CN115089767B - 一种大豆创伤修复材料及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于创伤修复材料技术领域，具体涉及一种大豆创伤修复材料及其制备方法与应用。本发明提供了大豆提取液在制备创伤修复材料中的应用，并且通过大量实验证明，本发明制备的大豆提取液具有显著的羟自由基、活性氧清除效果，表现出了较好的抗氧化能力，并且还能促进细胞迁移和血管再生，同时有效抑制瘢痕成纤维细胞的增殖从而抑制瘢痕的形成，在根源上促进创伤修复和抵制疤痕的产生；动物皮肤伤口模型实验中可以促进伤口快速愈合，14天就能使伤口完全愈合，效果显著。另外的，本发明大豆提取液主要成分来源于食物大豆，安全性好，良好的生物相容性、可吸收性等优点；同时，将其制备成大豆创伤修复材料方法简单，适于大规模产业化生产。

Description

一种大豆创伤修复材料及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于创伤修复材料技术领域。更具体地，涉及一种大豆创伤修复材料及其制备方法与应用。

背景技术

皮肤是人体最大的器官，作为人体免疫系统的第一道防线包被于人体表面，构成了人体与外界环境相互作用的第一道屏障，在抵御外来物质入侵、防止物理化学损害、维持体液稳态、感受外界环境刺激、调节体温平衡等方面发挥着非常重要的作用。皮肤缺损在临床上非常常见，创伤和感染造成都可能造成创面，如意外事故、外科手术、生活环境恶化、人口老龄化、糖尿病等都会导致皮肤缺损。当没有对伤口进行及时、有效的修复时，创面长时间不愈合会造成难愈合的慢性伤口形成，十分影响患者的生活质量，同时也会给给患者家庭、医疗卫生系统及社会带来极大的负担。

目前临床治疗创伤的药物，西药常用具有消炎、抗菌、镇痛等作用的药物，如抗生素、银盐等，主要以消炎止痛抗菌为主，存在副作用较大、对深度创伤创面的促进肌肤组织再生能力差、瘢痕修复效果不理想、价格昂贵等缺点。中药常用有消炎、生肌、去热毒等作用的创伤膏，如京万红、美愈伤膏、宝湿润烧伤膏等，但均存在不少不足之处，如基本为祖传秘方或临床验方，主要凭借用药经验，缺乏系统的药理研究实验数据论证疗效。当前市场也有一些用于治疗瘢痕的药物，如激素类药物、抗肿瘤药物、P物质抑制剂、细胞因子、免疫抑制剂等，这类药物普遍价格昂贵，制作复杂，且效果不一，存在一定程度的不良反应，都极大地限制了其应用。

为了提供更多的创伤修复材料，中国专利申请CN107441550A公开了一种用于创伤修复的大豆异黄酮水凝胶敷料，先对生大豆粉进行萃取脱脂，再用有机溶剂对脱脂大豆粉进行提取，浓缩后制成水凝胶敷料，主要成分为大豆异黄酮，对皮肤温和无刺激，对烫伤皮肤具有一定的促进愈合作用。但是该水凝胶敷料制备方法复杂，步骤繁多，需要先将活性成分大豆异黄酮提取出来，不利于大规模产业化生产，并且仅证明了对烫伤皮肤具有一定的促进愈合效果，效果有限，对于其他创伤效果未知，极大地限制了其应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有创伤修复副作用大、组织再生能力差、制备方法繁杂、创伤修复效果有限等缺陷和不足，提供一种具有显著创伤修复效果、促进组织再生能力、抑制瘢痕形成的大豆提取液在制备创伤修复材料中的应用。

本发明的目的是提供一种大豆创伤修复材料。

本发明的目的是提供一种大豆创伤修复材料的制备方法。

本发明另一目的是提供大豆创伤修复材料的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明通过大量的实验数据证明，大豆提取液(soybean powder solution,SPS)具有优良的抗氧化能力，并且能促进细胞迁移和血管再生，还能高效抑制瘢痕的形成，从根源上促进创伤修复和抵制疤痕的产生，可以克服创伤治疗过程中存在的不良反应及复发等问题；对动物皮肤伤口有显著的修复效果，愈合时间短，愈合效果好。

