CN113307851A - 一种改善皮肤生理特性的活性肽与间充质干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种改善皮肤生理特性的活性肽与间充质干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用，本发明在原有活性肽的基础上进行氨基酸替换，引入了其他常规氨基酸和非常见氨基酸，提高了抗氧化能力、促胶原分泌能力和促细胞增殖能力，在与人脐带间充质干细胞外泌体联合使用效果更为明显，可有效防护和治疗紫外线导致的皮肤损伤，促进损伤后修复过程。

Description

一种改善皮肤生理特性的活性肽与间充质干细胞外泌体在药 品或化妆品中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种改善皮肤生理特性的活性肽与间充质干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用。

背景技术

皮肤老化是目前皮肤保健和护肤化妆品研究中的重要课题，皮肤老化不仅会严重影响美观，还可能出现干燥、粗糙、毛细血管扩张、弹性降低、不规则色素沉着、脂溢性角化等具体症状。按照作用机理，皮肤老化主要分为内源性老化和外源性老化两大类，内源性老化是受基因、激素等影响的生理性过程，外源性老化主要指皮肤受外源性理化刺激所导致的老化，紫外线是导致皮肤老化的重要因素。

紫外线根据波长大小可分为3个波段，即长波紫外线UVA(320-400nm)、中波紫外线UVB(275-320nm)、短波紫外线UVC(230-275nm)，由于大气层的阻挡作用，UVC几乎全被臭氧层吸收，入射到地球表面的紫外线主要为UVA和UVB，而据研究表明相同剂量的UVB辐射对皮肤的损伤比UVA约大800-1000倍，可见对皮肤造成损伤的主要是UVB。当皮肤接受过多的紫外线照射后，皮肤组织细胞会产生氧化应激，产生过量的活性氧簇(ROS)，ROS能够破坏细胞膜的完整性和细胞内的抗氧化系统，进而引起细胞炎症、细胞凋亡及肿瘤的形成，同时过量的紫外线照射会使皮肤胶原、透明质酸、弹性蛋白降解，导致皮肤弹性变低、粗糙、形成皱纹，而且如果长时间照射紫外线，还可能引起黑色素的过度沉降，严重者可诱导皮肤癌变。

抗氧化应激是保护皮肤免受紫外线损伤的重要途径，对此研究人员提供了多种抗氧化手段，用于保护皮肤和促进损伤后修复，如我国研究人员现有提出使用红树莓(覆盆子)提取物、芦荟提取物、人参皂苷、甲基心莲碱等天然植物成分对抗紫外线引起的氧化应激，还有研究人员提出使用活性肽防护皮肤紫外损伤，如中国专利CN202011275745、CN201810524802、CN201711441206、CN201680062991等均提供了使用活性肽防护紫外损伤的技术方案，但是上述活性肽的紫外防护效果仍有待强化，尤其是如何提高对抗氧化应激效能，促进损伤后修复过程，改善皮肤胶原分泌，使皮肤迅速恢复弹性、光泽。

干细胞治疗是近年来发展迅速的新兴治疗手段，由于干细胞具有强大的多向分化能力，故可用于治疗多种疾病，尤其是在护肤品领域中，干细胞及其衍生产品，如干细胞培养液、干细胞裂解物、干细胞外泌体等均得到了广泛应用，如中国专利CN202011445563，要求保护一种含脐带间充质干细胞外泌体的组合物及其应用，在添加有脐带间充质干细胞外泌体的基础上，配合保湿剂、抗氧化剂及海藻多糖，可加速皮肤细胞的新陈代谢，恢复基底细胞抗氧化及再生能力，防止皮肤老化，增加皮肤弹性和饱满度，缩小毛孔，提升光泽；中国专利CN202010647884，要求保护一种化妆品用组合物和化妆品，其主要成分为CD200修饰的间充质干细胞外泌体，用于皮肤表面后，能够增加皮肤细胞活力，促进皮肤细胞新陈代谢，促进皮肤修复，延缓皮肤衰老；中国专利CN201910819093，要求保护一种由胎盘间充质干细胞简易制备细胞因子的方法，优化了源自胎盘间充质干细胞的细胞因子制备方法，能够大规模制备细胞因子，促进皮肤损伤后修复和皮肤保健。然而干细胞产品成分复杂，制备工艺需要进行严格管控，单独使用干细胞或其衍生品的护肤效果稳定性欠佳，使得其在护肤化妆品的应用受到一定的限制。

