CN115232194A - 一种地龙中抗氧化活性多肽及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种地龙中抗氧化活性多肽及其制备方法与应用。该方法包括如下步骤：干燥至恒重的地龙，粉碎过筛；通过碱溶酸沉法制备地龙蛋白，配制1.25％(w/v)的蛋白溶液；加入碱性蛋白酶，酶解3小时；灭酶活，加入胃蛋白酶，酶解2小时；加入胰酶，酶解2小时，灭酶活。酶解产物过3kD超滤膜，收集<3kD的组分得到酶解地龙多肽，通过液质联用的方法解析多肽序列，经过PeptideRank活性评分、活性验证，筛选出具有良好抗氧化活性的小肽。本发明可为中药地龙中蛋白资源的开发利用以及地龙蛋白发挥抗氧化活性的物质基础提供一定指导，为其在功能性食品领域中的应用提供依据，为食源性抗氧化剂的开发提供新资源。
Description
技术领域
本发明涉及生物活性肽及其制备方法与应用，具体涉及一种具有抗氧化活性地龙小肽及其酶解制备方法与应用。
背景技术
地龙，即蚯蚓，是我国重要的中药材之一，已有众多研究表明地龙有降血压、抗血栓、平喘止咳、促进创面愈合、抗肿瘤等药理作用。过去，常以水煎提取或者打粉直接口服的方式获取地龙中的功效成分，但这两种方法具有利用率低、服用剂量大的局限性。地龙蛋白在2009年被国家卫生部认定为“新资源食品”。目前已有多项研究表明地龙发挥降压、溶栓、抗癌等生物功效与其蛋白质及多肽有关。有研究从地龙中提取单一的蛋白制成制剂，也有研究通过可控酶解的方式制备地龙源生物活性肽，但其实蛋白片段或肽经过胃肠道后会被胃肠道中的消化酶进一步水解为小分子肽和氨基酸，然后经过小肠吸收进入血液循环，因此，蛋白酶解物真正在体内发挥各种生理活性的是其经胃肠道消化所产生的肽，对地龙蛋白酶解物经胃肠道消化得到的活性肽的研究具有实际意义。
氧化应激可导致许多慢性疾病，如心血管疾病、阿尔茨海默病和癌症等。活性氧(ROS)的过度积累会引起氧化应激，从而导致对细胞生物分子的氧化损伤，例如DNA断裂、蛋白质变性和生物膜脂质过氧化等。已有科学研究表明，补充抗氧化剂可能有助于维持自由基损伤和氧化防御之间的平衡。食源性抗氧化肽因其安全、高效、稳定的特点受到普遍关注。
已有研究报道地龙蛋白水解制备得到的小肽具有体内抗氧化活性，但是尚未出现关于地龙蛋白水解物经胃肠消化后生成的抗氧化肽的报道。因此，在外源酶酶解的基础上探究地龙蛋白在体内发挥活性的物质基础，最终得到抗氧化活性优异的地龙中抗氧化活性多肽，可为深度利用地龙蛋白资源提供新途径。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术中的不足，提供一种具有抗氧化作用地龙多肽的酶解制备方法与应用。本发明能实现原料的高效利用，具有高效、安全、简单可控等制备特点。
本发明第一方面是提供一种地龙中抗氧化活性多肽地制备方法，以ABTS 自由基清除能力和ORAC值作为所述抗氧化肽的评价指标，由以下方案实现：
(1)地龙干体粉碎过筛，加水溶解，溶解比例为4-10g：100mL，溶液pH 调节至9-12，磁力搅拌辅助提取2h-4h，取上清液，调pH至3-6，离心取沉淀，得地龙蛋白。
(2)将步骤(1)的地龙蛋白用蒸馏水配制成溶液，比例为1-5g：100mL，加入蛋白酶，控制pH值在7-9、温度在45-55℃，酶解2-5小时，灭酶活；再将 pH调至1.5-5,加入胃蛋白酶，温度37℃，酶解1-3h，将pH调至7-9,加入胰酶，温度37℃，酶解1-3h，煮沸10min，结束反应，离心，收集上清液，上清液过截留量3kD的超滤膜，得到分子量<3kD的酶解多肽。
优选地，在步骤(1)中，地龙粉与蒸馏水地比例为1：20(w/v)。
优选地，在步骤(1)中，磁力搅拌辅助提取优选4小时。
优选地，在步骤(2)中，所述蛋白酶为碱性蛋白酶。
优选地，步骤(1)和步骤(2)中所述调节pH值为9-12，控制pH值在7-8.5, 将pH调至7-9具体为：用1mol/L的NaOH溶液将pH调节至所需pH值；所述上清液pH值调至3-5，将pH调至1.5-5具体为用1mol/L的HCl溶液将pH调节至所需pH值。
优选地，所述碱性蛋白酶的酶活力为258U/mg；所述胃蛋白酶为猪胃黏膜蛋白酶，酶活力为250U/mg；所述胰酶为猪胰腺胰酶，酶活力为8U/mg。