因此，本发明要求保护大豆提取液在制备创伤修复材料中的应用，所述大豆提取液的制备方法包括以下步骤：

将大豆粉末加入水中，煮沸10～20min，冷冻干燥得提取物，置于溶剂中充分分散，离心，取上清液，过滤，即得。

进一步地，所述提取物与溶剂的质量体积比为(0.1～3):1mg/mL。优选地，所述提取物与溶剂的质量体积比为(0.5～3):1mg/mL，在该浓度范围，所述大豆提取液的创伤修复效果更好。

更进一步地，所述溶剂为液体培养基、水、PBS或生理盐水。优选地，所述液体培养基包括DMEM、MEM、RPMI 1640、F12、IMDM等液体培养基。优选地，所述水包括自来水、去离子水、蒸馏水、超纯水。

更进一步地，所述离心为2000～5000rad/min离心10～20min。

进一步地，所述过滤的滤膜孔径为0.45～0.22μm。

更进一步地，所述大豆粉末的粒径为80～200μm。

另外的，本发明还提供了一种大豆创伤修复材料，所述大豆创伤修复材料包括所述的大豆提取液和载体。

进一步地，所述载体包括水凝胶、海绵、胶原蛋白、绷带等常用创伤修复载体。优选地，所述水凝胶可以为甲基丙烯酸化水凝胶(GelMA)、透明质酸水凝胶(HAMA)等。

更进一步地，所述大豆提取液和载体的质量比为(1～5)：1000。

另外的，本发明还提供了所述大豆创伤修复材料的制备方法，包括以下步骤：

将大豆粉末加入水中，煮沸10～20min，冷冻干燥得提取物，置于溶剂中充分分散，离心，取上清液，过滤，加入载体充分负载，后处理，即得。

本发明还要求保护所述大豆创伤修复材料在制备创伤修复医用材料中的应用。

进一步地，所述创伤包括闭合性创伤和开放性创伤。

优选地，所述闭合性创伤为挤压伤、挫伤、冲击伤、烧伤、烫伤或冻伤。

优选地，所述开放性创伤为火器伤、撕裂伤、刺伤、切割伤或擦伤。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了大豆提取液在制备创伤修复材料中的应用，并且通过大量实验证明，本发明制备的大豆提取液具有显著的羟自由基、活性氧清除效果，表现出了较好的抗氧化能力，并且还能促进细胞迁移和血管再生，同时有效抑制瘢痕成纤维细胞的增殖从而抑制瘢痕的形成，在根源上促进创伤修复和抵制疤痕的产生；动物皮肤伤口模型实验中可以促进伤口快速愈合，14天就能使伤口完全愈合，效果显著。另外的，本发明大豆提取液主要成分来源于食物大豆，安全性好，良好的生物相容性、可吸收性等优点；同时，将其制备成大豆创伤修复材料方法简单，适于大规模产业化生产。

附图说明

图1为应用例1中不同浓度(0.1、0.2、0.5、1、2、3mg/mL)的大豆提取液的羟基自由基清除率统计图。

图2为应用例2中不同浓度(0.1、0.2、0.5、1、2、3mg/mL)的大豆提取液的细胞内活性氧清除效果图，比例尺为100μm。

图3为应用例3中不同浓度(0.5、1、3mg/mL)的大豆提取液和对照组SD大鼠皮肤背部伤口愈合情况图。

图4为应用例3中不同浓度(0.5、1、3mg/mL)的大豆提取液和对照组SD大鼠皮肤背部伤口愈合面积统计图。

图5为应用例1中不同浓度(0.5、1、3mg/mL)的大豆提取液和对照组在第28天时，SD大鼠皮肤背部创面组织的苏木精-伊红染色(H&E staining)、马松染色(Masson staining)和血管内皮生长因子(VEGF)的免疫组织化学(Immunohistochemical staining)染色图，比例尺为250μm。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