本发明基于上述现有技术中存在的问题，发明人筛选并获得了一种具有全新氨基酸结构的活性肽，并根据计算机模拟手段和生物信息学知识，对该活性肽中的部分氨基酸位点进行定点突变和替换，在某些位点引入非常见氨基酸，以便进一步提高对皮肤组织和细胞的修复能力，对抗紫外线等外界因素引起的氧化损伤，诱导胶原类物质形成，使皮肤恢复正常生理功能。本发明所述活性肽与间充质干细胞外泌体联用可取得令人惊奇的协同效果，使得对抗氧化应激、促进皮肤组织修复能力进一步增强。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种能够对抗紫外线对皮肤损伤的新手段，具体提供了一种具有全新结构的活性肽，并将该肽与间充质干细胞外泌体联合应用于化妆品产品中，可以对抗氧化损伤，促进皮肤组织修复，起到美容养颜作用。

本发明的详细技术方案如下：

提供了一种能够改善皮肤生理特性的活性肽，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

在前期工作中，发明人筛选并获得了具有能够改善皮肤生理特性的新型活性肽，其氨基酸序列如SEQID NO：1所示。在该基础上，发明人试图进一步提高其抗氧化能力和促进皮肤修复能力，故针对该活性肽中的部分氨基酸位点进行了定点突变研究，在各个位点分别引入了其他常见氨基酸和非常见氨基酸，随后通过初步实验筛选出了活性高、作用稳定且安全性好的新型人工活性肽，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。

提供了一种能够改善皮肤生理特性的组合物，其特征在于上述的活性肽和间充质干细胞外泌体。

进一步的，所述活性肽和间充质干细胞外泌体的质量比为1:10-10:1。

进一步的，所述间充质干细胞来源于脂肪、骨髓、脐带或胎盘。

进一步的，所述间充质干细胞来源于脐带。

进一步的，所述间充质干细胞外泌体的制备方法包括：从脐带组织中分离间充质干细胞，进行传代培养，培养3-5代，待融合度达到80％以上，收集上清液，通过离心、过滤、收集而得。

现有技术中报道了多项将间充质干细胞外泌体用于皮肤保健或美容的技术方案，但是所述技术方案大多是单独使用干细胞外泌体，所述外泌体为由生物膜包裹的微小囊泡，内部含有核酸、蛋白质、多肽、糖类以及其他干细胞代谢产物等多种活性物质，虽然营养丰富，生理活性多样，但是成分组成和作用机制复杂，单独使用往往难以达到预期的保护效果。因此，本发明中将经过改良的活性肽与间充质干细胞外泌体联合使用，即能够有效发挥二者的抗氧化应激效果，又能够利用间充质干细胞外泌体中营养丰富、易吸收利用的特点，促进损伤组织后修复过程，使得皮肤细胞或组织快速恢复生理机能。

提供了一种活性肽或相关组合物在制备化妆品中的应用。

进一步的，化妆品为膏剂、霜剂或喷雾剂。

本发明所述的活性肽或组合物可用于制备多种化妆品，包括但不限于膏剂、霜剂或喷雾剂，具体可为面膜、眼霜、面霜、精华素、洁面乳、原液、爽肤水、乳液、纯露、隔离霜、BB霜、CC霜和防晒霜中的一种或多种。

