CN111732634B

CN111732634B - 抑制黑色素细胞增殖的地龙活性肽在制备药物或化妆品中的用途

Info

Publication number: CN111732634B
Application number: CN202010780281.2A
Authority: CN
Inventors: 林杰彬; 张海涛; 李欣
Original assignee: Guangzhou Wanqian Vermicelli Cosmetics Co ltd
Current assignee: Guangzhou Wanqian vermicelli Cosmetics Co.,Ltd.
Priority date: 2020-08-06
Filing date: 2020-08-06
Publication date: 2021-03-19
Anticipated expiration: 2040-08-06
Also published as: CN111732634A

Abstract

本发明涉及抑制黑色素细胞增殖的地龙活性肽在制备药物或化妆品中的用途，通过细胞实验证明了所述的活性肽具有较强的抑制黑色素细胞活性的效果。将所述活性肽制备成为爽肤水验证了其生物安全性以及相应的美白效果，具有较好的市场应用前景。

Description

抑制黑色素细胞增殖的地龙活性肽在制备药物或化妆品中的用途

技术领域

本发明属于药物领域，更具体的，涉及一种抑制黑色素细胞增殖的地龙活性肽在制备药物或化妆品中的用途。

背景技术

一直以来,美白祛斑都是人们所热切关注的话题。人们希望通过美白护理品的使用而得到白皙、光洁的皮肤,更有一些利用功能型美白化妆品来减轻老年斑、黄褐斑等色素沉积。因此，美白祛斑类化妆品一直是人们所追求的，其市场占有率很大。美白类化妆品从物理性的遮盖美白到物理性和化学性剥离，再到干扰和阻断黑色素正常的新陈代谢，发展到“协同效应”美白。

基于人类皮肤结构和黑色素形成途径，现代美白化妆品发挥功效的途径有抑制优黑素和褐黑素的生成和沉积，主要通过抑制黑色素细胞增殖，抑制黑色素形成过程中酪氨酸酶、多巴互变酶和DHICA 氧化酶活性。黑色素细胞毒性剂，如从洋甘菊提取液中发现的内皮素拮抗剂，是抑制黑色素细胞生成的物质，能够竞争性地抑制内皮素与黑色素细胞膜受体结合，抑制黑色素细胞的分化、增殖，从而达到抑制紫外辐射引起黑色素生成的目的。研究表明，新型Brassocattleya 兰花提取物能够有效抑制黑素细胞增殖，将其用入化妆品配方，将对皮肤增白和增亮有明显作用。

最新研究表明，谷胱甘肽衍生物有美白皮肤的作用，并增强皮肤渗透性和经皮吸收，从而改善皮肤色度和状况。与此同时加速角质层脱落，以避免色素沉着。另外，提高机体超氧化歧化酶(SOD) 活性和清除多余超氧自由基对皮肤也起到很好的辅助美白和祛斑作用。

随着生活和文化水平的提高，化妆品越来越受到人们的重视。含有天然活性成分的化妆品以其功效好、副作用小、更具安全性获得越来越多人的青睐，研究开发运用于化妆品中的天然活性成分成为化妆品产业可持续性发展的一个重要环节。比如天然植物提取液。美国和日本已将100多种天然植物提取液用于化妆品中，如天然植物油(香精、护肤)、芦荟提取物(杀菌、美白)、绿茶提取物(抗氧化、抗衰老)、银杏提取物(清除氧自由基)、葡萄籽提取物(清除氧自由基)、小麦提取物(抗老化)、海藻提取物(清除自由基、抗老化、保湿、防晒、减肥)等。维生素是人体成长和健康的必需成分，也是皮肤护理不可缺少的元素，如维生素A(延缓皮肤衰老)、维生素B3(活血抗皱)、维生素BS(润发和护发)、维生素B6(抗紫外线、去痘)、维生素C(去斑美白、抗氧化)、维生素E(去除自由基、防晒、生发、护肤、消炎)、维生素K(治黑眼圈)等。随着消费者美容、健康意识的增强，以及人们对维生素生化作用及其对皮肤功效的认识不断深化，维生素在化妆品中的应用将日趋普及。另外，肝素、各类神经酞胺、核酸类物质和具有特殊功能的酶类的功效也逐渐被人们认识，目前已有多种应用于化妆品中。天然活性物质具有多重效能、药效持久稳定、适用面广、安全、基本无副作用或副作用很小。天然活性化妆品顺应回归大自然、科学美容和科学护理的消费趋势，具有很大的发展潜力。

