C1 BQRGNLJZBFXNCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000003508 chemical denaturation Methods 0.000 description 1
- PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N chemotactic peptide Chemical compound CSCC[C@H](NC=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000385 dialysis solution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 238000011978 dissolution method Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001671 embryonic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000006011 modification reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001087 myotubule Anatomy 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000005036 nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000009965 odorless effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000036407 pain Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 229960001621 povidone-iodine Drugs 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000002407 reforming Methods 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 230000006903 response to temperature Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229940069575 rompun Drugs 0.000 description 1
- 230000037390 scarring Effects 0.000 description 1
- 230000037380 skin damage Effects 0.000 description 1
- 210000000329 smooth muscle myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000013222 sprague-dawley male rat Methods 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009281 ultraviolet germicidal irradiation Methods 0.000 description 1
- 210000001364 upper extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XOSXWYQMOYSSKB-LDKJGXKFSA-L water blue Chemical compound CC1=CC(/C(\C(C=C2)=CC=C2NC(C=C2)=CC=C2S([O-])(=O)=O)=C(\C=C2)/C=C/C\2=N\C(C=C2)=CC=C2S([O-])(=O)=O)=CC(S(O)(=O)=O)=C1N.[Na+].[Na+] XOSXWYQMOYSSKB-LDKJGXKFSA-L 0.000 description 1
- 239000013585 weight reducing agent Substances 0.000 description 1
- QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N xylazine hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 QYEFBJRXKKSABU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
- A61L26/0061—Use of materials characterised by their function or physical properties
- A61L26/008—Hydrogels or hydrocolloids
-
- A61F13/00012—
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61F—FILTERS IMPLANTABLE INTO BLOOD VESSELS; PROSTHESES; DEVICES PROVIDING PATENCY TO, OR PREVENTING COLLAPSING OF, TUBULAR STRUCTURES OF THE BODY, e.g. STENTS; ORTHOPAEDIC, NURSING OR CONTRACEPTIVE DEVICES; FOMENTATION; TREATMENT OR PROTECTION OF EYES OR EARS; BANDAGES, DRESSINGS OR ABSORBENT PADS; FIRST-AID KITS
- A61F13/00—Bandages or dressings; Absorbent pads
- A61F13/01—Non-adhesive bandages or dressings
- A61F13/01008—Non-adhesive bandages or dressings characterised by the material
- A61F13/01012—Non-adhesive bandages or dressings characterised by the material being made of natural material, e.g. cellulose-, protein-, collagen-based
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
- A61L26/0009—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form containing macromolecular materials
- A61L26/0028—Polypeptides; Proteins; Degradation products thereof
- A61L26/0038—Gelatin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
- A61L26/0057—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
- A61L26/0061—Use of materials characterised by their function or physical properties
- A61L26/0066—Medicaments; Biocides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
- A61L26/0061—Use of materials characterised by their function or physical properties
- A61L26/0076—Sprayable compositions
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L2300/00—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices
- A61L2300/20—Biologically active materials used in bandages, wound dressings, absorbent pads or medical devices containing or releasing organic materials
- A61L2300/252—Polypeptides, proteins, e.g. glycoproteins, lipoproteins, cytokines
- A61L2300/254—Enzymes, proenzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dispersion Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Abstract
본 발명은 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 제조방법 및 이에 따른 스프레이형 하이드로젤 창상피복제에 관한 것으로, 보다 상세하게는 효소촉매 가교반응을 진행하여 뛰어난 생체 적합성과 우수한 창상 치유 능력 및 피부 재생 능력을 제공하는 기술에 대하여 언급하고자 한다.
Description
본 발명은 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 제조방법 및 이에 따른 스프레이형 하이드로젤 창상피복제에 관한 것이다. 보다 상세하게는 효소촉매 가교반응을 진행하여 뛰어난 생체 적합성과 우수한 창상 치유 능력 및 피부 재생 능력을 제공하는 기술에 대하여 언급하고자 한다.
창상 피복제라함은 창상, 외상 욕창 등 피부 손상을 치유하기 위하여 습윤 환경 유지, 상처 부위 보호, 삼출물의 흡수, 흉터 억제, 상처 회복 촉진 등의 효능을 가지는 의료용 제재이다. 이들은 배양피부와는 달리 면역 반응에 대한 문제가 전혀 없고, 손쉽게 손상 피부에 적용이 가능하다는 장점이 있다. 통상적으로 사용되는 창상 피복용 드레싱제로는 가장 간단한 형태인 보습 거즈를 포함하여 폼형, 반투과성 필름형, 하이드로젤형 등 다양한 형태로 제품화되어 사용되고 있으며, 상처의 깊이와 분비물의 양에 따라 그에 맞는 드레싱제가 적용되고 있다.
다만, 보습 거즈와 폼형, 하이드로젤형 드레싱제는 상처 부위에서 탈착 가능성이 있어 이를 방지하기 위한 2차 드레싱이 요구되는 반면 반투과성 필름형, 하이드로 콜로이드형 드레싱제의 경우 접착성이 있어 2차 드레싱이 필요 없으나, 상처의 분비물이 많은 경우 사용이 제한된다는 특징이 있다.
그럼에도 하이드로젤형의 경우, 하이드로젤형의 경우 신축성이 뛰어나고, 거즈, 폼형 창상피복제보다 접착성이 높다는 장점을 지닌다. 또한, 창상에서 방출되는 삼출물을 흡수하며 치유하기에 적합한 습윤 환경을 장시간 유지할 수 있으며, 사용 중 교체를 하더라도 재생된 피부조직을 손상시키거나 통증을 유발하지 않는다. 따라서, 최근에는 우수한 습윤환경 조성능력과 창상 치유능력을 제공하는 하이드로젤형의 드레싱제에 대한 연구가 활발한 실정이다.
하이드로젤은 친수성 고분자 사슬이 가교 결합을 이루어 3차원 망상구조를 갖고 고분자 고체 내에 물을 머금고 있는 형태를 띤다. 사슬간의 가교 결합으로 인해 하이드로젤은 물에서 용해되지 않으며, 친수성과 망상구조로 인해 매우 높은 흡수성을 가진다. 하이드로젤의 분류는 이온성, 구성성분, 가교 방식, 반응 매개, 기계적 특성 5가지 요소를 통해 구분하며, 특히, 구성성분, 반응 매개에 따라 하이드로젤의 종류를 분류한다.
하이드로젤을 구성하는 성분은 크게 천연고분자, 합성고분자, 하이브리드 3가지이며, 천연고분자로는 젤라틴, 실크피브로인, 엘라스틴, 알긴산, 콜라겐 등이 주로 사용되고, 합성고분자로는 poly(hydroxyethyl methacrylate)(PHEMA), poly(vinyl alcohol)(PVA), poly(ethylene glycol)(PEG), poly(acrylic acid)(PAA), polyacrylamide(PAAM)등이 사용되며, 천연고분자와 합성고분자를 블렌딩하거나 공중합하여, 하이브리드 형태로 사용되고 있다.
나아가, 최근에는 공개특허 10-2013-0119994, 공개특허 10-2021-0025918와 같이 그 밖의 다양한 소재를 이용하여 하이드로젤을 연구하여 그 영역을 확장해가고 있다. 이러한 연구의 일환으로 본 발명은 천연고분자인 젤라틴을 활용하고, 생화학적 매개체인 효소를 통한 가교 반응을 진행하여 하이드로젤을 제조한 뒤 이를 조직 공학용 스프레이형 창상피복제에 적용하고자 한다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술의 문제점과 기술적 과제를 해결하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 생체적합성이 뛰어난 젤라틴 표면을 티라민으로 개질시키고, 이를 효소 촉매 반응을 이용하여 하이드로젤 창상피복제로 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적은 이액형 스프레이에 사용하여, 분무와 동시에 용액들을 혼합 가교하여 더 빠른 가교 속도와 함께 다양한 형태의 하이드로젤 창상 피복제를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적은 생체적합성이 뛰어나며, 우수한 창상 치유 능력을 제공하고, 우수한 피부재생 능력을 갖는 하이드로젤을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적은 스프레이형 창상 피복제를 사람은 물론 동물에게도 적용을 가능케 하여 넓은 활용도를 제공하는 것에 있다.
상기한 바와 같은 본 발명의 목적을 달성하고, 후술하는 본 발명의 특징적인 효과를 실현하기 위한, 본 발명의 특징적인 구성은 하기와 같다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, (a) 개선된 젤라틴을 제조하는 단계; (b) 상기 개선된 젤라틴을 용매에 용해시켜, 개선된 젤라틴 용액을 제조하는 단계; (c) 상기 개선된 젤라틴 용액과 효소촉매를 혼합한 용액 A, 상기 개선된 젤라틴 용액과 촉매 기질을 혼합한 용액 B를 각각 제조하는 단계; 및 (d) 이액형 스프레이에 상기 용액 A와 상기 용액 B를 독립적으로 충진한 후, 믹싱 노즐을 이용하여 분무와 동시에 용액들을 혼합 가교시켜 하이드로젤 창상 피복제를 제조하는 단계;를 포함하는 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르며, 상기 제조방법에 따라 제조된 스프레이형 하이드로젤 창상피복제가 제공된다.