本发明的有益效果包括：

本发明提供了一种经过改良新型活性肽，在原有活性肽的基础上，在多个位点进行定点突变，引入其他常规氨基酸和非常见氨基酸，在数量众多的突变体中筛选获得了活性更高的改良活性肽，该肽能够促进皮肤上皮细胞增殖，有效对抗氧化应激引起的皮肤损伤，提高机体内抗氧化能力，促进皮肤组织修复和正常生理功能快速恢复；尤其是与间充质干细胞外泌体联用，可进一步强化抗氧化效果，有效促进皮肤细胞增殖，促进新陈代谢，延缓皮肤老化过程，保护皮肤组织免于各种损伤。

附图说明

图1HaCaT细胞存活率图；

图2紫外损伤HaCaT细胞模型中SOD变化水平图；

图3紫外损伤HaCaT细胞模型中CAT变化水平图；

图4紫外损伤HaCaT细胞模型中MDA变化水平图；

图5紫外损伤大鼠皮肤模型中不同治疗组病理切片；

图6紫外损伤大鼠皮肤模型中SOD变化水平图；

图7紫外损伤大鼠皮肤模型中HA变化水平图；

图8紫外损伤大鼠皮肤模型中MMP-1变化水平图；

图9紫外损伤大鼠皮肤模型中MMP-3变化水平图。

具体实施方式

以下非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何形式限制本发明。凡基于本发明上述内容所实现的技术均应当属于本申请要求保护的范围之中。

以下实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂生物材料、检测试剂盒，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1改善皮肤生理特性的活性肽的设计与制备

1.1改良活性肽的设计

发明人在前期工作中获得了具有改善皮肤生理活性、对抗紫外线损伤的活性肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，命名为SDH肽。

SEQ ID NO:1：EVKLGNKLSPALGEPLCTSHK

为了进一步提高其抗氧化、促增值活性，发明人基于该肽氨基酸结构和作用机制，利用计算机模拟和生物信息学手段，在相关活性位点上引入了定点突变，已其他常见氨基酸和非常见氨基酸替换已有氨基酸，所述非常见氨基酸包括但不限于β-丙氨酸(β-Ala)和其它Ω-氨基酸，如3-氨基丙酸、2，3-二胺基丙酸(Dpr)、4-氨基丁酸等；α-氨基异丁酸(Aib)、ε-氨基己酸(Aha)、δ-氨基戊酸(Ava)、N-甲基甘氨酸或者肌氨酸(MeGly)、苯基甘氨酸(Phg)、环已基丙氨酸(Cha)、正亮氨酸(Nle)、萘基丙氨酸(Nal)、4-氯苯基丙氨酸(Phe(4-C1))、鸟氨酸(Orn)、胍氨酸(Cit)、t-丁基丙氨酸(t-BuA)、t-丁基甘氨酸(t-BuG)、N-甲基异亮氨酸(MeIle)、2-氟苯基丙氨酸(Phe(2-F))、3-氟苯基丙氨酸(Phe(3-F))、4-氟苯基丙氨酸(Phe(4-F))、青霉胺(Pen)、1，2，3，4-四氢异喹啉-3-羧基酸(Tic)、β-2-噻吩丙氨酸(Thi)、2，4-二氨基庚二酸(Dbu)、2，3-二氨基丁酸(Dab)、甲硫氨酸亚砜(MSO)、p-氨基苯丙氨酸(Phe(pNH2))、N-甲基缬氨酸(MeVal)、高半胱氨酸(hCys)、高苯丙氨酸(hPhe)和高丝氨酸(hSer)、羟脯氨酸(Hyp)、高脯氨酸(hPro)、N-甲基化氨基酸、peptoid(N-取代甘氨酸)、高精氨酸(hArg)和N-乙酰赖氨酸(AcLys)。

本发明中，在上述工作方法下，共设计出358条改良的活性肽，鉴于篇幅原因，具体序列未提供。通过初步实验，包括但不限于分子实验、细胞实验和动物实验，筛选出了活性高、稳定性好、副作用低的改良活性肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，命名为LDH肽。