其中，细胞实验时，采用液体培养基作为溶剂，动物实验时采用超纯水作为溶剂。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1一种大豆提取液

所述大豆提取液的制备包括以下步骤：

将无任何添加剂的完全大豆粉末用水煮沸15min，冷冻干燥后得提取物，倒入装有溶剂DMEM或超纯水的50mL离心管中，使提取物的浓度为0.1mg/mL，涡旋振荡，超声分散，4000rad/min离心10nin后，取上清液，用0.22μm的针头式除菌过滤器过滤，滤液即为大豆提取液(浓度记为0.1mg/mL)。

实施例2一种大豆提取液

所述大豆提取液的制备包括以下步骤：

将无任何添加剂的完全大豆粉末用水煮沸15min，冷冻干燥后得提取物，倒入装有溶剂DMEM或超纯水的50mL离心管中，使提取物的浓度为0.2mg/mL，涡旋振荡，超声分散，4000rad/min离心10nin后，取上清液，用0.22μm的针头式除菌过滤器过滤，滤液即为大豆提取液(浓度记为0.2mg/mL)。

实施例3一种大豆提取液

所述大豆提取液的制备包括以下步骤：

将无任何添加剂的完全大豆粉末用水煮沸15min，冷冻干燥后得提取物，倒入装有溶剂DMEM或超纯水的50mL离心管中，使提取物的浓度为0.5mg/mL，涡旋振荡，超声分散，4000rad/min离心10nin后，取上清液，用0.22μm的针头式除菌过滤器过滤，滤液即为大豆提取液(浓度记为0.5mg/mL)。

实施例4一种大豆提取液

所述大豆提取液的制备包括以下步骤：

将无任何添加剂的完全大豆粉末用水煮沸15min，冷冻干燥后得提取物，倒入装有溶剂DMEM或超纯水的50mL离心管中，使提取物的浓度为1mg/mL，涡旋振荡，超声分散，4000rad/min离心10nin后，取上清液，用0.22μm的针头式除菌过滤器过滤，滤液即为大豆提取液(浓度记为1mg/mL)。

实施例5一种大豆提取液

所述大豆提取液的制备包括以下步骤：

将无任何添加剂的完全大豆粉末用水煮沸15min，冷冻干燥后得提取物，倒入装有溶剂DMEM或超纯水的50mL离心管中，使提取物的浓度为2mg/mL，涡旋振荡，超声分散，4000rad/min离心10nin后，取上清液，用0.22μm的针头式除菌过滤器过滤，滤液即为大豆提取液(浓度记为2mg/mL)。

实施例6一种大豆创提取液

所述大豆提取液的制备包括以下步骤：

将无任何添加剂的完全大豆粉末用水煮沸15min，冷冻干燥后得提取物，倒入装有溶剂DMEM或超纯水的50mL离心管中，使提取物的浓度为3mg/mL，涡旋振荡，超声分散，4000rad/min离心10nin后，取上清液，用0.22μm的针头式除菌过滤器过滤，滤液即为大豆提取液(浓度记为3mg/mL)。

实施例7一种大豆创伤修复材料

所述大豆创伤修复材料的制备包括以下步骤：

取0.5mg/mL的大豆提取液，将GelMA按照10％质量分数溶解其中，得到水凝胶原液，之后加入光引发剂2959(浓度为0.001mg/mL，用量为50μL/mL)，经波长为365nm的紫外光照射120s交联得到水凝胶，将水凝胶在75％乙醇溶液中浸泡20min，之后用PBS洗涤3次后即得到所述大豆创伤修复材料。