蚯蚓是常用中药，名为地龙，其蛋白质总量约占其干质量的45. 90% - 68. 11%，是加工获得肽类物质的理想原料。研究表明，蚯蚓具有溶栓和抗栓、抗癌、平喘、增强免疫力、促进伤口愈合及促进小鼠胚胎成纤维细胞( NIH3T3) 增生等作用。此外，蚯蚓经酶解获得的多肽提取物具有抗氧化、增强免疫、抗菌等生理活性。刘廷强等，考察蚯蚓小分子多肽提取物( LMWPEE)在质量浓度为200 和400 mg /L 时，可显著促进HSF分泌Ⅰ型前胶原蛋白，对HSF 细胞活性有促进作用。但还未见蚯蚓提取物用于抑制黑色素细胞增殖以及用于化妆品美白以及相应的药物制备中去。

发明内容

本发明克服了现有技术的缺陷，提供了一种改进的美白祛斑的药物或者化妆品。

具体的，本发明提供一种地龙源的活性肽。所述活性肽具有抑制黑色素细胞增殖的活性，还具有祛除人体中性粒细胞系统中的活性氧的功能，由于活性氧(ROS)是体内一类氧的电子还原产物，过多的ROS会引起自由基链式反应、脂质氧化等，对细胞有损害作用，因此，该活性肽还具有抗氧化功能。

进一步的，本发明提供了所述活性肽的氨基酸序列，所述序列如SEQ ID NO：1所示。

本发明更进一步的提供所述活性肽的分离制备方法，包括将鲜蚯蚓（地龙）置于纯净水中让其尽量吐出体内的食物残渣，洗净后捣碎。向鲜蚯蚓捣碎液中加入纯净水，分步骤进行酶解：（1）胃蛋白酶于35℃下pH3.0条件下按照酶底比5%反应4h；85℃灭酶10min；（2）碱性蛋白酶40℃下pH8.5条件下按照酶底比4%反应3h；85℃灭酶10min；（2）碱性蛋白酶40℃下pH8.5条件下按照酶底比4%反应3h；85℃灭酶10min；（3）（2）胰蛋白酶42℃下pH8.0条件下按照酶底比2%反应4h；85℃灭酶10min。反应结束后，5000rpm，离心20min，得到酶解液。将酶解液分别用10K, 5K,3K的超滤组件进行超滤，收集3K以下分子量的组份，并迅速冷冻干燥。将3K以下组分的多肽混合液选择葡聚糖 G-15 凝胶填料进行分离纯化。

本发明进一步的，提供一种药物组合物，所述药物含有SEQ ID NO:l的活性肽以及其他要用载体。

进一步的，本发明还提供一种美白化妆品，所述化妆品中含有SEQ ID NO:l的活性肽以及其他美白组分。

更进一步的，本发明还提供了SEQ ID NO:l的活性肽在制备抑制黑色素细胞增殖的药物或化妆品中的用途。

进一步的，本发明还提供一种美白祛斑保湿水，其组成为甘油5% wt，熊果苷1%wt，1%透明质酸 5% wt，丝氨酸0.25% wt，乙醇2% wt，SEQ ID NO：1多肽0.2% wt，余量为超纯水配置成为保湿水，备用。

有益效果

本发明通过从地龙中分离并筛选获得了特异性抑制黑色素细胞增殖的活性肽，通过细胞实验证明了所述的活性肽具有较强的抑制黑色素细胞活性的效果。将所述活性肽制备成为爽肤水验证了其生物安全性以及相应的美白效果，具有较好的市场应用前景。

附图说明

图1 多肽混合液针对黑色素细胞的增殖抑制效果图

图2 葡聚糖 G-15 凝胶填料分离纯化结果图

具体实施方式

本发明公开了一种多肽制备方法和应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明所述方法和应用已经通过实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述提取物及其提取方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

以下就本发明所提供的方法和应用做进一步说明。

实施例1 活性多肽的筛选及制备

将鲜蚯蚓置于纯净水中让其尽量吐出体内的食物残渣，洗净后捣碎。向2 kg 的鲜蚯蚓捣碎液中加入2倍质量的纯净水，分步骤进行酶解：（1）胃蛋白酶于35℃下pH3.0条件下按照酶底比5%反应4h；85℃灭酶10min；（2）碱性蛋白酶40℃下pH8.5条件下按照酶底比4%反应3h；85℃灭酶10min；（2）碱性蛋白酶40℃下pH8.5条件下按照酶底比4%反应3h；85℃灭酶10min；（3）（2）胰蛋白酶42℃下pH8.0条件下按照酶底比2%反应4h；85℃灭酶10min。反应结束后，5000rpm，离心20min，得到酶解液。