SEQ ID NO:2：E Aib KLYN Cit LSPWLGE hPro CITS Orn K

其中：Aib为α-氨基异丁酸，Cit为胍氨酸，hPro为高脯氨酸，Orn为鸟氨酸。

1.2改良活性肽的制备

本发明中采用固相合成法制备LDH活性肽，具体步骤如下：

(1)以Fmoc-Leu-Wang树脂为原料，称取500mg Fmoc-Leu-Wang树脂置固相合成反应管中，先用DMF冲洗3次，然后加入15mL DMF浸泡溶胀15-30min，用DMF冲洗3次，抽干待用。

(2)向树脂中加入含有150mg(0.5mmol)Fmoc-氨基酸、100mg(0.5mmol)HOBt、200mg(0.5mmol)DMAP、100μL(0.8mmol)DIC的5mL DMF溶液，置于恒温振荡器中，在常温下反应3-4h，反应后抽干反应液，用DMF洗涤树脂各3次，取少量树脂，采用茚三酮检测判断(如果树脂无色透明则反应完全)；然后加入5mL 20％哌啶/DMF溶液反应10min，脱去丙氨酸上N端的Fmoc保护，用二氯甲烷、DMF洗涤树脂各3次，取少量树脂，用茚三酮溶液检测显色。

(3)重复上述缩合方法，按照预定氨基酸序列将Fmoc-氨基酸(0.5mmol)、HOBt(0.5mmol)和DIC(100μL)溶解于5mLNMP中，依次偶联，以茚三酮试剂检测反应进程，若缩合完全，树脂则呈无色或浅黄色；若为紫红色则需要延长缩合时间或重复缩合。肽链合成结束后，用无水乙醇洗涤8-10次，然后用氮气吹干树脂，获得具有特定氨基酸序列的多肽粗品。

(4)称取30g多肽粗品，加水搅拌，用氨水调pH8.0至完全溶解，溶液用0.45μm混合微孔滤膜过滤备用。采用高效液相色谱法进行纯化，流动相系统为0.1％TFA/水溶液-0.1％TFA/乙腈溶液，77mm×250mm的色谱柱流速为90ml/min，采用梯度系统洗脱，循环进样纯化，取粗品溶液上样于色谱柱中，启动流动相洗脱，收集主峰蒸去乙腈后，得到LDH肽纯化产品。

(5)经HPLC-质谱鉴定多肽纯度均达98％以上。

实施例2脐带间充质干细胞外泌体的制备

2.1人脐带间充质干细胞(hMSCs)的分离与培养

无菌环境下采集新鲜脐带，并将脐带置于含有抗生素的无菌PBS溶液中，4℃保持。在无菌环境下，取出脐带组织，采用无菌PBS溶液反复冲洗，去除残存的血液和其他杂质。使用无菌手术剪，将脐带剪成约1mm³大小的组织块，将所得组织块用200目滤网过滤，去除较小的组织残骸和细胞碎片。配置DMEM/F12培养基，过滤除菌后，加入10％胎牛血清，然后将处理好的脐带组织块，均匀平铺于含有上述培养基的培养皿中，将培养皿放置于37℃，5％CO₂培养箱中进行培养。

采用倒置显微镜观测细胞生长状况，并视情况更好培养基，当细胞贴壁后，采用无血清培养基轻轻漂洗，除去组织残渣和细胞碎片。待培养皿中贴壁细胞铺满60％以上时，用1mL的0.25％的重组胰蛋白酶消化3-5分钟，然后加入5-10mL含血清培养基终止消化，用移液器轻轻吹打成单细胞悬液，1000rpm离心5分钟，弃上清，并用5-10mL新鲜培养基重悬，所得细胞原代脐带间充质干细胞。将原代间充质干细胞进行传代培养，培养3-5代后进行后续操作。