본 발명에 따른 하이드로젤 창상피복제 제조방법은 이액형 스프레이에 사용하여, 분무와 동시에 용액들을 혼합 가교하여 더 빠른 가교속도와 다양한 형태로 적용할 수 있는 장점이 있다. 또한, 기존의 하이드로젤 창상 피복제에 비하여 다루기 쉬운 장점이 있다.
본 발명에 따른 하이드로젤 창상피복제는 생체적합성이 뛰어나며, 우수한 창상 치유 능력을 제공하고, 탁월한 피부재생 능력을 제공한다. 또한, 천연 고분자를 포함하여 생체 안정성 및 접합성이 우수한 효과를 제공한다.
또한, 본 발명에 따른 하이드로젤 창상피복제는 사람은 물론 동물에도 적용이 가능하여, 광범위한 활용도를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 이액형 스프레이를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 티라민 치환율(%)에 따른 proton nuclear magnetic resonance(1H-NMR) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 Gel-Tyr 농도에 따른 하이드로젤화 시간을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 HRP 농도에 따른 하이드로젤화 시간을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 H2O2 농도에 따른 하이드로젤화 시간을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 Gel-Tyr 농도에 따른 swelling ratio를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 HRP 농도에 따른 swelling ratio를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 Gel-Tyr의 농도에 따른 storage modulus를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 HRP 농도에 따른 storage modulus를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 생분해거동 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 Gel-Tyr 농도에 따른 세포독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 HRP 농도에 따른 세포독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 H2O2 농도에 따른 세포독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 HRP의 농도에 따른 Live/Dead 염색을 통한 세포성장거동 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 SD rat 창상치유능 평가를 나타낸 것이다.
도 16은 대조군(멸균된 거즈)의 SD rat 창상치유능 평가를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤과 대조군(멸균된 거즈)의 창상 감소율을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤과 대조군(멸균된 거즈)의 H&E staining에 대한 1주 후 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤과 대조군(멸균된 거즈)의 H&E staining에 대한 2주 후 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤과 대조군(멸균된 거즈)의 Masson's trichrome staining에 대한 1주 후 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤과 대조군(멸균된 거즈)의 Masson's trichrome staining에 대한 2주 후 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 티라민 치환율(%)에 따른 proton nuclear magnetic resonance(1H-NMR) 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 Gel-Tyr 농도에 따른 하이드로젤화 시간을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 HRP 농도에 따른 하이드로젤화 시간을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 H2O2 농도에 따른 하이드로젤화 시간을 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 Gel-Tyr 농도에 따른 swelling ratio를 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 HRP 농도에 따른 swelling ratio를 나타낸 것이다.
도 8은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 Gel-Tyr의 농도에 따른 storage modulus를 나타낸 것이다.
도 9는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 HRP 농도에 따른 storage modulus를 나타낸 것이다.
도 10은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 생분해거동 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 Gel-Tyr 농도에 따른 세포독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 12는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 HRP 농도에 따른 세포독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 H2O2 농도에 따른 세포독성 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 HRP의 농도에 따른 Live/Dead 염색을 통한 세포성장거동 평가 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤의 SD rat 창상치유능 평가를 나타낸 것이다.
도 16은 대조군(멸균된 거즈)의 SD rat 창상치유능 평가를 나타낸 것이다.
도 17은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤과 대조군(멸균된 거즈)의 창상 감소율을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤과 대조군(멸균된 거즈)의 H&E staining에 대한 1주 후 결과를 나타낸 것이다.
도 19는 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤과 대조군(멸균된 거즈)의 H&E staining에 대한 2주 후 결과를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤과 대조군(멸균된 거즈)의 Masson's trichrome staining에 대한 1주 후 결과를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명에 따른 젤라틴 하이드로젤과 대조군(멸균된 거즈)의 Masson's trichrome staining에 대한 2주 후 결과를 나타낸 것이다.
후술하는 본 발명에 대한 상세한 설명은, 본 발명이 실시될 수 있는 특정 실시예를 예시로서 도시하는 첨부 도면을 참조한다. 이들 실시예는 당업자가 본 발명을 실시할 수 있기에 충분하도록 상세히 설명된다. 본 발명의 다양한 실시예는 서로 다르지만 상호 배타적일 필요는 없음이 이해되어야 한다. 예를 들어, 여기에 기재되어 있는 특정 형상, 구조 및 특성은 일 실시예에 관련하여 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 다른 실시예로 구현될 수 있다. 또한, 각각의 개시된 실시예 내의 개별 구성요소의 위치 또는 배치는 본 발명의 정신 및 범위를 벗어나지 않으면서 변경될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 후술하는 상세한 설명은 한정적인 의미로서 취하려는 것이 아니며, 본 발명의 범위는, 적절하게 설명된다면, 그 청구항들이 주장하는 것과 균등한 모든 범위와 더불어 첨부된 청구항에 의해서만 한정된다. 도면에서 유사한 참조부호는 여러 측면에 걸쳐서 동일하거나 유사한 기능을 지칭한다.
이하, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 첨부된 도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다.
젤라틴은 동물 체내로부터 얻은 콜라겐에서 추출해낸 천연 고분자로써 콜라겐의 삼중 나선 사슬을 분해하여 단일 사슬로 얻은 것이다. 젤라틴은 무취, 무색, 반투명한 형태의 물질로 생분해성, 생체적합성, 비면역성 단백질 고분자이다. 건조 환경에서는 잘 부서지고 습윤 환경에서는 탄성적인 성질을 띤다. 젤라틴은 비가역적으로 가수분해된 콜라겐 형태이며, 여기서 가수 분해는 단백질 피브릴을 더 작은 펩타이드로 분해시키고 물리적, 화학적 변성 방법에 따라 펩타이드의 분자량은 다양하게 존재한다.
젤라틴의 종류는 제조 방법에 따라 두 가지로 나뉘는 데 산 처리를 통해 돼지의 피부로부터 추출한 젤라틴을 gelatin from porcine skin (type A), 알칼리 처리를 통해 소의 피부로부터 추출한 젤라틴을 gelatin from bovine skin (type B)이라고 명명한다. Type A와B의 차이점은 추출 방식뿐만 아니라 아미노산 조성, 분자량 분포, 화학적 성질 등에서 나타난다.
Type A와 B의 아미노산 조성에서 둘 다 글리신, 프롤린, 아르기닌 순으로 함량이 높은데 type A가 B보다 전체적으로 글리신, 프롤린, 아르기닌의 양이 더 많다. 또한 겔 강도인 bloom strength에서도 차이를 보이는데 이는 프롤린의 함량에 크게 영향을 받는다. 따라서 프롤린 함량이 높은 type A의 겔 강도가 type B 보다 1.5배 정도 더 높다. 젤라틴 물질은 온도에 따라 coil-to-helix transition에 의해 물리적인 가역적 젤화 거동을 보이는데 35℃ 이하의 온도에서는 젤, 그 이상의 온도에서는 졸이 되는 성질을 지니고 있다. 이처럼 온도변화에 반응하여 물리적 가교가 발생하기 때문에 젤라틴 하이드로젤은 기계적 화학적 안정성이 매우 낮고 따라서 비가역적인 가교를 이루어 안정성을 향상시켜야 실생활에서 사용할 수 있다.
한편, 서양고추냉이과산화효소(HRP)는 티라민(tyramine)과 과산화수소수(H2O2)와 함께 반응하여 가교제로서 역할을 수행하며, 생분해성과 생체적합성이 우수한 가교제로 알려져 있다. 반응은 크게 2가지 단계로 반응이 진행되는데 첫 번째 단계로 HRP가 과산화수소수에 의해서 산화되고, 두 번째 단계로 산화된 HRP는 티라민에 있는 페놀 그룹을 산화시켜서 중간체를 형성한다. 이렇게 생성된 물질로 인해서 가교점이 생성되어서 네트워크 구조를 형성하게 되는 것이다. 이때의 중요한 요소로는 H2O2와 HRP의 농도에 의해서 기계적 강도와 하이드로젤 형성 시간을 쉽게 조절할 수 있다는 점이다.
이러한 원리를 적용하여, 본 발명에 따른 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제는 창상치료효과와 우수한 생체적합성을 갖는 천연고분자인 젤라틴을 주요 성분으로 하여 젤라틴 표면을 티라민으로 개질하고, 기계적, 화학적 안정성을 높이기 위하여 과산화수소수(H2O2)를 촉매기질로 사용하며, 서양고추냉이과산화효소(HRP)를 효소촉매로 이용하여 제조한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, (a) 개선된 젤라틴을 제조하는 단계; (b) 상기 개선된 젤라틴을 용매에 용해시켜, 개선된 젤라틴 용액을 제조하는 단계; (c) 상기 개선된 젤라틴 용액과 촉매를 혼합한 용액 A, 상기 개선된 젤라틴 용액과 촉매 기질을 혼합한 용액 B를 각각 제조하는 단계; 및 (d) 이액형 스프레이에 상기 용액 A와 상기 용액 B를 독립적으로 충진한 후, 믹싱 노즐을 이용하여 분무와 동시에 용액들을 혼합 가교시켜 하이드로젤 창상 피복제를 제조하는 단계;를 포함하는 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제의 제조방법이 제공된다.