将酶解液分别用10K, 5K,3K的超滤组件进行超滤，超滤压强小于0.25 MPa，进而得到10K以上，5-10K, 3-5K和3K以下四个分子量的组份，分别收集并迅速冷冻干燥。对不同分子量范围的多肽混合液分别检测混合液针对黑色素细胞增殖的抑制活性，经鉴定，如图1所示，发现3K以下分子量的多肽混合液针对黑色素细胞的增殖抑制效果最高，有进一步分离纯化的意义，因此，将3K以下组分的多肽混合液进行下一步的分离纯化。

将前述3K以下组分选择葡聚糖 G-15 凝胶填料进行分离纯化。柱体积180 mL，上样量150mg，上样浓度50 mg/mL，流速0.35 mL/min，流动相为超纯水，使用自动分布收集器，每7 min 收集一管。用紫外分光光度计在 280 nm 下测定吸光度值，

该组份在 280 nm 下分离效果较好，由图2可知，按 280 nm 检测结果收集分离产物为2部分，设为 M1和M2，将这二个组份冷冻干燥后，其中M2的产物最多，选取其进行质谱鉴定。MS分析条件:ESI离子源,正离子检出模式,喷雾电压为3.8kV,鞘气流速为45arb,辅助气流速为10arb,吹扫气流速为5arb。毛细管温度为300℃,毛细管电压为50V,锥孔电压为100V,扫描范围为200-2000m/z,分辨率为200000。通过质谱分析，氨基酸组成分析等方法分析得到M1的氨基酸序列为PWFYRMSEAVRSSRPHSRRW（SEQ ID NO：1所示），其分子量大小为2.59 kDa。采用固相合成的方法，合成所述的多肽，用于后续实验。

实施例2 多肽对黑色素细胞的抑制活性检测

取对数生长期黑色素细胞PIG1细胞，用0.05%胰蛋白酶+0.53 mmol/L EDTA溶液消化后，以新鲜培养液配成密度为5×10³ 个/mL的细胞悬液，接种于96孔细胞培养板，每孔180 μL，于CO₂培养箱中孵育过夜。每个样品设置4个样品质量浓度梯度，每个梯度重复3次。在96孔细胞培养板中，加入样品稀释液，并以PBS补充至20 μL，使细胞培养板中的样品(多肽)终质量浓度分别为1ug/L ，1 mg/L，10 mg/L，100 mg /L；空白对照孔加入20 μL PBS，混匀。将细胞板置于CO₂培养箱中孵育48 h后，吸去培养液，每孔加入100 μL PBS、5 mg/mL的MTT溶液10μL，再将其置于CO₂培养箱中孵育4-6 h，每孔加入100μL SDS溶液后继续于CO₂培养箱中孵育过夜。用酶标仪于570 nm处测定其吸光度，计算细胞增殖抑制率。结果如下表1所示：

表1 多肽对黑色素细胞的抑制率（%）

浓度	抑制率（%）
		对照（PBS）	0.01
1ug /L	7.47±0.21
		1mg /L	35.66±1.41
10mg /L	59.31±3.27
		100mg /L	96.56±5.19

从表1可以看出，多肽在浓度提高后对黑色素细胞PIG1增殖都有一定的抑制作用。特别是浓度达到100mg/L的浓度后，对于细胞增殖抑制率达到95%以上，具有较好的抑制效果。

实施例3 祛除人体中性粒细胞系统中的活性氧试验

活性氧(ROS)是体内一类氧的电子还原产物，过多的ROS会引起自由基链式反应、脂质氧化等，对细胞有损害作用，因此，ROS含量的多少是反应细胞氧化损伤程度的一个重要标志。选取生长状态良好的中性粒细胞，以1×10⁶个/mL接种于6孔板中，每孔2mL，待细胞培养24h后，小心吸弃废液，加入100mg/L的多肽，每孔2mL。空白对照组及H₂O₂组加入等体积的培养液，置于37℃、5％CO₂及饱和湿度的培养箱中孵育24h。24h后，吸弃原培养液，空白对照组加入2mL 新鲜培养液，H₂O₂组以及多肽组分别加入2mL 150μM的H₂O₂。培养4h后，吸弃细胞培养液，各组加入10μM含 DCFH-DA的培养液，37℃孵育30min。孵育结束后，细胞用25％胰酶消化约1min，1min后加入含胎牛血清的培养液终止消化。小心将贴壁细胞吹打消化后，将细胞悬液吸出，移至离心管中，以1500r/min转速，离心5min。离心结束后，小心吸出上清液，加入1mLPBS小心吹打混匀，以1500r/min转速，离心5min，弃去上清液，将细胞沉淀用1mLPBS重悬，用于检测。设置荧光分光光度计激发波长为485nm，发射波长为525nm，检测荧光强度。结果如表2所示。

表2 多肽去除人体中性粒细胞系统中活性氧实验结果(* P＜0.01)