2.2 hMSCs外泌体的获得

取上述传代培养的hMSCs，接种于含有10％胎牛血清的DMEM/F12培养基，37℃，5％CO₂进行培养，袋细胞融合度达到80％以上后，吸出培养基，使用无菌PBS洗涤3次，更换无血清培养基培养24h，收集上清液；将所得上清2000rpm离心30min去除细胞碎片，收集上层清液，通过0.22μm无菌过滤膜过滤后取得滤液，再经10000rpm离心45min弃上清，将所得沉淀即为人脐带MSCs外泌体，采用适量PBS重悬；所得外泌体进行NTA、透射电镜观察和流式细胞仪检测，结果表明分离的外泌体能阳性表达CD90、CD63、CD73，阴性表达CD34、CD45，具有囊泡状结构，平均直径约为100-120nm，符合后续实验要求。

实施例3 LDH肽及间充质干细胞外泌体增强上皮细胞对抗氧化应激能力

3.1紫外线损伤HaCaT细胞模型制备

采用含10％FBS的DMEM培养基，37℃，5％CO₂培养箱中进行培养HaCaT细胞。取状态良好处于指数生长期的HaCaT细胞，消化，计数，将细胞接种于96孔板，接种浓度为1×10⁵个/孔，置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养12小时。用UVB(311nm)照射HaCaT细胞，照射强度为50mJ/cm²，建立紫外线损伤模型。

3.2细胞存活试验

紫外线损伤模型制备完成后，将上述细胞分为6组，分别为：空白对照组，未进行UVB照射的HaCaT细胞；其余5组为经过照射的细胞，即：PBS组，加入100μL PBS；SDH组，每孔加入100μL 10mg/mL SDH多肽；联合组1：每孔加入100μL SDH多肽和hMSCs外泌体混合溶液(其中SDH多肽和hMSCs外泌体浓度均为10mg/mL)；LDH组，每孔加入100μL 10mg/mL LDH多肽；联合组2：每孔加入100μL LDH多肽和hMSCs外泌体混合溶液(其中LDH多肽和hMSCs外泌体浓度均为10mg/mL)。置于37℃，5％CO₂培养箱中继续培养24小时。

采用CCK-8法测定细胞存活率，按CCK-8检测试剂盒说明书指示，每孔加入CCK-8溶液10μL，在5％CO₂，37℃条件下孵育2h，用酶标仪在450nm波长下测定吸光值，进而计算细胞存活率。如图1所示，在受到UVB照射后，PBS组的细胞存活率大幅度下降，说明HaCaT细胞受到严重损伤；施加SDH、LDH以及与hMSCs外泌体联用，均可以提高细胞存活率，且LDH的保护能力强于SDH，尤其是LDH与hMSCs外泌体联用后，其细胞生存率已超过70％，说明这种方式可产生明显协同作用，保护皮肤上皮细胞免于紫外线损伤，加速上皮细胞损伤后修复。

3.3抗氧化能力检测

为了检测本发明中所提供的活性肽和间充质干细胞外泌体的抗氧化能力，收取经过上述治疗后24小时的HaCaT细胞上清液(给药方式同3.2节)，按照试剂盒说明书中所述方法分别检测上清液中的超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(Catalase，CAT)和丙二醛(Malondialdehyde，MDA)水平。

SOD是细胞或机体内一类重要的抗氧化金属酶，能够催化超氧阴离子自由基歧化为氧和过氧化氢，在氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用，氧化损伤往往于SOD表达降低有关，如图2所示，HaCaT细胞经紫外线辐射后，PBS组中SOD表达量明显下降，仅约为正常水平的1/3，而施加SDH、LDH后，SOD表达量有所恢复，二者未表现出显著差异，但是SDH、LDH活性肽与hMSCs外泌体联用后，包含LDH活性肽的联合组却能够较大幅度的提高SOD的表达水平，明显高于SDH联合组，说明LDH与hMSCs外泌体联用在改善SOD表达方面具有明显优势。