优选地，在步骤(2)中，所述碱性蛋白酶酶解时间为2小时。
优选地，在步骤(2)中，所述胃蛋白酶酶解时间为2小时。
优选地，在步骤(2)中，所述胰酶酶解时间为2小时。
优选地，在步骤(2)中，所述碱性蛋白酶添加量250U/mL；所述胃蛋白酶添加量为2000U/mL，；所述胰酶添加量为100U/mL。
本发明第二方面是提供一种上述制备方法得到的分子量<3KDa的抗氧化多肽。
一种具有抗氧化活性多肽应用于制备具有抗氧化功能性食品或抗氧化护肤品。
本发明的原理：地龙蛋白/多肽产品以口服地方式进入体内，经人体消化酶：胃蛋白酶、胰酶等酶解消化，在小肠被吸收利用，发挥功效。以不同水解酶为催化剂，对地龙蛋白进行酶解，得到地龙活性多肽，对地龙活性多肽模拟胃肠消化，消化产物活性无明显降低，通过液质联用、抗氧化肽活性评分、固相合成、活性验证等系列步骤筛选出具有较强抗氧化活性的小肽，其氨基酸序列为 ATSGFFVY、HCFVLY、HLASGWY、HRYSDF、HYANMY。
与现有技术相比，本发明的优势在于：
本发明所制备的抗氧化活性多肽为小分子化合物，容易进入血液循环系统发挥抗氧化活性，安全性高、稳定性高。本发明所制备的多肽可为解析地龙蛋白酶解物经过人体消化后发挥活性的物质基础提供参考。本发明所制备的抗氧化活性多肽不含精氨酸、赖氨酸等，不易在胃肠道被消化酶水解，体外实验表明其具有良好的抗氧化活性。该小肽为首次从中药地龙中分离鉴定，为充分利用地龙提供了新途径，为食源性抗氧化剂的开发提供新资源。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步地具体详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
以下各实施例中，体外抗氧化活性测定地方法如下：
(1)ABTS自由基清除率的测定
在离心管中依次加入300μL样品溶液和3mL ABTS+·，将反应液漩涡震荡混合均匀，室温避光反应6min后于734nm处测量吸光值，以trolox作阳性对照，以蒸馏水作空白对照。
ABTS·+清除率(％)＝[1-OD样品/OD空白]×100
(2)DPPH自由基清除率的测定
配制0.2mM的DPPH.乙醇溶液，取样品溶液2mL，加入2mL DPPH.乙醇溶液，振荡摇匀，室温下避光反应30min，以溶剂作空白对照于517nm处测定吸光值。
DPPH自由基清除率(％)＝[1-(OD样品—OD空白)/OD空白]×100
(3)ORAC值的测定
用pH为7.4的PBS缓冲液配制168nmol/L的荧光素钠溶液、24.16mmol/L 的AAPH溶液及不同浓度的样品溶液。在96孔板中分别加入各浓度的样品溶液 25μL、荧光素钠溶液75μL，37℃预热5分钟后迅速在各孔中加入100μL AAPH 溶液启动反应，在37℃以激发波长485nm、发射波长538nm连续2小时测定各孔荧光强度，每5min读取一次荧光值。以Trolox作为阳性对照，同时设置只加荧光素钠溶液的阴性对照组、只加PBS溶液的空白组。
ORAC值＝[(AUCSample-AUC+AAPH)/(AUCTrolox-AUC+AAPH)]×(molarity of Trolox/molarity of sample)
实施例1
(1)地龙蛋白的制备
干地龙粉碎过筛，地龙粉以1：15(w/v)的比例溶解于蒸馏水中，制成地龙粉溶液，用1mol/L的NaOH溶液将混合溶液体系pH值调至10，超声细胞粉碎20 分钟，磁力搅拌提取2小时后，离心后，取上清液。用1mol/L的HCl将上清液pH值调至3.5，于4℃静置2小时，离心，弃去上清，得沉淀蛋白。沉淀蛋白取出用蒸馏水复溶，将pH调节至7.0，冷冻干燥后的得地龙粗蛋白。
(2)多肽的制备
将粗蛋白用水溶解配制成1％(w/v)的蛋白溶液，碱性蛋白酶添加量为150U/mL，在pH为7.5、温度为55℃的条件下酶解3小时，随后沸水浴灭酶活，终止酶解反应；将pH调至3，加入胃蛋白酶(2000U/mL)，反应温度为37℃，酶解2 小时，将pH调至7，加入胰酶(100U/mL)，反应温度为37℃，酶解2小时，沸水浴终止酶解反应。酶解产物通过3KDa的滤膜，收集小于3KDa的组分得到酶解多肽。