먼저, 서양고추냉이 과산화효소(HRP)가 가교제로서 작용하기 위해서는 티라민기를 필요로 하지만 젤라틴에는 티라민기가 존재하지 않으므로, 젤라틴 표면에 티라민기의 도입이 필요하다.
젤라틴에 티라민기를 도입하기 위해, 상기 (a) 개선된 젤라틴을 제조하는 단계를 살펴보면, 젤라틴에 커플링제의 일종인 N-하이드록시석신이미드(NHS) 및 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카르보다이이미드(EDC)를 반응시켜 젤라틴의 카복실기를 활성화 시킨 후, 티라민을 제공하여 커플링반응으로 젤라틴에 티라민을 결합시켜 젤라틴 표면을 개질할 수 있다. 이후, 티라민이 도입된 젤라틴을 투석 및 동결건조하여, 본 발명의 개선된 젤라틴을 수득할 수 있다. 즉, EDS-NHS 반응을 진행하여, 젤라틴에 티라민을 치환할 수 있다.
티라민의 도입은 고분자 사이를 연결하는 가교점을 의미한다. 따라서, 도입된 티라민기의 치환도에 따라 하이드로젤의 젤 형성시간 및 기계적 강도를 조절할 수 있고, 기계적 물성을 통하여, 하이드로젤의 기능성 발휘에도 영향을 미칠 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 티라민 치환기를 도입 후, 젤라틴의 측쇄에 티라민 치환율은 1 내지 30%으로 제공된다. 하이드로젤의 기계적 강도와 젤 형성 시간을 고려할 때, 티라민의 치환율은 약 1 내지 30%가 제공될 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 10%가 제공될 수 있다.
또한, 상기 측쇄에 티라민이 치환된 개선된 젤라틴은 중량평균분자량이 10,000 내지 750,000로 제공된다. 보다 구체적으로 살펴보면, 젤라틴은 중량평균분자량이 50,000 내지 250,000g/mol이고, 바람직하게는 100,000 내지 200,000g/mol일 수 있다. 상기 범위보다 높은 범위를 갖게 되는 경우 하이드로젤의 점도가 높아지기 때문에 그 조작 용이성이 떨어질 수 있고, 제조 공정상 균일하지 못한 결과물을 만들 수 있다. 반대로 낮은 범위를 갖게 되는 경우 하이드로젤의 충분한 기계적강도를 확보하지 못하는 문제점이 있을 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, (b) 상기 개선된 젤라틴을 용매에 용해시켜, 개선된 젤라틴 용액을 제조하는 단계에서 제공되는 용매의 경우, 인산염완충용액(PBS), 인간 유래 줄기세포 배양액, 동물 유래의 줄기세포 배양액 및 식물 유래의 줄기세포 배양액에서 선택되는 적어도 어느 하나 이상이 제공된다.
용매에 티라민이 치환되어 개선된 젤라틴은 1 내지 20 wt%의 농도로 포함되어, 이를 완전히 용해시켜, 개선된 젤라틴 용액을 제조할 수 있다. 용해 조건은 pH 6 내지 8의 25℃ 내지 40℃에서 20분 내지 1시간동안 진행할 수 있다. 바람직하게는 인산염완충용액을 사용할 수 있으며, 필요에 따라 줄기세포 배양액을 제공할 수 있다.
줄기세포 배양액이라함은 줄기세포를 배양하여 얻은 배지에 포함된 구성성분을 포함하는 것으로, 상기 배양액을 제조하기 위한 줄기세포는 그 종류에 제한이 있는 것은 아니다. 바람직하게는 인간 유래 줄기세포 배양액이 제공될 수 있으며, 성체줄기세포 또는 배아줄기세포일 수 있다. 또한, 성체줄기세포는 모든 조직의 성체줄기세포일 수 있다. 예를 들어서, 골수 유래, 제대혈 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 위장관 유래, 태반 유개, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래, 피부 유래 등이 제공될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 줄기세포 배양을 위한 배지는 당업계에서 알려진 기본 배지가 적용될 수 있고, 합성하여 제조할 수 있으며, 상업적으로 수득이 가능한 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal Essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640, F-10, F-12, α-MEM(α-Minimal essential Medium), G-MEM(Glasgow's Minimal Essential Medium) 및 Isocove's Modified Dulbecco's Medium 등이 제공될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
나아가, 배지에는 0.1% 내지 20%의 FBS(fetal bovine serum)를 함유하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 2% 내지 10%를 함유하는 것이 좋다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 제대혈 유래의 성체 줄기세포를 α-MEM에서 배양시켜 제공할 수 있다.
또한, 용매에는 젤라틴, 키토산, 히알루론산, 콜라겐, 알지네이트 및 셀룰로오스 유도체, 카복시메틸셀룰로스, 녹말, 히드록시에틸 녹말 등이 포함될 수 있다.
특히, 키토산, 히알루론산의 경우, 피부질환과 관련하여 이를 치료하거나 완화시키기 위하여 작용할 수 있다. 특히, 아토피성 피부염의 완화에 도움을 줄 수 있다. 피부에는 외부로부터 이물질의 침입을 막거나 수분을 보존하기 위해 보습 기능을 하는 보호벽 기능이 있다. 아토피성 피부염은 피부의 보호벽을 뚫고 침입한 이물질에 대해 몸의 면역체계가 과민반응을 일으킴으로써 발생한다. 피부에 발진이 생겨 심한 가려움증이 유발되고, 이는 보호벽 기능 유지에 관여하는 '피라그린'으로 불리는 단백질이 피부세포에서 감소되는 증상을 나타내게 된다. 키토산의 경우, 피부 세포에 흡수시키면 피라그린을 만드는 기능을 높여주는 효과가 있다. 다만, 키토산 분자를 사슬형태로 길게 늘어져 세포에 흡수되기 어렵기에 이러한 문제를 해결하기 위하여, 히알루론산과 혼합하게 사용하여 해결할 수 있다. 즉, 키토산은 플러스(+) 성질의 양전기, 히알루론산은 마이너스(-)성질의 음전기를 띄고 있으며 결합시키면 서로 얽혀서 직경이 70nm(나노미터)의 미세한 구형 입자로 바뀌므로, 이를 알레르기성 피부병, 아토피 등과 같은 피부질환이나 피부염증에 제공하여, 항염, 항균작용을 기대할 수 있다.
따라서, 키토산, 히알루론산을 창상 피복제로 포함하여 사람이나 동물의 피부에 사용하는 경우, 원래 목적하는 우수한 창상 치유 능력과 피부재생 능력을 제공함은 물론 피부질환이나 피부염증, 피부병 증상을 완화하는 효과를 제공할 수 있다.
또한, 필요에 따라, 항균이나 항진균 효과를 향상시키기 위하여, 인삼 추출물, 홍삼 추출물, 대나무 추출물, 편백나무 추출물, 황금 추출물, 마누카 오일 등을 더 포함할 수 있다.
더불어, 지혈물질로 염화칼슘, 트롬빈, 프로트롬빈, 프롬보플라스틴, 아프로티닌, 피브리노겐, 비타민 C, 비타민 K 및 미세젤 폼(gel foam)에서 선택된 적어도 어느 하나 이상을 더 포함할 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, (c) 상기 개선된 젤라틴 용액과 효소촉매를 혼합한 용액 A, 상기 개선된 젤라틴 용액에 촉매 기질을 혼합한 용액 B를 각각 제조하는 단계가 제공된다.
먼저, 용액 A의 경우 개선된 젤라틴용액에 효소촉매를 혼합하여 제조하여 제공되며, 용액 B의 경우 개선된 젤라틴용액에 촉매기질을 혼합하여 제조하여 제공된다. 개선된 젤라틴용액에 효소촉매와 촉매기질을 동시에 투입하여 혼합하는 경우, 즉시 가교가 진행되기 때문에 하이드로젤 창상피복제로 활용도가 떨어진다. 이에, 각각 따로 혼합하여, 도 1에서 제공되는 이액형 스프레이에 각각 주입하여 효소촉매반응에 의한 가교를 방지하고, 믹싱 노즐을 이용하여 분무와 동시에 혼합되어 가교되도록 제공한다.
용액 A에 제공되는 효소촉매는 서양고추냉이과산화효소(HRP)가 제공될 수 있다. 더불어, 용액 B에 제공되는 촉매기질은 과산화수소(H2O2)가 제공될 수 있다. 과산화수소수에 의해 산화된 HRP는 개선된 젤라틴에 도입된 티라민기에 있는 페놀기를 산화시켜 중간체를 형성하며, 이로 인해 가교점이 생성되어 네트워크 구조를 형성함으로써 하이드로젤이 형성되게 된다. 즉, 천연물에서 유리한 생체 친화적인 서양고추냉이 과산화효소를 가교제로 이용하여 가교 반응을 진행할 수 있다.