组别	细胞内ROS（%）
		空白对照组	100%
H<sub>2</sub>O<sub>2</sub>组	244.7±29.32<sup>*</sup>
		多肽组	123.5±18.75<sup>*</sup>

从表2的去除人体中性粒细胞系统中的活性氧试验结果可以看出，空白对照组的细胞内ROS为100％，而H₂O₂组的细胞内ROS为（244.7±29.32）％，多肽组的细胞内ROS为（123.5±18.75）％，可见，本发明多肽具有显著的祛除人体中性粒细胞系统中的活性氧作用。

实施例4 美白祛斑保湿水的制备及安全性检测

按照甘油5% wt，熊果苷1% wt，1%透明质酸 5% wt，丝氨酸0.25% wt，乙醇2% wt，SEQ ID NO：1多肽0.2% wt，余量为超纯水，配置成为保湿水，备用。

选择10名志愿者作为受试对象，直接涂约0.5 mL 上述保湿水于皮肤上，并覆盖上两层纱布( 2.5 cm × 2.5 cm) 和一层玻璃纸，然后以无刺激性绷带和胶布固定．另一侧皮肤则作为对照．进行封闭试验，敷用4 h．结束后的残留物用无刺激性溶剂或温水清除，清除受试物后的1、24、48 和72 h 观察涂抹部位的皮肤反应，对皮肤反应的评分按表3进行，刺激强度以各观察时间点最大积分的平均值进行评价．

表3皮肤刺激性反应评价表

皮肤刺激强度分级：0 ～＜ 0.5 无刺激性；0.5 ～＜ 2.0 轻刺激性；2. 0 ～＜ 6. 0 中刺激性；6.0 ～ 8.0 强刺激性。结果显示，本发明制备得到的保湿水皮肤刺激强度分级为无刺激性强度，适合人类皮肤使用。

实施例5 美白效果验证

受试对象纳入者标准：按自愿原则选择 22-54岁身体健康，经问诊合格均可进行试用观察。受试对象排除者标准：有严重系统疾病、免疫缺陷或自身免疫性疾病者；有活动性过敏性疾病者；妊娠或哺乳期妇女；试验期问全身应用激素类、免疫制剂类药物者；未按规定使用受试物或资料不全者不符合纳入标准。

选择健康人20名，年龄 22-54岁，与受试对象签订知情同意书，测定其脸颊的色素含量及皮肤颜色，然后发放受试的实施例4的保湿水（以实施例4中不加多肽的保湿水作为对照1，以纯净水作为对照2）。受试对象连续使用，每天使用 1次，洁面后使用。在实验期间停用其他美白化妆品。连续使用 30d后，再用同样方法测定各功效指标。同时询问志愿者使用受试样品后自我感觉及有无过敏现象等。采用自身前后对比。测定环境：测试环境温度：25℃，湿度：50％，使用 Lab色度系统光谱光度计测量皮肤颜色的变化：连续测试 3次，取平均值。同时使用 MEX AMETER MX1 8皮肤色素仪测皮肤黑红色素含量：连续测试 3次，取平均值。结果如下表4所示。

表4 皮肤黑色素含量变化及皮肤颜色变化结果

组别	黑色素含量（相对含量）	皮肤色度（L值）
			加多肽的保湿水	27.52±1.43%	69.44±3.27
不加多肽的保湿水	42.36±2.01%	66.91±2.78
			纯净水	100%	64.51±3.13

从表4可以看出，加入了多肽的保湿水对于皮肤黑色素含量具有较好的降低效果。而且，由于皮肤色度 L 值越大，表示皮肤颜色越浅。产品使用第30d可以看出，能够较好的是皮肤变白，效果显著。

序列表

<110> 北京欣颂生物科技有限公司

<120> 抑制黑色素细胞增殖的地龙活性肽在制备药物或化妆品中的用途

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Pro Trp Phe Tyr Arg Met Ser Glu Ala Val Arg Ser Ser Arg Pro His

1 5 10 15

Ser Arg Arg Trp

20

Claims

1.一种具有抑制黑色素细胞增殖功能以及具有抗氧化功能的地龙活性肽，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种药物组合物，所述药物组合物含有权利要求1所述的地龙活性肽以及药用载体。

3.权利要求1所述的地龙活性肽在用于制备抑制黑色素细胞增殖的药物中的用途。

4.权利要求1所述的地龙活性肽在用于制备抑制黑色素细胞增殖的化妆品中的用途。

5.一种美白祛斑保湿水，其特征在于：其组成为甘油5% wt，熊果苷1% wt，1%透明质酸5% wt，丝氨酸0.25% wt，乙醇2% wt，权利要求1所述的地龙活性肽0.2% wt，余量为超纯水。