实施例2
(1)地龙蛋白的制备
干地龙粉碎过筛，地龙粉以1：20(w/v)的比例溶解于蒸馏水中，制成地龙粉溶液，用1mol/L的NaOH溶液将混合溶液体系pH值调至10.5，超声细胞粉碎20分钟，磁力搅拌提取2小时后，离心后，取上清液。用1mol/L的HCl 将上清液pH值调至4.0，于4℃静置2小时，离心，弃去上清，得沉淀蛋白。沉淀蛋白取出用蒸馏水复溶，将pH调节至7.0，冷冻干燥后的得地龙粗蛋白。
(2)多肽的制备
将粗蛋白用水溶解配制成1.20％(w/v)的蛋白溶液，碱性蛋白酶添加量为 200U/mL，在pH为8.0、温度为55℃的条件下酶解3小时，随后沸水浴灭酶活，终止酶解反应；将pH调至3，加入胃蛋白酶(2000U/mL)，反应温度为37℃，酶解2小时，将pH调至7，加入胰酶(100U/mL)，反应温度为37℃，酶解2 小时，沸水浴终止酶解反应。酶解产物通过3KDa的滤膜，收集小于3KDa的组分得到酶解多肽。
实施例3
(1)地龙蛋白的制备
干地龙粉碎过筛，地龙粉以1：25(w/v)的比例溶解于蒸馏水中，制成地龙粉溶液，用1mol/L的NaOH溶液将混合溶液体系pH值调至11，超声细胞粉碎20分钟，磁力搅拌提取2小时后，离心后，取上清液。用1mol/L的HCl将上清液pH值调至4.5，于4℃静置2小时，离心，弃去上清，得沉淀蛋白。沉淀蛋白取出用蒸馏水复溶，将pH调节至7.0，冷冻干燥后的得地龙粗蛋白。
(2)多肽的制备
将粗蛋白用水溶解配制成1.25％(w/v)的蛋白溶液，碱性蛋白酶添加量为250U/mL，在pH为8.5、温度为55℃的条件下酶解3小时，随后沸水浴灭酶活，终止酶解反应；将pH调至3，加入胃蛋白酶(2000U/mL)，反应温度为37℃，酶解2小时，将pH调至7，加入胰酶(100U/mL)，反应温度为37℃，酶解2 小时，沸水浴终止酶解反应。酶解产物通过3KDa的滤膜，收集小于3KDa的组分得到酶解多肽。
实施例4
(1)地龙蛋白的制备
干地龙粉碎过筛，地龙粉以1：30(w/v)的比例溶解于蒸馏水中，制成地龙粉溶液，用1mol/L的NaOH溶液将混合溶液体系pH值调至11.5，超声细胞粉碎20分钟，磁力搅拌提取2小时后，离心后，取上清液。用1mol/L的HCl 将上清液pH值调至5，于4℃静置2小时，离心，弃去上清，得沉淀蛋白。沉淀蛋白取出用蒸馏水复溶，将pH调节至7.0，冷冻干燥后的得地龙粗蛋白。
(2)多肽的制备
将粗蛋白用水溶解配制成1.5％(w/v)的蛋白溶液，碱性蛋白酶添加量为300 U/mL，在pH为9.0、温度为55℃的条件下酶解3小时，随后沸水浴灭酶活，终止酶解反应；将pH调至3，加入胃蛋白酶(2000U/mL)，反应温度为37℃，酶解2小时，将pH调至7，加入胰酶(100U/mL)，反应温度为37℃，酶解2 小时，沸水浴终止酶解反应。酶解产物通过3KDa的滤膜，收集小于3KDa的组分得到酶解多肽。
实施例5抗氧化活性肽段的筛选
本实施例提供了采用LC-MS/MS法识别抗氧化肽：
将上述实施例3制备的地龙多肽组分溶解在溶解液(0.1％甲酸、2％乙腈) 中，充分震荡均匀，4℃下13200r/min离心20分钟，取上清，进行质谱鉴定。具体参数如下：一级质谱参数，分辨率：70000、AGC：目标3e6、最大喷射时间：40ms、扫描范围：350～1800m/z；二级质谱参数，分辨率：17500、AGC 目标：1e5、最大喷射时间：60ms、TopN：20、NCE/stepped NCE：27。结果表明，一共鉴定出10823条肽，通过PeptideRank(http://bioware.ucd.ie)计算肽具有生物活性的概率，并在BIOPEP数据库(http://www.uwm.edu.p1/biochemia/) 预测肽的抗氧化活性片段和生物活性，鉴定到5个具有潜在抗氧化活性的肽段： ATSGFFVY、HCFVLY、HLASGWY、HRYSDF、HYANMY。
ATSGFFVY、HCFVLY、HLASGWY、HRYSDF、HYANMY的抗氧化活性验证：