또한, 용액 A는 개선된 젤라틴 용액: 효소촉매를 1: 0.5 내지 2 중량비로 혼합한 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 젤라틴 용액: 효소촉매를 1: 1 내지 2 중량비로 제공할 수 있다. 또한, 용액 B는 개선된 젤라틴 용액: 촉매 기질을 1 내지 5: 1 중량비로 혼합한 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 젤라틴 용액 촉매 기질을 4 내지 5: 1 중량비로 제공할 수 있다.
하이드로젤은 과산화효소(HRP) 및 과산화수소의 농도를 조절하여 젤화 시간, 분해 시간, 기계적 강도, 또는 함수율에서 선택되는 물리화학적 성질을 조절할 수 있다. 상기 범위에서 하이드로젤의 젤화 시간, 기계적 강도를 용이하게 조절이 가능하고 기계적 강도와 우수한 체내 안정성을 갖는 in situ 형성 하이드로젤의 제공이 가능하다. 따라서, 체외에서 사용자가 조작에 용이한 액상 제형의 형태로 제공이 가능하다.
또한, 상기 개질된 젤라틴은 하이드로젤 창상피복제 전체 조성물 100 중량부에 대하여 1 내지 20 중량부를 포함하여 제공된다. 바람직하게는 1 내지 10 중량부로 포함할 수 있다. 상기 범위보다 높은 범위를 갖게 되는 경우 생체 내에서 하이드로젤의 점도가 너무 높아져 젤화에 시간이 오래 걸리게 되어 창상 치유시간을 지연시키게 되고 상기 범위보다 낮은 범위를 갖게 되는 경우 하이드로젤의 조직 접착성이 떨어질 수 있다. 따라서, 1 내지 10 중량부를 제공하여 이러한 문제점을 해결할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 (d) 단계에서, 이액형 스프레이에 상기 용액 A와 상기 용액 B를 독립적으로 충진한 후, 믹싱 노즐을 이용하여 분무와 동시에 용액들을 혼합 가교시켜 하이드로젤 창상 피복제를 제조하는 단계를 제공한다. 즉, 도 1에서 제공되는 이액형 스프레이에 각각 주입하여 효소촉매반응에 의한 가교를 방지하고, 믹싱 노즐을 이용하여 분무와 동시에 혼합되어 가교되도록 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 이 경우, 믹싱 노즐을 통해 제공되는 분무는 5초 내지 1분으로 진행되는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는 10초 이하로 제공될 수 있다.
본 발명에 따른 상기 제조방법에 따라 제조된 개선된 젤라틴을 이용한 하이드로젤 창상피복제가 제공된다.
이 경우, 상기 하이드로젤 창상피복제는 실온에서 점도가 10,000 내지 25,000 cp일 수 있고, 접착 강도가 10 내지 30kPa로 제공될 수 있다. 상기 범위를 만족하는 경우 하이드로젤 창상피복제가 피부로부터 이탈되거나 유실되는 현상을 방지하면서 창상 치료에 효율적인 효과를 제공한다. 상기 점도 범위보다 높은 범위를 갖는 경우 조작용이성에 대한 문제가 생기게 되면서, 반대로 상기 범위 보다 낮은 범위를 갖게 되는 경우 조직 부착성 및 저장성에 문제가 발생하고, 창상치료의 효율 역시 저하된다. 상기 점도 및 접착 강도 범위를 제공함으로써, 더욱 효과적으로 활용이 가능하다.
또한, 본 발명의 하이드로젤 창상피복제는 주사형, 스프레이형, 겔형, 액형 및 에어로졸 형태 등으로 이용될 수 있으며, 바람직하게는 스프레이형으로 제공된다. 이에 따라 창상면에 다양하고, 용이하게 제공할 수 있으며, 이에 기술의 활용성을 향상시키는 효과를 제공할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 >
1. 젤라틴을 개질화하는 단계
알드리치(Sigma-Aldrich)사의 gelatin from procine skin(젤라틴, type A, gel strength 300)를 준비하여, 3차 증류수에 넣고 충분히 용해되도록 45℃, 180 rpm으로 2 시간 동안 교반시켰다. 이후, 완전히 용해되면 젤라틴 용액을 상온이 될 때까지 충분히 식혀 준 다음, TCI(Japan, Tokyo Chemical Industry Co., LTD.)사의 1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride(EDC, ≥8%)와 알드리치(Sigma-Aldrich)사의 N-hydroxysuccinimide(NHS, ≥8%)를 넣어 30분간 180 rpm으로 교반시켜 녹인다. 여기에 알드리치(Sigma-Aldrich)사의 tyramine hydrochloride(tyramine, ≥98%)을 넣고, 12시간 동안 교반시켜 젤라틴 표면을 개질하였다.
반응이 종결된 후 용액 내의 불순물과 EDC, NHS를 제거하기 위해 100mM NaCl 용액, 25% ethanol, 3차 증류수를 사용하여 차례대로 2일, 1일, 1일간 투석을 진행하였고, 투석이 원활하게 진행될 수 있도록 8시간마다 투석 용액을 교환하였다. 투석을 끝마친 gelatin-tyramine(Gel-Tyr) 용액을 얼음 틀에 넣고 deep preezer(-80℃에서 예비 동결을 시킨 다음 동결건조기를 사용하여, 3일간 동결 건조시켜 개질된 젤라틴(Gel-Tyr)을 제조하였다.
2. 개선된 하이드로젤 창상피복제의 제조
실시예 1의 개질된 젤라틴을 1~6 wt% 농도로 인산염완충용액(PBS)에 넣어 37℃ 조건으로 용해시켜 Gel-Tyr 용액을 만들었다. 도 1과 같은 이액형 스프레이를 이용하여, 완전히 용해된 Gel-Tyr 용액에 HRP(Sigma Aldrich사의 horseradish peroxidase)와 H2O2(Daejung사의 hydrogen peroxide, H2O2, 30%)를 각각 첨가하였다. 이에, Gel-Tyr 용액을 따로 넣어줌으로써 효소촉매반응에 의한 가교를 방지하고 mixing nozzle을 사용하여 분무와 동시에 섞이면서 가교되는 방식으로 실험을 진행하였다. 사용한 이액형 스프레이는 5 ml Х 5 ml EVICEL® Fibrin sealant, 분무 노즐은 EVICEL® Airless spray accessory를 Ethicon, Inc. (UK)이다.
< 실험예 >
실험예 1: 개선된 하이드로젤의 개질 확인
젤라틴이 EDC-NHS 반응을 통해 개질되었음을 확인하기 위하여 proton nuclear magnetic resonance(1H-NMR, Bruker Biospin, Advance Ⅲ 400MHz, Germany)를 이용하여 반응 전의 젤라틴과 반응 후의 개질된 젤라틴 특성피크를 비교하여 젤라틴의 개질 여부를 확인하였다.
용매는 deuterium oxide (D2O)를 사용하였으며, 낮은 온도에 의한 젤라틴의 물리적 가교가 일어나지 않도록 37℃조건에서 측정을 진행하였다. 또한, EDC와 NHS 의 함량, 표면에 티민 치환율(개질 정도)를 달리하여 진행하였으며, 이에 대한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2의 순서는 표 1에 기재된 순서에 대응한 결과이다.
gelatin | tyramine | EDC | NHS | Tyramine 치환율(%) | |
1 | 1g | - | - | - | - |
2 | 1g | 0.5 g | 0.1g | 0.025g | 3.4% |
3 | 1g | 0.5 g | 0.2g | 0.05g | 9.3% |
4 | 1g | 0.5 g | 0.3g | 0.075g | 12.4% |
5 | 1g | 0.5 g | 0.4g | 0.1g | 15.9% |
6 | 1g | 0.5 g | 0.5g | 0.125g | 22.9% |
실험예 2: 하이드로젤화 시간 평가
하이드로젤 젤화 시간을 tube inversion 방법을 사용하여 측정하였다. 가교전 점탄성을 가지는 샘플은 중력에 따라 흐름을 가지는 반면, 하이드로젤이 가교되면 더 이상 흐르지 않는다는 특성을 기반으로, 튜브를 뒤집어 놓고 더 이상 흐르지 않게 되는 시점을 통하여 Gel-Tyr, HRP, H2O2의 농도에 따라 하기와 같이 하이드로젤 젤화 시간을 측정하였다.
실험예 2-1: Gel-Tyr 농도에 따른 하이드로젤화 시간 평가
Gel-Tyr 농도에 따른 젤화 시간 분석을 위하여, 하이드로젤 가교 시 Gel-Tyr의 농도가 젤화 거동에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 HRP의 농도를 3.50 units/㎖, H2O2의 농도를 0.2 ㎕/㎖로 고정하고, Gel-Tyr의 농도가 1, 1.5, 2, 3, 4 wt% 일 때의 젤화 시간을 측정하였다. 5 wt% 이상의 농도는 너무 점도가 높아 실험을 진행하지 않았다. 이에 대한 결과는 도 3에 나타내었다.