实施例8一种大豆创伤修复材料

所述大豆创伤修复材料的制备包括以下步骤：

取1mg/mL的大豆提取液，将GelMA按照10％质量分数溶解其中，得到水凝胶原液，之后加入光引发剂2959(浓度为0.001mg/mL，用量为50μL/mL)，经波长为365nm的紫外光照射120s交联得到水凝胶，将水凝胶在75％乙醇溶液中浸泡20min，之后用PBS洗涤3次后即得到所述大豆创伤修复材料。

实施例9一种大豆创伤修复材料

所述大豆创伤修复材料的制备包括以下步骤：

取3mg/mL的大豆提取液，将GelMA按照10％质量分数溶解其中，得到水凝胶原液，之后加入光引发剂2959(浓度为0.001mg/mL，用量为50μL/mL)，经波长为365nm的紫外光照射120s交联得到水凝胶，将水凝胶在75％乙醇溶液中浸泡20min，之后用PBS洗涤3次后即得到所述大豆创伤修复材料。

应用例1羟基自由基清除实验

1、实验方法：

配置80μg/mL DPPH溶液(溶质为1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，溶剂为无水乙醇)以及6个由实施例1～6不同浓度(0.1、0.2、0.5、1、2、3mg/mL)的大豆提取液。

实验组At：往200μL的DPPH溶液中分别加入200μL不同浓度的大豆提取液，振荡静置30min；

空白组Ac：往200μL的无水乙醇中分别加入200μL不同浓度的大豆提取液，振荡静置30min；

本底组Ab：往200μL的DPPH溶液中加入200μL超纯水，振荡静置30min。

将每个样品分别取200μL混合液于96孔板，设定酶标仪波长为517nm，测定每孔的光吸收值，按照公式：AA[％]＝[1-(At-Ac)/Ab]×100％算出清除率。

2、实验结果：

结果参见图1，由图可见，本发明大豆提取液具有一定的自由基清除能力，清除率呈现出浓度依赖性的特征，随着大豆粉末浓度的升高，该涂层材料的清除率不断提高；当大豆粉末浓度为3mg/mL时，自由基的清除率可达到42.36％。应用例2细胞内活性氧的清除实验

1、实验方法：

HUVEC细胞接种在24孔板中，加入含血清的培养基待贴壁，去除旧培养基，分别加入6个由实施例1～6不同浓度(0.1、0.2、0.5、1、2、3mg/mL)的大豆提取液和H₂O₂溶液(100μM)，培养24h；阳性对照组加入含血清培养基和H₂O₂溶液(100μM)，阴性对照组加入含血清培养基和H₂O₂溶液等体积的PBS溶液；

去除旧培养基，用PBS溶液清洗细胞2遍，每孔孵育300μL DCFH-DA探针20min，去除探针溶液，再用PBS溶液清洗细胞2遍，把孔板放置倒置荧光显微镜下观察荧光强度。

2、实验结果：

结果参见图2，由图可见，阴性对照组即细胞在没有任何刺激的情况下，细胞内ROS水平较低；阳性对照组即经过过氧化氢溶液(100μM)预处理后，细胞内ROS水平显著增加，在图中观察到强烈的荧光。

而经过0.1mg/mL、0.2mg/mL和0.5mg/mL的大豆提取液预处理后，荧光强度明显降低；并且，值得注意的是，当用高于0.5mg/mL浓度的大豆提取液预处理细胞时，细胞中几乎没有发现荧光，即细胞内基本没有ROS。

结果表明，大豆提取液可以清除细胞内活性氧，清除率呈现出浓度依赖性的特征，具有良好的细胞内抗氧化活性。并且该细胞内活性氧的清除结果与自由基清除的结果符合。

应用例3对创面修复速度的影响

1、实验方法：

皮肤伤口造模：选取体重180～220g的雌性SD大鼠作为研究对象，所有大鼠随机分为4组；给所有大鼠背部剃毛，通过腹腔注射戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉，全层切除大鼠背部直径为1cm的圆形皮肤；

创口上药：对照组伤口处滴加PBS溶液，实验组伤口处滴加实施例3、实施例4、实施例6不同浓度(0.5、1、3mg/mL)的大豆提取液，每次滴加的PBS溶液和大豆提取液体积相同，每天上药并拍照。

