CN110548002A - 一种用于抗皮肤衰老的人源干细胞外泌体组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于抗皮肤衰老的人源干细胞外泌体组合物，包含人脂肪间充质干细胞外泌体和抗氧化剂。所述人源干细胞外泌体组合物能够阻断氧化应激衰老进程，降低氧化受损的真皮成纤维细胞的胞内活性氧含量，提高细胞增殖能力，从而恢复皮肤的正常厚度，增强皮肤的弹性，改善皮肤皱纹，减少衰老相关色素沉积，促使皮肤年轻化。并且脂肪间充质干细胞外泌体还能在一定程度上促进抗氧化剂的吸收，提高抗氧化剂在皮肤中的利用率，从而更好的抵抗氧化应激所致皮肤衰老。

Description

一种用于抗皮肤衰老的人源干细胞外泌体组合物
技术领域
本发明涉及人源干细胞外泌体的应用，属于生物技术领域，具体涉及一种用于抗皮肤衰老的人源干细胞外泌体组合物。
背景技术
皮肤位于最外层，直接与外界环境接触，是机体的第一道防线，能够防止微生物入侵、化学成分危害、紫外线损伤等外部刺激。随着护理不到位、化妆品过度使用、年龄增长等因素，很多人出现了皮肤早衰，尤其是面部肌肤，症状包括皮肤松弛，皱纹、斑点增加，角质层变薄，易过敏等，然而目前市面少见有效的抗皮肤衰老产品。
皮肤早衰的主要原因之一是氧化应激，即体内能量代谢及环境中的紫外线辐射、污染等诸多因素引发体内活性氧(ROS)大量产生，超过机体抗氧化防御机制的清除能力。过多的ROS氧化损伤DNA、蛋白质和脂质等功效性生物大分子，导致细胞间信号传递能力下降，各种皮肤细胞功能受阻，肌肤过早衰老，出现各种不适症状。比如ROS氧化脂质，形成脂褐素，在皮肤细胞中沉积，形成色斑。ROS破坏细胞膜，导致皮肤炎症因子释放，造成炎症反应，红肿过敏。ROS造成胶原蛋白生成减少和降解增多，损害皮肤屏障功能，降低皮肤保湿能力。皮肤细胞衰老进程中，ROS清除能力下降，胞内ROS含量增加，并且会表达衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)，这种变化进一步导致细胞内环境平衡的紊乱，进而影响细胞增殖再生。
外泌体(Exosome)是由细胞分泌的一种膜性囊泡，直径为30-100nm，含有DNA、蛋白质、RNA等多种成分，可以直接被靶细胞摄入，将内含物转移至效应细胞，具体作用因分泌细胞不同等原因而存在差别。目前外泌体成分和作用机制仍不明确，但作为信使广泛参与细胞间的交流活动这一点已经得到确认。最新研究表明，通过向效应细胞传递干细胞来源的生物活性物质，间充质干细胞外泌体能够修复机体损伤、病变和衰老的细胞，增强皮肤细胞的增殖和迁移活性，促进血管新生，抑制炎症反应。外泌体的组成成分均来源于细胞，避免了人工合成材料的使用带来的细胞毒性、生物相容性等问题。由于外泌体继承了细胞的磷脂、表面蛋白等物质，具有丰富的生理功能，可以提高有效成分如抗氧化剂的传递效率，实现特异性递送、跨生物屏障传递以及免疫豁免等功能。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种用于抗皮肤衰老的人源干细胞外泌体组合物。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于抗皮肤衰老的人源干细胞外泌体组合物，包含脂肪间充质干细胞外泌体和抗氧化剂。该组合物可促进氧化受损的真皮成纤维细胞恢复增殖，进而促进胶原分泌，增加皮肤厚度，淡化皱纹。同时能减少受损的真皮成纤维细胞的胞内活性氧含量，极大的降低细胞衰老的比例。并且脂肪间充质干细胞外泌体还能在一定程度上促进抗氧化剂的吸收，使抗氧化剂在皮肤中的利用率更高，能有效对抗皮肤氧化应激衰老。本发明所述人源干细胞外泌体组合物可以明显起到提高皮肤弹性，修复皮肤损伤、淡化斑点、消除细纹等抗皮肤衰老作用。
本发明所述一种用于抗皮肤衰老的人源干细胞外泌体组合物，制备过程包括干细胞的原代分离、扩大培养、外泌体获取，与抗氧化剂混合及抗衰老功效验证。具体步骤如下：
(1)脂肪干细胞的原代分离