실험예 2-2: HRP 농도에 따른 하이드로젤화 시간 평가
HRP 농도에 따른 젤화 시간 분석을 위하여, 하이드로젤 가교 시 HRP의 농도가 젤화 거동에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 Gel-Tyr의 농도를 3 wt%, H2O2의 농도를 0.2 ㎕/㎖로 고정하고, HRP의 농도를 0.88, 1.75, 2.63, 3.50, 4.38 units/㎖ 첨가하였을 때의 젤화 시간을 측정하였다. 이에 대한 결과는 도 4에 나타내었다.
실험예 2-3: H
2
O
2
농도에 따른 하이드로젤화 시간 평가
H2O2 농도에 따른 젤화 시간 분석을 위하여, 하이드로젤 가교 시 H2O2의 농도가 젤화 거동에 어떠한 영향을 미치는지 확인하고자 Gel-Tyr의 농도를 3 wt%, HRP의 농도를 3.50 units/㎖로 고정하고, H2O2의 농도를 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎕/㎖ 첨가하였을 때의 젤화 시간을 측정하였다. 이에 대한 결과는 도 5에 나타내었다.
실험예 3: 개선된 하이드로젤 swelling ratio 평가
Crosslinking density에 따른 하이드로젤의 특성을 살펴보기 위하여, 실시예 2에 따라 제조되는 개선된 젤라틴 하이드로젤의 swelling ratio 실험을 진행하였다. 하이드로젤 디스크의 무게를 측정한 뒤, 50 ml PBS 용액에 넣어 37℃ 조건에서 15, 30, 45 분이 지난 뒤 무게를 측정하였다. Swelling ratio는 다음과 같은 식으로 계산하였다. Ws는 swelling된 하이드로젤의 무게, Wd는 동결건조된 하이드로젤의 무게이다.
Ws: swelling된 하이드로젤의 무게이다.
Wd: 동결건조된 하이드로젤의 무게이다.
먼저, Gel-Tyr 농도에 따른 swelling ratio를 도 6에 나타내었다. 이 경우, HRP의 농도를 3.50 units/ml, H2O2의 농도를 0.2㎕/㎖로 제공하였다.
또한, HRP 농도에 따른 swelling ratio를 도 7에 나타내었다. 이 경우, Gel-Tyr의 농도를 3 wt%, H2O2의 농도를 0.2 ㎕/㎖로 제공하였다.
실험예 4: 개선된 하이드로젤 유변학적 특성 평가
실시예 2에 따라 제조되는 젤라틴 하이드로젤의 유변학적 특성을 파악하고자 Thermo Scientific HAAKE MARS II Rheometer(Thermo Scientific HAAKE MARS II Rheometer, Thermo, Germany)를 사용하여, G'값을 측정하였다. ARES(TA instruments, USA)를 이용하여 Gel-Tyr와 HRP의 농도별 하이드로젤의 G'값을 dynamic frequency 모드에서 측정하였다 (25℃, gap: 1 mm, plate-plate (Φ 20 mm)).
이에, Gel-Tyr의 농도에 따른 storage modulus를 도 8에 나타내었다. HRP 농도 2.63, 3.50 및 4.38 units/ml에 따른 storage modulus를 도 9에 나타내었다.
실험예 5: 개선된 하이드로젤의 생분해거동 평가
실시예 2에 따라 제조되는 젤라틴 하이드로젤의 생분해거동 분석을 진행하기 위해 모든 샘플은 클린벤치에서 제조하였고, 실험에 사용하는 기구들은 고온고압 멸균기와 70% ethanol, UV조사를 통하여 멸균을 충분히 진행한 후 이용하였다. 하이드로젤 샘플은 지름 10 mm, 높이 5 mm의 실리콘 몰드를 이용하여 제조하였다. Gel-Tyr 3 wt%, H2O2 0.2㎕/㎖로 고정하고 HRP의 농도를 2.63, 3.50, 4.38 units/㎖로 3가지 조건의 샘플을 제조하였다. 제조된 샘플을 50 ml cornical tube에 넣고, phosphate buffered saline (PBS, pH 7.4) 용액을 25 ml 넣어주었다. 준비된 샘플을 shaking bath에 넣고 37℃, 180 rpm 환경에서 실험을 진행하였다. 실험은 1-5주 간 실시하였고, 시간 경과에 따라 샘플을 회수하여 하이드로젤 샘플의 무게를 측정하였다. 각 조건마다 5개씩 분석하여 평균을 내어 결과값을 얻었다. 이에 대한 결과를 도 10에 나타냈다.
실험예 6: 개선된 하이드로젤의
in vitro
생체적합성 평가
실험예 6-1: 개선된 하이드로젤의 세포독성 평가
실시예 2에 따라 제조되는 젤라틴 하이드로젤이 가지는 생체적합성을 파악하기 위해 in vitro 세포독성평가를 진행하였다. 배양세포는 피부조직을 구성하는 세포인 fibroblast중 쥐의 피부로부터 유래된 세포주 NIH3T3(mouse embryonic cell line)를 사용하였다. ISO 10993-5 시험법에 따라 96 well plate에 세포를 1만 cells씩 seeding한 후 37℃, 5% CO2 조건에서 24시간 동안 배양시켰다. 배양액 5 ml에 하이드로젤 샘플의 면적이 30cm2가 되도록 준비하여 24시간 동안 용출한 뒤 그 용출액을 96 well plate에 24시간 동안 배양시켜 놓은 세포의 배양액과 교체하였다. 용출액으로 추가 24시간 동안 배양시킨 세포를 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)로 4시간 동안 염색하였다. 염색된 세포를 DMSO로 녹여내어 보라색을 띄는 용액으로 만들어 준 다음 ELISA reader를 이용하여 540 nm 파장의 흡광도를 측정하였다. 실험군은 Gel-Tyr 농도별, H2O2 농도별로 샘플을 제조하여 용출법을 통해 진행하였다.
대조군(control)으로는 아무런 처리를 하지 않은 배양액에서 상기와 동일한 시간 (48시간)동안 배양한 세포를 사용하였다.
먼저, HRP 3.50 unit/㎖, H2O2 0.2 ㎕/㎖로 고정하고 Gel-Tyr의 농도를 2, 3, 4, 5, 6 wt%로 증가시키면서 세포독성을 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 11에 나타내었다. 도면에서 n=4이고, NS: Not Significant (P>0.05), **: P≤0.01, ***: P≤0.001 as compared with the control을 의미한다.
다음으로, Gel-Tyr 3 wt%, H2O2 0.2 ㎕/㎖로 고정하고 HRP의 농도를 2.63, 3.50, 4.38 units/㎖로 증가시키면서 세포독성을 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 12에 나타내었다. 도면에서 n=4이고, NS: Not Significant (P>0.05) as compared with the control을 의미한다.
마지막으로 Gel-Tyr 3 wt%, HRP 3.50 units/ml로 고정하고 H2O2의 농도를 0.2, 0.4, 0.6 ㎕/㎖로 증가시키면서 세포독성을 측정하였다. 이에 대한 결과를 도 13에 나타내었다. 도면에서 n=4이고, NS: Not Significant (P>0.05) as compared with the control을 의미한다.
실험예 6-2: 개선된 하이드로젤의 Live/Dead 염색을 통한 세포성장거동 평가
실시예 2에 따라 제조되는 젤라틴 하이드로젤에 의한 세포성장거동을 파악하기 위해 Live/Dead 염색을 이용하여 세포의 성장 거동을 평가하였다. 배양세포는 세포독성평가와 동일하게 NIH3T3 세포주를 사용하였고, 35 mm petri dish에 세포 10만 cells씩 seeding하고 4시간 배양하여 세포를 접착시킨 후 그 위에 하이드로젤을 올려두어 직접적으로 세포와 접촉하게 하였다. 그 후 37℃, 5% CO2 조건에서 1, 5일간 배양하여 세포 성장 거동을 관찰하였다. Live/Dead 염색은 2 μM calcein AM, 4 μM ethidium homodimer-1 용액을 사용하여 30분간 염색하였고, 형광현미경을 사용하여 염색된 생존세포와 사멸세포를 각각 515 nm와 635 nm 파장의 빛으로 흡수함으로써 녹색과 적색의 형광으로 관찰하였다.
Gel-Tyr 3 wt%, H2O2 0.2 ㎕/㎖의 조건에서, HRP 2.63, 3.50 및 4.38 units/ml 농도를 달리하여 젤라틴 하이드로젤을 제조하여 이미 접착된 세포 위에 올려두어 직접적인 세포의 성장을 확인하였다.
대조군(control)으로는 아무런 처리를 하지 않은 배양액에서 상기와 동일한 시간동안 배양한 세포를 관찰하여 진행하였다. 이에 대한 결과는 도 14에 나타내었다.