对上述五个肽段人工合成(上海吉尔生物)，测定各肽段DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和ORAC值，样品测定浓度分别为1mg/mL、 0.5mg/mL和15.625μg/mL，结果见表一。
表一五个抗氧化肽的抗氧化活性
结果表明，HCFVLY具有很好的DPPH自由基能力，ATSGFFVY、HCFVLY、 HLASGWY、HRYSDF、HYANMY均具有良好的ABTS自由基清除能力和氧自由基清除能力，可用于制备食源性抗氧化剂、抗氧化护肤品或者保健品等。
表二为采用不同蛋白酶对地龙蛋白的酶解情况。
注：AH、NH、BH、PrH及PaH分别对应地龙蛋白的碱性、中性、菠萝、复合及木瓜蛋白酶酶解物，GHEWP为碱性蛋白酶酶解地龙蛋白的消化产物。
应当理解，以上借助优化实施例对本发明的技术方案进行的详细说明是示意性的而非限制性的，不能认定本发明的具体实施方式仅限于此，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，对各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，都应当视为属于本发明提交的权利要求书确定的专利保护范围。
Claims (10)
1.一种地龙中抗氧化活性多肽的制备方法，以抗氧化活性指标作为所述抗氧化活性多肽的评价指标，其特征在于，包括如下步骤：
(1)取干燥的地龙，粉碎过筛；地龙粉加水溶解，调节溶液pH值为9-12，超声粉碎，磁力搅拌提取，离心，取上清液；将上清液pH值调至3-6，静置后离心，弃去上清，干燥，得地龙蛋白；
(2)将步骤(1)所得地龙蛋白用蒸馏水配制成蛋白溶液，加入碱性蛋白酶，控制pH值在7-9，酶解，灭酶活；将pH调至1.5-5，加入胃蛋白酶，酶解，将pH调至7-9,加入胰酶，酶解，煮沸，结束反应，酶解上清液过截留量3kD的超滤膜，收集分子量<3kD的酶解多肽组分。
2.根据权利要求1所述地龙中抗氧化活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述超声粉碎的时间为：10-30min；所述磁力搅拌提取的时间为1-3h。
3.根据权利要求1所述地龙中抗氧化活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，碱性蛋白酶的酶解温度为45-55℃，酶解时间为3小时。
4.根据权利要求1所述地龙中抗氧化活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，胃蛋白酶酶解温度为：37℃；酶解时间为1-3小时。
5.根据权利要求1所述地龙中抗氧化活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，胰酶的酶解温度为：37℃；酶解时间为1-3小时。
6.根据权利要求1所述地龙中抗氧化活性多肽的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中所述调节pH值为9-12，控制pH值在7-8.5，将pH调至7-9具体为：用0.5-1mol/L的NaOH溶液将pH调节至所需pH值；所述上清液pH值调至3-5，将pH调至1.5-5具体为：用0.5-1mol/L的HCl溶液将pH调节至所需pH值。
7.根据权利要求1所述地龙中抗氧化活性多肽的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述碱性蛋白酶添加量为250U/mL；胃蛋白酶添加量为2000U/mL；胰酶添加量为100U/mL。
8.一种根据权利要求1-4所述的制备方法得到的地龙中抗氧化活性多肽。
9.根据权利要求8所述地龙中抗氧化活性多肽，其特征在于，所述抗氧化活性多肽序列为ATSGFFVY、HCFVLY、HLASGWY、HRYSDF或HYANMY。
10.权利要求8所述地龙中抗氧化活性多肽的应用，其特征在于，抗氧化活性多肽通过清除ABTS自由基和氧自由基发挥抗氧化作用，用于制备抗氧化膳食补充剂或者具有抗氧化功效的功能性食品，所述功能性食品为片剂、口服液或胶囊。
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