无菌条件下，将抽脂获得的脂肪去除结缔组织，剪成1mm3左右的组织块；将剪碎的组织转移到50mL离心管中，加入等体积生理盐水进行清洗，200～300g，常温离心3～10min；去除液体部分，在脂肪颗粒中加入等体积的0.1％胶原酶溶液，恒温震荡消化30～60min，100～200g，常温离心5～10min；去除上清，取细胞沉淀，生理盐水清洗一遍，用α-MEM完全培养基重悬，接种于75cm2培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，每隔3d换液。
(2)细胞的扩大培养
将步骤1所得原代细胞培养3～7天后，细胞长满，弃去培养基，用PBS清洗一次，用0.25％胰酶消化后，1:3～1:5传代培养，用细胞工厂进行扩增，每48～72h传代一次，直至收集到足够的细胞。
(3)外泌体获得
将步骤2所得3～10代细胞按3×104个/ml接种于细胞工厂，正常培养2～3天，细胞融合度达到80％以上时，更换新鲜的不含抗生素的无血清培养基，培养3～5d后收集细胞培养上清，即条件培养基。所述条件培养基在4℃，100～300g条件下离心5～10min，弃去沉淀杂质，收集上层液体，用2000g离心20min，收集上层液体，再通过100000NWCO超滤膜进行超滤浓缩，去除小分子，最后将所得液体用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，获得外泌体。
用BCA法测定外泌体蛋白含量，浓度范围为0.03～0.3mg/mL；透射电子显微镜下可见外泌体均呈类圆形囊泡，膜性结构完整，直径集中分布在60～100nm；
所述3～10代细胞的选择是由于低代数的原代细胞具有更好的细胞因子分泌功能。
(4)抗氧化剂混合
步骤3所得外泌体溶液，与花青素、白藜芦醇、维生素A、维生素C、维生素E、类胡萝卜素等抗氧化剂中的一种或几种物理混合。
干细胞外泌体和抗氧化剂的质量比为1:3～5:1。脂肪间充质干细胞外泌体和抗氧化剂采用上述配比能更好地促进抗氧化剂的吸收，抵抗氧化应激衰老的效果更佳。
(5)抗衰老功效验证
本发明采用体外细胞实验验证脂肪间充质干细胞外泌体组合物对皮肤细胞氧化应激衰老的影响。以过氧化氢处理人真皮成纤维细胞，制备细胞衰老模型。实验分模型对照组及外泌体组合物添加组，通过以下指标检测脂肪间充质干细胞外泌体组合物对真皮成纤维细胞氧化应激衰老的影响。
1)MTT实验检测细胞增殖情况
MTT检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。用二甲基亚砜溶解细胞中的甲瓒，在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
2)DCFH-DA荧光染色观察细胞内活性氧含量
DCFH-DA本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜进入细胞内，被细胞内的酯酶水解生成DCFH。而DCFH不能通透细胞膜，从而滞留细胞内。无荧光的DCFH可被细胞内的活性氧氧化生成荧光产物DCF。其荧光强度反应细胞内的活性氧含量。
3)SA-β-gal染色观察细胞衰老状况
细胞发生衰老时，SA-β-Gal的活性水平上调，可将X-Gal催化生成深蓝色产物，从而与未衰老细胞区分。
本发明的目的还在于提供所述人源干细胞外泌体组合物在抗衰老化妆品中的应用，包括除皱，紧致，祛斑，舒缓等功效。所述化妆品可以为水剂、乳剂、膏霜、凝胶或粉剂。
本发明的目的还在于提供所述人源干细胞外泌体组合物作为抗衰老药物组分的用途。可以涂敷也可以用于注射。
本发明的有益效果在于：提供了一种用于抗皮肤衰老的人源干细胞外泌体组合物，本发明所述人源干细胞外泌体组合物中含有脂肪间充质干细胞外泌体和抗氧化剂，具有降低细胞内活性氧含量，促进细胞增殖及抗细胞衰老的作用，可在抗衰老方向的化妆品和药物中应用。
附图说明
图1为过氧化氢处理后，添加不同浓度的外泌体组合物对受损细胞的促增殖作用，组1到组3的外泌体蛋白浓度分别为15、30、60μg/ml。
图2为未处理的空白对照组，过氧化氢处理后的模型对照组与外泌体添加组的活性氧荧光染色结果。