CAT能够催化过氧化氢分解为氧和水，进而降低过氧化物对于细胞的损伤，在机体内CAT与SOD相配合，共同降低过氧损伤。如图3所示，经过紫外线辐射后，HaCaT细胞内的CAT表达量也大幅度下降，施用SDH、LDH活性肽后，可明显改善细胞中CAT表达水平，且LDH的作用效果强于SDH，但是SDH、LDH活性肽与hMSCs外泌体联用后，均为表现出明显差异，可见在促进CAT表达方面，上述活性肽与干细胞外泌体之间无明显协同作用。

MDA是机体内氧化物代谢的重要产物，如果其过度积累，则在一定程度上说明氧化物质积累，氧化损伤较为严重。如图4所示，经紫外线辐射后，HaCaT细胞培养液中MDA含量大幅度上述，氧化损伤程度明显，SDH、LDH活性肽及干细胞外泌体后，均可降低MDA表达量，LDH的改善程度略强于SDH，但LDH活性肽与hMSCs外泌体联用后可明显降低MDA水平，其协同作用显著强于SDH活性肽与hMSCs外泌体。

上述数据可以表明，LDH的综合抗氧化能力强于SDH，尤其是LDH与hMSCs外泌体联用的协同效果更加明显，在改善SOD表达量、MDA表达量方面具有显著优势。

实施例4 LDH肽及间充质干细胞外泌体防护大鼠模型皮肤损伤

4.1大鼠紫外线损伤模型制备及治疗

选取健康SD大鼠，SPF级，雌雄各半，体重180±20g，随机分组，每组10只，共6组，包括空白对照组、生理盐水组、SDH组、LDH组、联合组1和联合组2。各组大鼠背部毛发剃净，面积约为5cm×5cm，将大鼠置于固定平台上，紫外灯下(波长为311nm)照射，照射距离约10cm，每天照射一次，每次90min，连续处理12周，其中空白对照组不进行紫外照射。

每次照射紫外线前，于脱毛部位分别涂抹治疗药剂，具体为：空白对照组，不进行紫外线照射，也不进行任何处理；生理盐水组，涂抹500μL生理盐水；SDH组，涂抹20mg/kgSDH多肽；LDH组，涂抹20mg/kg LDH多肽；联合组1，涂抹20mg/kg SDH多肽和20mg/kg hMSCs外泌体；联合组2，涂抹20mg/kg LDH多肽和20mg/kg hMSCs外泌体，连续处理12周。

4.2大鼠皮肤病理检查

大鼠模型连续处理12周后，脱颈处理大鼠，取大鼠背部脱毛部位皮肤组织约1cm²，置于4％多聚甲酵溶液中固定48小时后石蜡包埋，制备病理切片，进行HE染色。如图5所示，正常组裸鼠皮肤姐织结构完整，厚度正常，可见角质层、颗粒层、棘细胞层和基底层细胞，表皮细胞排列整齐，细胞分层明显清晰。经紫外线照射后，表皮分层出现紊乱不清，真皮层细胞减少且排列混乱，血管扩张明显，有部分充血现象，有明显淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润。经过SDH多肽和LDH多肽治疗后，淋巴细胞和嗜酸性粒细胞浸润减少，腺体和毛囊结构逐渐恢复，皮肤损伤状况好转；在联合治疗组中，紫外损伤状况进一步弱化，皮肤分层结构清晰，真皮层中成纤维细胞增多，炎症细胞大量减少，正常生理功能开始恢复。

4.3抗氧化能力检测

大鼠模型连续处理12周后，脱颈处理大鼠，取大鼠背部脱毛部位皮肤组织，经无菌生理盐水清洗干净，取0.5g组织，用无菌手术剪将其剪碎，加入约5mL无菌PBS溶液，使用匀浆器进行充分研磨，获得组织匀浆液，4℃，4000r/min离心10分钟，收集上清进行后续检测。