실험예 7: 개선된 하이드로젤의
in vivo
동물모델 실험평가
실험예 7-1: 개선된 하이드로젤을 이용한 SD rat 창상치유능 평가
실시예 2에 따라 제조되는 젤라틴 하이드로젤이 실제로 창상치유효과가 있는지를 확인하기 위하여 male Sprague Dawley rats(효창사이언스, South Korea)을 이용하여 동물실험을 진행하였다. SD rat은 8주령으로, 실험 3일전부터 실험실 환경에서 적응시킨 후 실험을 진행하였다.
SD rat에 Zoletil® 50과 Rompun®을 4:1 비율로 섞은 동물용 마취제를 투여하여 마취한 후 SD rat이 마취되면 앞다리와 뒷다리 사이의 몸통부위의 털을 제모하였다. 포비돈 요오드 용액으로 소독한 후 양쪽 옆구리에 직경 2 cm 크기의 전층창상을 냈다. 투명한 OHP 필름을 사용하여 창상부위에 대고 따라 그려서 창상크기를 재고, 창상부위를 생리식염수로 세척하고, 창상부위에 젤라틴 하이드젤을 분무한다. 하이드로젤의 가교가 완료되면, 창상부위와 그 주변을 TegadermTM으로 덮어서 보호했다(대조군으로는 멸균된 거즈를 사용). 수술이 끝난 뒤 SD rat의 마취 상태를 지속적으로 확인하고, 마취가 풀리면 하이드로젤이 떨어지는 것을 방지하기 위하여 Corban®으로 몸통을 감아준다. 이후 2일 간격으로 OHP필름을 사용하여 창상부위를 그려서 시간경과에 따른 창상치유거동을 확인하였다.
2주간의 실험동안 이틀마다 창상크기를 측정한 결과는 도 15에 나타내었다. 도 13에서 a)는 0일, b)는 3일 c)는 5일, d)는 7일, e)는 11일, f)는 14일을 나타내는 것이다.
대조군(control)으로 멸균된 거즈를 사용한 것을 제외하고는 상기와 동일하게 진행하였다. 이 결과는 도 16에 나타내었다. 도 15에서 a) 내지 f)가 의미하는 것을 상기와 동일하다.
또한, 실시예 2에 따라 제조되는 젤라틴 하이드로젤과 대조군에서 창상의 크기를 실험 첫날의 창상크기로 나누어 창상의 감소율을 계산하였다. 이에 대한 결과는 도 17에 나타내었다.
실험예 7-2: 개선된 하이드로젤의 조직염색을 통한 피부조직 재생 능력 평가
실시예 2에 따라 제조되는 젤라틴 하이드로젤과 대조군의 멸균된 거즈를 1주와 2주 적용한 후, 피부조직을 채취하여 H&E staining과 Masson's trichrome staining을 진행한 후, 이를 광학현미경으로 관찰하였다.
1주 후, H&E staining에 대한 결과는 도 18에 나타내었고, 2주 후, 이에 대한 결과는 도 19에 나타내었다. 또한, 1주 후, Masson's trichrome staining에 대한 결과는 도 20에 나타내었고, 2주 후, 이에 대한 결과는 도 21에 나타내었다.
< 실험예 평가 분석 및 검토>
실험예 1의 개선된 하이드로젤의 개질 확인
도 2의 결과에 따르면, EDC-NHS 반응을 통하여 tyramine을 도입한 경우 기존의 젤라틴과 달리 tyramine 특성피크가 6.68, 6.95 ppm에서 뚜렷하게 나타났고, 반응 시 첨가된 EDC와 NHS의 양이 증가함에 따라 피크의 크기가 증가하였다. 개질을 하지 않은 순수한 젤라틴도 6.68, 6.95 ppm에서 피크가 나타나는 것을 보았으나 이는 젤라틴을 구성하는 아미노산 중 극소량으로 포함된 티로신(tyrosine)에 의한 것으로 보인다. 젤라틴 개질반응에 영향을 받지 않는 개질율을 계산함으로써 뚜렷하게 분석할 수 있었다.
실험예 2의 하이드로젤화 시간 평가 분석
실험예 2-1의 Gel-Tyr 농도에 따른 하이드로젤화 시간 분석
도 3의 결과에 따르면, HRP의 농도를 3.50 units/ml, H2O2의 농도를 0.2 ㎕/㎖로 고정하였을 때 Gel-Tyr의 농도가 1 wt%인 용액은 시간이 지나도 가교가 되지 않았고, 1.5, 2, 3, 4, 5, 6 wt%로 Gel-Tyr의 농도가 높아짐에 따라 젤화 시간이 점차 감소하여 각각 112, 46, 10.2, 8.7, 7.6, 5.7초로 측정되었다. Gel-Tyr의 농도가 높아질수록 가교 반응을 할 수 있는 작용기의 수도 증가하기 때문에 같은 양의 효소 촉매가 첨가되더라도 더 빠른 가교 속도를 지니는 것으로 예측된다. 이 결과를 통해 스프레이형 하이드로젤 창상피복제로 활용하기 위해서는 Gel-Tyr이 3 wt% 이상의 농도를 적용해야 한다는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 2-2의 HRP 농도에 따른 하이드로젤화 시간 분석
도 4의 결과에 따르면, Gel-Tyr의 농도를 3 wt%, H2O2의 농도를 0.2 ㎕/㎖로 고정하고, HRP의 농도를 0.88, 1.75, 2.63, 3.50, 4.38 units/㎖으로 증가시킴에 따라 젤화 시간이 점차 감소하여 36.6, 29, 16.3, 10.2, 7.2초로 측정되었다. 그 이유는 HRP가 효소 촉매로 작용하여 라디칼을 형성시키기 때문에 HRP의 농도가 가교 속도와 직접적으로 연관이 되어 증가하는 것으로 판단된다. 이 결과를 통해 3.5 units/㎖이상의 농도를 사용해야 한다는 것을 확인하였다.
실험예 2-3의 H
2
O
2
농도에 따른 하이드로젤화 시간 분석
도 5의 결과에 따르면, Gel-Tyr의 농도를 3wt%, HRP의 농도를 3.50 units/㎖로 고정하고, H2O2의 농도를 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1.0 ㎕/㎖로 증가시킴에 따라 젤화 시간을 측정하였을 때 0.1 ㎕/㎖의 경우 가교가 되지 않았고, 0.2 ㎕/㎖ 이상의 농도에서는 결과 값의 차이가 나타나지 않고 일정한 값을 나타내었다. 이러한 결과를 보이는 이유는 H2O2의 농도는 적은 양으로도 이미 과량이 존재하여 H2O2를 산화시켜 라디칼로 만드는 효소 촉매나 가교 반응기의 수와 직접적으로 연관되는 고분자 농도가 가교 속도에 있어서 더욱 주요하게 작용한다고 판단하였다. 가교가 되지 않는 0.1 ㎕/㎖ 이하의 농도는 제외하고, 0.2 ㎕/㎖ 이상의 농도가 바람직함을 확인할 수 있었다.
실험예 3의 젤라틴 하이드로젤의 swelling ratio 평가 분석
도 6의 결과에 따르면, HRP의 농도를 3.50 units/ml, H2O2의 농도를 0.2 ㎕/㎖로 고정하였을 때, Gel-Tyr의 농도가 2, 3, 4, 5, 6 wt%로 높아짐에 따라 swelling ratio는 점차 감소하였다. 농도별로 15분 또는 30분 정도에 팽윤이 최대에 도달하였다. 이러한 경향성이 나타나는 이유는 Gel-Tyr의 농도가 높을수록 젤라틴이 가지는 친수성보다 tyramine에 의한 가교도의 증가가 더욱 큰 영향을 미치기 때문이다. 가교도가 증가하여 하이드로젤 내부 네트워크가 더욱 조밀해지고 이는 고분자 사슬간의 결합을 강하게 만든다. 이에 따라 팽창되는 정도가 감소하고 이는 swelling ratio의 감소로 나타나게 되었다.
도 7의 결과에 따르면, Gel-Tyr의 농도를 3 wt%, H2O2의 농도를 0.2 ㎕/㎖로 고정하고, HRP의 농도가 2.63, 3.50, 4.38 units/ml로 높아짐에 따라 swelling ratio는 점차 감소하였으며, 15분이 경과하였을 때 팽윤이 최대에 도달할 만큼 빠른 팽윤 거동을 보였다. HRP 농도가 높을수록 하이드로젤의 가교도가 높아지므로 내부 네트워크가 더욱 조밀하게 구성된다. 이에 따라 수분을 함유하였을 때 팽창 정도가 감소하여, swelling ratio가 감소함을 확인하였다.
실험예 4의 젤라틴 하이드로젤 유변학적 특성 평가 분석
도 8의 결과에 따르면, HRP의 농도를 3.50 units/ml, H2O2의 농도를 0.2 ㎕/㎖로 고정하였을 때, Gel-Tyr의 농도가 1.5, 2, 3, 4, 5, 6 wt%로 높아짐에 따라 storage modulus는 증가하였다. 이는 하이드로젤을 구성하는 주 성분인 Gel-Tyr의 농도가 높아짐에 따라 하이드로젤이 더욱 높은 밀도로 이루어져 더 낮은 농도일 때의 하이드로젤보다 저장탄성율이 높다. 또한 농도가 높아질수록 가교 반응기의 수도 비례하여 증가하므로 가교도 증가에 따른 하이드로젤의 물성 증가를 확인할 수 있었다. 추가적으로 Kiselioviene의 연구결과를 바탕으로 400-600Pa 정도의 탄성율을 지닌 피부 조직에 사용하기에 바람직하게 2 내지 3 wt%로 제공될 수 있음을 확인하였다.