图3为过氧化氢处理后，模型对照组与外泌体添加组的SA-β-gal衰老染色结果。
具体实施方式
实施例中除脂肪间充质干细胞外泌体以外的各原料均购买自市场。
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明所述一种用于抗皮肤衰老的人源干细胞外泌体组合物，制备过程包括干细胞的原代分离、扩大培养、外泌体获取，与抗氧化剂混合及抗衰老功效验证。具体步骤如下：
(1)脂肪干细胞的原代分离
无菌条件下，将抽脂获得的脂肪去除结缔组织，剪成1mm3左右的组织块；将剪碎的组织转移到50mL离心管中，加入等体积生理盐水进行清洗，300g，常温离心5min；去除液体部分，在脂肪颗粒中加入等体积的0.1％胶原酶溶液，恒温震荡消化45min，200g，常温离心5min；去除上清，取细胞沉淀，生理盐水清洗一遍，用α-MEM完全培养基重悬，接种于75cm2培养瓶中，置于37℃、5％CO2培养箱中进行培养，每隔3d换液。
(2)细胞的扩大培养
将步骤1所得原代细胞培养5天后，细胞长满，弃去培养基，用PBS清洗一次，用0.25％胰酶消化后，1:3传代培养。以后每48h传代一次，直至收集到足够的细胞。
(3)外泌体获得
将步骤2所得第5代细胞按3×104个/ml接种于细胞工厂，正常培养2d,细胞融合度达到80％以上时，更换新鲜的不含抗生素的无血清培养基，培养3d后收集细胞培养上清，即条件培养基。所述条件培养基在4℃，100g条件下离心5min，弃去沉淀杂质，收集上层液体，用2000g离心20min，收集上层液体，再通过100000NWCO超滤膜进行超滤浓缩，去除小分子，最后将所得液体用0.22μm无菌过滤器过滤除菌，获得外泌体。
用BCA法测定外泌体蛋白含量为0.05mg/mL；透射电子显微镜观察，可见膜性结构完整，直径集中分布在60～100nm的类圆形囊泡，即本方法收集的外泌体；
(4)抗氧化剂混合
步骤3所得外泌体溶液，与花青素、白藜芦醇、维生素C等抗氧化剂物理混合。
干细胞外泌体和抗氧化剂的质量比为1:1，其中花青素、白藜芦醇、维生素C的质量比为4：1：1。
(5)抗衰老功效验证
本发明以过氧化氢处理人真皮成纤维细胞，制备细胞氧化应激衰老模型。实验分模型对照组及外泌体组合物添加组，通过MTT实验、DCFH-DA活性氧荧光染色、SA-β-gal衰老染色等指标检测脂肪间充质干细胞外泌体组合物对真皮成纤维细胞氧化应激衰老进程的影响。
其中MTT法观察脂肪间充质干细胞外泌体组合物干预后受损人真皮成纤维细胞的增殖情况；DCFH-DA活性氧荧光染色检测脂肪间充质干细胞外泌体组合物干预后受损人真皮成纤维细胞内活性氧含量的变化；SA-β-gal衰老染色指示脂肪间充质干细胞外泌体组合物干预后受损人真皮成纤维细胞的衰老情况。具体方法及实验结果如下：
MTT实验
消化收集第6代人真皮成纤维细胞，PBS重悬，用600μmol/L过氧化氢溶液处理50min，离心收集细胞，铺96孔板，接种量6000个/孔。第二天分别加入不同浓度的外泌体组合物，外泌体蛋白含量终浓度分别为0，15，30，60μg/ml。培养48h后，加入终浓度0.5g/L的MTT，37℃孵育4h，弃去上清后，每孔加入150μL二甲基亚砜，水平摇床上震荡10min，并利用酶标仪测量490nm波长下的吸光度值。结果显示外泌体组合物对氧化受损的人真皮成纤维细胞有明显的促增殖作用，其中60μg/ml外泌体组的促细胞生长效果最佳，如图1所示。
DCFH-DA活性氧荧光染色
同上，用过氧化氢处理后的人成纤维细胞铺96板，分模型对照组与外泌体组合物添加组，外泌体组蛋白含量60μg/ml，正常培养3d后，去除细胞培养液，用无血清培养基1：1000倍稀释DCFH-DA，每孔加100ul，37℃细胞培养箱内孵育20min，无血清培养基洗涤细胞三次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，荧光显微镜下观察拍照。对比发现，过氧化氢处理3d后，衰老模型对照组细胞内仍含有大量活性氧，而添加外泌体组合物之后，细胞内的活性氧水平基本恢复正常。
SA-β-gal染色