按照试剂盒说明书中所述方法检测上清液中的SOD水平，如图6所述，在大鼠皮肤组织中，经过紫外线损伤后，阴性对照组(生理盐水组)中SOD含量明显下降，仅约为正常组织的一半，而经过SDH多肽和LDH多肽治疗后，SOD表达水平明显提高，且LDH作用强于SDH；多肽与干细胞外泌体联合使用的改善效果更强，SDH多肽和LDH多肽的联合治疗组中，SOD表达量均相对于单独治疗组升高，这种趋势在LDH多肽与hMSCs外泌体联用时更为明显。

4.4透明质酸分泌检测

测定皮肤组织匀浆液中的HA含量，组织匀浆液制备方法同4.3节，按照试剂盒说明书中所述方法检测上清液中的HA含量，如图7所述，在大鼠皮肤组织中，经过紫外线损伤后，阴性对照组(生理盐水组)中HA含量明显下降，这与肉眼观测到的模型组中大鼠皮肤出现褶皱、衰老症状一致，经过SDH多肽、LDH多肽以及联合干细胞外泌体治疗后，HA含量明显增加，其中SDH多肽、LDH多肽以及SDH多肽联合hMSCs外泌体的促进HA分泌作用类似，各组之间差异不明显，而LDH多肽与hMSCs外泌体联合却可大幅度提高HA含量，明显高于其他治疗组。

4.5 MMP-1和MMP-3表达水平检测

基质金属蛋白酶1(Matrix metalloproteinase-1，MMP-1)和基质金属蛋白酶3(Matrix metalloproteinase-1，MMP-3)是导致皮肤出现皱纹等衰老症状的主要酶类，也与其他金属蛋白酶合成和分泌密切相关，可降解胶原，引起皮肤松弛，本发明中采用酶联免疫分析(ELISA)试剂盒适当皮肤组织匀浆中的MMP-1和MMP-3水平，具体操作方法按照试剂盒说明书进行。

如图8所示，经紫外线照射后，皮肤中MMP-1表达水平显著升高，达到正常水平2被以上，虽然采用SDH多肽、LDH多肽和联合hMSCs外泌体治疗后，MMP-1表达水平均有所降低，在单独使用中，LDH的疗效略低于SDH，而当联合hMSCs外泌体后，LDH联合组却展示出了更大的抑制MMP-1分泌能力。

如图9所示，由于紫外线辐射的影响，模型组大鼠皮肤组织中MMP-3表达量上升，而经过治疗后MMP-3的过度表达被明显抑制，相比于SDH多肽，LDH多肽的抑制效果相当明显，但是在与hMSCs外泌体联用时，未展示出更强的抑制作用。

序列表

<110> 北京戴域生物技术有限公司

<120> 一种改善皮肤生理特性的活性肽与间充质干细胞外泌体在药品或化妆品中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Glu Val Lys Leu Gly Asn Lys Leu Ser Pro Ala Leu Gly Glu Pro Leu

1 5 10 15

Cys Thr Ser His Lys

20

Claims (8)

1.一种能够改善皮肤生理特性的活性肽，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种能够改善皮肤生理特性的组合物，其特征在于包括权利要求1中所述的活性肽和间充质干细胞外泌体。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述活性肽和间充质干细胞外泌体的质量比为1:10-10:1。

4.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞来源于脂肪、骨髓、脐带或胎盘。

5.根据权利要求4所述的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞来源于脐带。

6.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于，所述间充质干细胞外泌体的制备方法包括：从脐带组织中分离间充质干细胞，进行传代培养，培养3-5代，待融合度达到80％以上，收集上清液，通过离心、过滤、收集而得。

7.一种如权利要求1中所述的活性肽或权利要求2-6所述的组合物在制备化妆品中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述化妆品为膏剂、霜剂或喷雾剂。

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