도 9의 결과에 따르면, Gel-Tyr의 농도를 3wt%, H2O2의 농도를 0.2㎕/㎖로 고정하였을 때, HRP의 농도가 2.63, 3.50, 4.38 units/㎖로 높아짐에 따라 storage modulus는 증가하였다. 이는 하이드로젤의 가교도에 영향을 미치는 HRP의 농도가 증가함으로써 산화 라디칼의 수가 많아지고 이에 따라 하이드로젤의 물성이 높아졌다고 판단하였다. 따라서, 피부조직에 사용하기에 바람직하게 3.50, 4.38 units/ml로 제공될 수 있음을 확인하였다.
실험예 5의 젤라틴 하이드로젤의 생분해거동 평가 분석
도 10의 결과에 따르면, Gel-Tyr의 농도를 3 wt%, H2O2의 농도를 0.2 ㎕/㎖로 고정하였을 때, HRP의 농도가 2.63, 3.50, 4.38 units/㎖로 높아짐에 따라 생분해속도는 감소하였다. 이러한 결과가 나타난 이유는 HRP의 농도가 높을수록 하이드로젤의 가교도가 높아 생분해 속도에 영향을 미치는 물질 교환이 충분히 이루어지지 않아 가교도가 낮은 하이드로젤에 비해 생분해 속도가 늦어진 것으로 판단하였다. 결과를 보았을 때, HRP 농도가 2.63 units/㎖인 하이드로젤의 경우 4 주차에 완전히 분해가 되어 가장 빠른 생분해 속도를 보였고, 3.50, 4.38 units/㎖인 하이드로젤은 각각 82.6, 65.3%의 무게감소율을 보였다. 5주차에는 HRP의 농도와 관계없이 모든 샘플이 완전 분해되었음을 확인하였다. 또한, 3-4주차에서 생분해가 급격히 진행되는 것을 볼 수 있는데 3주까지는 하이드로젤의 생분해가 거의 되지 않아서 생분해도가 증가하지 않았고, 3주차에 도달하였을 때 하이드로젤이 분해되면서 표면적이 증가하고, 그 결과 생분해 속도가 급격히 증가한 것으로 확인할 수 있다.
실험예 6의 젤라틴 하이드로젤의
in vitro
생체적합성 평가 분석
실험예 6-1의 젤라틴 하이드로젤의 세포독성 평가 분석
도 11의 결과에 따르면, HRP 3.50 unit/ml, H2O2 0.2 ㎕/㎖로 고정하고 Gel-Tyr의 농도를 2, 3, 4, 5, 6 wt%로 증가시키면서 세포독성을 측정하였다. 그 결과, 고분자 농도가 증가할수록 세포 생존율이 감소하였으며 차례대로 98, 97, 83, 74, 61%로 나타났다. 2-4 wt%는 세포독성 1등급, 5 wt% 이상은 세포독성 2등급을 보였는데 4 wt%의 경우 1등급을 띄었지만 생존율이 비교적 낮아 피부에 직접적으로 닿는 창상피복제로 사용하기에는 부적합하다고 판단하였고, 2 또는 3 wt%가 활용하기에 적합함을 확인할 수 있다.
도 12의 결과에 따르면, Gel-Tyr 3 wt%, H2O2 0.2 ㎕/㎖로 고정하고 HRP의 농도를 2.63, 3.50, 4.38 units/㎖로 증가시키면서 세포독성을 측정하였다. 그 결과, 세포생존율은 HRP의 농도가 증가함에 따라 차례대로 103.5, 103.5, 96.7%로 나타났고, 모든 샘플의 세포 생존율이 95% 이상으로 높은 생체적합성을 나타내었다.
HRP의 농도가 세포독성에 미치는 영향은 크지 않다는 것을 파악하였고, 이 중에서 세포독성이 낮은 2.63 또는 3.50 units/㎖가 활용하기에 적합하다고 판단하였다.
도 13의 결과에 따르면, Gel-Tyr 3 wt%, HRP 3.50 units/㎖로 고정하고 H2O2의 농도를 0.2, 0.4, 0.6 ㎕/㎖로 증가시키면서 세포독성을 측정하였다. 그 결과, H2O2의 농도가 증가함에 따라 세포 생존율이 감소하였으며 차례대로 101.1, 98.6, 96.7%로 나타났다. H2O2의 농도가 증가할수록 세포독성이 증가한다는 것을 파악하였고, 이 중에서 세포독성이 낮은 0.2 ㎕/㎖가 활용하기에 적합하다고 판단하였다.
실험예 6-2의 Live/Dead 염색을 통한 세포성장거동 평가 분석
도 14의 결과에 따르면, Gel-Tyr 3 wt%, H2O2 0.2 ㎕/㎖로 고정하고 HRP의 농도를 2.63, 3.50, 4.38 units/㎖로 증가시키면서 세포를 관찰하였다. 세포 배양 1일, 5일 후의 세포를 515, 635 nm의 파장으로 관찰하였다. 녹색으로 관찰된 생존 세포를 보았을 때, 하이드로젤의 세포성장이 대조군보다 높은 것을 관찰할 수 있었고, HRP의 농도가 증가함에 따른 세포성장의 차이는 나타나지 않아 HRP의 농도가 세포 성장에 미치는 영향은 크지 않다는 것을 알 수 있었다. 적색으로 관찰된 사멸 세포를 보았을 때, 대조군이 가장 사멸세포의 수가 많았고, HRP의 농도가 높을수록 사멸세포의 수가 많음을 관찰하였다. 이를 통해 HRP의 농도가 높을수록 피부세포 성장 중에 사멸이 많이 발생한다는 것을 알 수 있었다.
실험예 7의 젤라틴 하이드로젤의
in vivo
동물모델 실험평가 분석
실험예 7-1의 젤라틴 하이드로젤 SD rat을 이용한 창상치유능 평가 분석
도 15 내지 17의 결과에 따르면, 2 주간 창상 크기를 관찰한 결과 Gel-Tyr 하이드로젤 창상피복제를 도입한 실험군은 2 주 만에 86.7% 창상이 치유되었고, 거즈를 도입한 대조군은 77.2% 창상이 치유되었다.
실험 결과 젤라틴 하이드로젤 창상피복제는 거즈와 비교하였을 때 더욱 우수한 창상치유능을 가졌다는 것을 알 수 있었다. 이는 하이드로젤이 창상에 습윤환경을 유지해주고 상처부위를 보호함으로써 상처치유 속도를 높인 것으로 보인다.
또한, 젤라틴 내의 RGD sequence (arginyl-glycyl-aspartic acid)가 가지는 우수한 피부세포 접착 능력에 의한 피부조직 재생에 미치는 영향도 큰 것으로 판단된다.
실험예 7-2의 조직염색을 통한 피부조직 재생 능력 평가 분석
도 18 및 19의 H&E staining의 1주 및 2주 후 결과에 따르면, 하이드로젤 창상피복제를 도입한 실험군의 경우 거즈를 사용했던 대조군보다 피부조직을 구성하는 데에 중요한 제 1형 콜라겐의 형성이 더욱 많이 되었음을 관찰할 수 있었다. 또한 hematoxylin에 의해 보라색으로 염색된 피부세포의 핵을 관찰하였고, 거즈보다 우수한 피부세포 증식능력을 파악할 수 있었다.
도 20 및 21의 Masson's trichrome staining 의 1주 및 2주 후 결과에 따르면, aniline blue에 의해 파랗게 염색된 콜라겐 섬유들을 관찰할 수 있었다. 대조군보다 하이드로젤을 도입한 창상의 피부조직이 더욱 선명한 청색을 띄어 1형 콜라겐의 형성이 더욱 많이 되었음을 확인하였다. 또한 biebrich scarlet sol에 의해 적갈색으로 염색된 근섬유들을 관찰할 수 있었다. 하이드로젤 창상피복제를 도입한 피부조직에서 더욱 선명한 적갈색을 띄어 거즈보다 smooth muscle cell이 더욱 증식되었음을 확인하였다. 2 가지 조직염색 결과를 통해, 본 발명에 따른 개선된 젤라틴 하이드로젤의 창상 치유능이 우수하다는 것을 조직학적으로 입증하였다.
이상에서 본 발명이 구체적인 구성요소 등과 같은 특정 사항들과 한정된 실시예 및 도면에 의해 설명되었으나, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐, 본 발명이 상기 실시예들에 한정되는 것은 아니며, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적인 지식을 가진 자라면 이러한 기재로부터 다양한 수정 및 변형을 꾀할 수 있다.