过氧化氢处理后的人成纤维细胞铺96板，分模型对照组与外泌体组合物添加组，外泌体蛋白含量60μg/ml。正常培养3d后，吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，加入50ul固定液，室温固定15min；吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3min；吸除PBS，每孔加入100ul SA-β-gal染液。37℃孵育过夜，用保鲜膜封住96孔板防止蒸发。第二天普通光学显微镜下观察拍照。可见模型对照组衰老染色为蓝色阳性，而添加外泌体组合物之后，细胞衰老染色为阴性，说明氧化应激所致衰老过程被本发明所述外泌体组合物阻断。
以上结果说明本发明所述外泌体组合物可通过促进细胞增殖，降低胞内活性氧含量等方面阻断氧化应激衰老的进程，起到抗皮肤衰老的作用。
上述对实施例的描述是为便于该技术领域的研发人员理解和使用本发明。熟悉本领域技术的人员显然能对以上实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，不脱离本发明范畴所做出的变化都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于抗皮肤衰老的人源干细胞外泌体组合物，其特征在于，通过以下步骤制备:
(1)干细胞的原代分离:临床来源新鲜人脂肪，通过酶消化法获得脂肪干细胞，正常培养传代；
(2)扩大培养：用细胞工厂进行扩大培养，收集足够数量的细胞；
(3)干细胞外泌体的获取:待脂肪干细胞融合度达到80％以上时，更换无血清培养基进行培养，收集脂肪干细胞培养上清液，进行离心和超滤浓缩，即得干细胞外泌体；
(4)抗氧化剂的添加：干细胞外泌体与抗氧化剂物理混合；
(5)抗衰老功效验证：通过MTT实验、DCFH-DA活性氧荧光染色与SA-β-gal衰老染色等指标验证所得外泌体组合物的功效。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述干细胞不限于脂肪干细胞，还可替换为其他干细胞，如脐带间充质干细胞、骨髓间充质干细胞等。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述超滤膜为100000NW CO超滤膜。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗氧化剂包括花青素、白藜芦醇、维生素A、维生素C、维生素E、类胡萝卜素等成分中的一种或几种，干细胞外泌体和抗氧化剂的质量比为1:3～5:1。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源干细胞外泌体组合物可促进氧化受损的真皮成纤维细胞恢复增殖，进而促进胶原分泌，增加皮肤厚度，减少皱纹产生。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源干细胞外泌体组合物可有效减少氧化受损的真皮成纤维细胞的胞内活性氧含量，因此可作为抵抗氧化应激衰老的组分使用。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的人源干细胞外泌体组合物作为化妆品添加成分时，该化妆品可用于除皱，紧致，祛斑，舒缓，抗衰老等多个方面，还可以促进皮肤创面愈合。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源干细胞外泌体组合物用于制备化妆品时，所述化妆品为水剂、乳剂、膏霜、凝胶或粉剂。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源干细胞外泌体组合物在化妆品中的含量为0.5～20％。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述人源干细胞外泌体组合物可作为抗衰老药物组分使用，可以涂敷也可以用于注射。
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