组织切片：取治疗28天后的创面皮肤组织进行免疫组化染色，在显微镜下拍照观察。

2、实验结果：

实验结果参见图3～5，由图3可见，本发明大豆提取液可以显著促进创面愈合。经过0.5mg/mL、1mg/mL和3mg/mL浓度的大豆提取液处理后，大鼠的伤口的创面闭合面积均大于对照组。其中，经3mg/mL浓度的大豆提取液处理后的实验组大鼠创面在第14天完全闭合，而对照组创面仍然明显存在；其他浓度的大豆提取液处理后的实验组大鼠创面未完全愈合，但其面积也均明显小于对照组。说明本发明大豆提取液可加速创面愈合，并且呈现一定的浓度依赖性，即一定范围内，大豆提取液浓度越高，促进创面愈合效果越好。

由图4可见，在第6天，经3mg/mL浓度的大豆提取液处理后的创面闭合率为69％，对照组创面闭合率仅为47％；第14天后，3mg/mL浓度的涂层组的大鼠伤口全部愈合，但对照组还存在明显的伤口。

由图5可见，本发明大豆提取液可促进伤口更丰富的血管形成，使得胶原纤维聚集呈平行排列，还可以促进皮肤附属物毛囊的形成。由H&E和Masson染色显示，与对照组相比，大豆提取液处理的伤口肉芽组织组织程度较高，血管分布丰富，有部分毛囊出现。采用免疫组织化学方法探讨血管内皮生长因子(VEGF)的表达时也发现，与对照组相比，大豆提取液改善了血管数量，有助于伤口愈合。

综上所述，本发明大豆提取液具有良好的生物相容性、可吸收性。所得提取液含有丰富的营养成分，可以为参与伤口修复的细胞提供养分支持，同时具有良好的抗氧化能力，优秀的促细胞迁移和促血管再生能力，不仅可以加速创面愈合，还能同时具有抑制瘢痕成纤维细胞的增殖的作用，达到高效抑制瘢痕形成的效果，从根源上促进创伤修复和抵制疤痕的产生。结合载体制成创伤修复材料后非常适合用于克服创伤、烧伤、烫伤、手术等原因导致的皮肤创伤及创伤修复后的瘢痕形成治疗过程中存在一定的不良反应及复发等问题，应用前景良好。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.大豆提取液在制备创伤修复材料中的应用，其特征在于，所述大豆提取液的制备方法包括以下步骤：

将大豆粉末加入水中，煮沸10～20min，冷冻干燥得提取物，置于溶剂中充分分散，所述提取物与溶剂的质量体积比为(0.1～3):1mg/mL，离心，取上清液，过滤，所述过滤的滤膜孔径为0.45～0.22μm，即得。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述提取物与溶剂的质量体积比为(0.5～3):1mg/mL。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述溶剂为液体培养基、水、PBS或生理盐水。

4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述离心为2000～5000rad/min离心10～20min。

5.一种大豆创伤修复材料，其特征在于，所述大豆创伤修复材料包括大豆提取液和载体，所述大豆提取液的制备方法包括以下步骤：

将大豆粉末加入水中，煮沸10～20min，冷冻干燥得提取物，置于溶剂中充分分散，所述提取物与溶剂的质量体积比为(0.1～3):1mg/mL，离心，取上清液，过滤，所述过滤的滤膜孔径为0.45～0.22μm，即得。

6.根据权利要求5所述大豆创伤修复材料，其特征在于，所述载体包括水凝胶、海绵、胶原蛋白、绷带。

7.权利要求5或6所述大豆创伤修复材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

将大豆粉末加入水中，煮沸10～20min，冷冻干燥得提取物，置于溶剂中充分分散，离心，取上清液，过滤，加入载体充分负载，后处理，即得。

8.权利要求5或6所述大豆创伤修复材料在制备创伤修复医用材料中的应用。

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