따라서, 본 발명의 사상은 상기 설명된 실시예에 국한되어 정해져서는 아니 되며, 후술하는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등하게 또는 등가적으로 변형된 모든 것들은 본 발명의 사상의 범주에 속한다고 할 것이다.
Claims (13)
- (a) 개선된 젤라틴을 제조하는 단계;
(b) 상기 개선된 젤라틴을 용매에 용해시켜, 개선된 젤라틴 용액을 제조하는 단계;
(c) 상기 개선된 젤라틴 용액과 효소촉매를 혼합한 용액 A와 개선된 젤라틴 용액과 촉매기질을 혼합한 용액 B를 각각 제조하는 단계; 및
(d) 이액형 스프레이에 상기 용액 A와 상기 용액 B를 독립적으로 충진한 후, 믹싱 노즐을 이용하여 분무와 동시에 용액들을 혼합 가교시켜 하이드로젤 창상 피복제를 제조하는 단계;를 포함하고,
상기 (a)단계에서 개선된 젤라틴을 제조하는 것은
젤라틴에 N-하이드록시석신이미드(NHS) 및 1-에틸-3-(3-다이메틸아미노프로필)-카르보다이이미드(EDC) 중 어느 하나 이상을 반응시킨 후 티라민과 반응시켜, 젤라틴에 티라민 치환기를 도입하여 개선하고,
상기 (b)단계의 개선된 젤라틴 용액은 상기 개선된 젤라틴 2~3 wt% 농도로 용매에 용해시키고,
상기 (c)단계의 용액 A는 개선된 젤라틴 용액: 효소촉매를 1: 1 내지 2 중량비로 혼합하고,
상기 (c)단계의 용액 B는 개선된 젤라틴 용액: 촉매 기질을 4 내지 5: 1 중량비로 혼합한 것을 특징으로 하는 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제의 제조방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 티라민 치환기를 도입 후, 젤라틴의 측쇄에 티라민 치환율은 1 내지 30%인 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 (b)단계의 용매는
인산염완충용액(PBS), 인간 유래 줄기세포배양액, 동물 유래의 줄기세포 배양액 및 식물 유래의 줄기세포배양액에서 선택된 적어도 어느 하나 이상을 포함하는 것인 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 (b)단계의 개선된 젤라틴 용액은 젤라틴, 키토산, 히알루론산, 콜라겐, 알지네이트, 셀룰로오스 유도체, 카복시메틸셀룰로스, 녹말, 히드록시에틸녹말, 염화칼슘, 트롬빈, 프로트롬빈, 프롬보플라스틴, 아프로티닌, 피브리노겐, 비타민 C, 비타민 K 및 미세젤 폼(gel foam)에서 선택된 적어도 어느 하나 이상을 더 포함하는 것인 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 (b)단계의 개선된 젤라틴 용액은 인삼 추출물, 홍삼 추출물, 대나무 추출물, 편백나무 추출물, 황금 추출물 및 마누카 오일에서 선택되는 어느 하나 이상을 더 포함하는 것인 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 (c)단계의 효소 촉매는 서양고추냉이 과산화효소(HRP)인 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 (c)단계의 촉매 기질은 과산화수소(H202)인 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제의 제조방법. - 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 (d)단계의 분무는 5초 내지 1분으로 진행되는 것을 특징으로 하는 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제의 제조방법. - 제1항, 제3항 내지 제8항, 제11항 중 어느 한 항에 따라 제조된 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제.
- 제12항에 있어서,
상기 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제는 실온에서 점도가 10,000 내지 25,000cp인 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200120269A KR102473363B1 (ko) | 2020-09-18 | 2020-09-18 | 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 제조방법 및 이에 따른 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020200120269A KR102473363B1 (ko) | 2020-09-18 | 2020-09-18 | 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 제조방법 및 이에 따른 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20220037600A KR20220037600A (ko) | 2022-03-25 |
KR102473363B1 true KR102473363B1 (ko) | 2022-12-05 |
Family
ID=80935295
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020200120269A KR102473363B1 (ko) | 2020-09-18 | 2020-09-18 | 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 제조방법 및 이에 따른 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
KR (1) | KR102473363B1 (ko) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN115089767B (zh) * | 2022-05-25 | 2023-06-20 | 中山大学 | 一种大豆创伤修复材料及其制备方法与应用 |
CN115887732B (zh) * | 2022-12-23 | 2024-03-22 | 稳得希林(沈阳)生物科技有限公司 | 一种医用明胶敷料及其制备方法 |
CN116870241A (zh) * | 2023-08-03 | 2023-10-13 | 海南大学 | 一种原位形成的双网络水凝胶敷料及其制备方法与应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101091028B1 (ko) * | 2009-07-02 | 2011-12-09 | 아주대학교산학협력단 | 체내 주입형 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도 |
KR102029926B1 (ko) * | 2017-12-14 | 2019-10-08 | 금오공과대학교 산학협력단 | 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제 및 그 제조방법 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20160035129A (ko) * | 2014-09-22 | 2016-03-31 | 주식회사 제네웰 | 항균물질의 서방용 창상 피복 조성물 및 창상피복재 |
-
2020
- 2020-09-18 KR KR1020200120269A patent/KR102473363B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR101091028B1 (ko) * | 2009-07-02 | 2011-12-09 | 아주대학교산학협력단 | 체내 주입형 하이드로젤 및 이의 생의학적 용도 |
KR102029926B1 (ko) * | 2017-12-14 | 2019-10-08 | 금오공과대학교 산학협력단 | 풀루란을 이용한 하이드로젤 지혈제 및 그 제조방법 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Chia-Hui Chuang et al., "Enzymatic regulation of functional vascular networks using gelatin hydrogels.", (2015), Acta Biomater1, Vol. 9, p.85-99* |
Le Thi, Phuong, et al. "In situ forming gelatin hydrogels by dual-enzymatic cross-linking for enhanced tissue adhesiveness." Journal of Materials Chemistry B (2017) Vo. 5, pp. 757-764 |
Lee, Donghyun, et al. "Injectable hydrogel composite containing modified gold nanoparticles: implication in bone tissue regeneration." International journal of nanomedicine(2018), Vol. 13, pp. 7019-70 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20220037600A (ko) | 2022-03-25 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yang et al. | Injectable adaptive self-healing hyaluronic acid/poly (γ-glutamic acid) hydrogel for cutaneous wound healing | |
Zhang et al. | Alginate hydrogel dressings for advanced wound management | |
Yao et al. | Recent trends on burn wound care: Hydrogel dressings and scaffolds | |
Qi et al. | Progress in hydrogels for skin wound repair | |
Chen et al. | Antibacterial adhesive self-healing hydrogels to promote diabetic wound healing | |
Kaur et al. | Biomaterials-based regenerative strategies for skin tissue wound healing | |
Moura et al. | Recent advances on the development of wound dressings for diabetic foot ulcer treatment—A review | |
KR102473363B1 (ko) | 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 제조방법 및 이에 따른 스프레이형 하이드로젤 창상 피복제 | |
Sezer et al. | Biopolymers as wound healing materials: challenges and new strategies | |
ES2534770T3 (es) | Material para la curación de heridas y la reconstrucción de la piel | |
Wang et al. | Shape-recoverable hyaluronic acid–waterborne polyurethane hybrid cryogel accelerates hemostasis and wound healing | |
Sheokand et al. | Natural polymers used in the dressing materials for wound healing: Past, present and future | |
Wu et al. | Incorporation of bioglass improved the mechanical stability and bioactivity of alginate/carboxymethyl chitosan hydrogel wound dressing | |
Shao et al. | Emerging trends in therapeutic algorithm of chronic wound healers: recent advances in drug delivery systems, concepts-to-clinical application and future prospects | |
Bhar et al. | Silk-based phyto-hydrogel formulation expedites key events of wound healing in full-thickness skin defect model | |
Tang et al. | Multifunctional hydrogels for wound dressings using xanthan gum and polyacrylamide | |
Yang et al. | Injectable polylysine and dextran hydrogels with robust antibacterial and ROS-scavenging activity for wound healing | |
Zhang et al. | An extracellular matrix-inspired self-healing composite hydrogel for enhanced platelet-rich plasma-mediated chronic diabetic wound treatment | |
Huang et al. | Combination therapy of hydrogel and stem cells for diabetic wound healing | |
Yaşayan et al. | Natural polymers for wound dressing applications | |
Rong et al. | Fetal milieu-simulating hyaluronic acid-dopamine-chondroitin sulfate hydrogel promoting angiogenesis and hair regeneration for wound healing | |
Chen et al. | The role of gel wound dressings loaded with stem cells in the treatment of diabetic foot ulcers | |
Xiong et al. | Injectable hydrogels of recombinant human collagen type III and chitosan with antibacterial and antioxidative activities for wound healing | |
Du et al. | Heparin-based sericin hydrogel–encapsulated basic fibroblast growth factor for in vitro and in vivo skin repair | |
He et al. | ROS/pH dual responsive PRP-loaded multifunctional chitosan hydrogels with controlled release of growth factors for skin wound healing |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |